Expressão imunoistoquímica da proteína S-100 na discondroplasia da tíbia

Capela e Silva, F.; Lamy, E.; Reis, J.C.; Potes, J.C.; Pereira, A.; Cabrita, A.S.

doi:10.1590/S0102-09352010000200035

COMUNICAÇÃO COMMUNICATION

F. Capela e Silva^{I, II}; E. Lamy^II; J.C. Reis^III; J.C. Potes^{II, III}; A. Pereira^{II, IV}; A.S. Cabrita^V

^IDepartamento de Biologia, Universidade de Évora, Portugal

^IIInstituto de Ciências Agrárias e Ambientais Mediterrânicas (ICAAM), Universidade de Évora, Portugal

^IIIDepartamento de Medicina Veterinária, Universidade de Évora, Portugal

^IVDepartamento de Zootecnia, Universidade de Évora, Portugal

^VInstituto de Patologia Experimental, Universidade de Coimbra, Portugal

Palavras-chave: frango de corte, tíbia, discondroplasia, proteína S-100, imunoistoquímica

ABSTRACT

It was compared, by immunohistochemistry, the expression of S-100 protein from normal and tibial dyschondroplasia (TD) growth plates. The results suggest that S-100 may be involved in growth plate homeostasis. The expression of S-100 in dyschondroplastic chondrocytes may be due to a low level of calcium in the lesion and/or compression of chondrocytes by the accumulated matrix. One further possibility is the association between S-100 and the regulation of matrix metalloproteinases (MMPs) and their endogenous inhibitors (TIMPs). Further studies will be necessary to provide insight into involvement of S-100 in tibial dyschondroplasia development and the precise nature of the pathology.

Keywords: broiler, tibia, dyschondroplasia, S-100 protein, immunohistochemistry

A discondroplasia da tíbia é uma patologia das placas de crescimento epifisárias dos ossos longos das estirpes de rápido crescimento de espécies avícolas, caracterizada por anomalias na diferenciação dos condrócitos, traduzindo-se na acumulação de uma massa cartilagínea branca, opaca, não calcificada e avascular (Orth e Cook, 1994). Para além do aparecimento espontâneo, com forte base genética, vários fatores afetam a incidência e a gravidade das lesões discondroplásicas (Orth e Cook, 1994). Os trabalhos realizados têm caracterizado a cartilagem discondroplásica relativamente à expressão de vários genes e seus produtos (Farquharson e Jefferies, 2000; Praul et al., 2000; Leach e Monsonego-Ornan, 2007). Sua etiologia não está ainda devidamente esclarecida, sendo de supor uma origem multifatorial (Orth e Cook, 1994).

As proteínas S-100 constituem uma família de proteínas citoplasmáticas de baixo peso molecular, que se podem ligar ao Ca²⁺, ao Zn²⁺ e ao Cu²⁺ e que estão envolvidas em muitos processos biológicos importantes (Donato, 2003). Inicialmente foram descritas como sendo específicas do sistema nervoso, tendo sido, no entanto, identificadas noutros tecidos, incluindo a cartilagem e o osso (Weiss e Dorfman, 1986; Dascalu et al., 1996; Balmain et al., 2003). O presente trabalho teve como objetivo principal avaliar a expressão imunoistoquímica da proteína S-100 na discondroplasia da tíbia.

Frangos de corte, da linhagem Cobb, foram criados em sistema padronizado, desde o dia do nascimento até aos 21 dias de idade (dieta e água foram disponibilizadas ad libitum), cumprindo as normas de bem-estar animal (FELASA, <http://www.felasa.eu>). Foram estabelecidos dois grupos com 20 animais cada, sendo um grupo-controle e um grupo experimental. Para obtenção de animais com lesões discondroplásicas, incorporou-se à dieta o ditiocarbamato Tirame (CAS nº 137-26-8, SIGMA, nº T5638), na concentração de 35mg/kg. Ao fim de 21 dias, e após anestesia, os animais foram sacrificados por deslocamento cervical, seguido por remoção da tíbia esquerda e seccionamento longitudinal de sua epífise proximal. Os fragmentos obtidos foram imediatamente fixados em formaldeído neutro a 10%, tamponado, durante 24 horas, após o que se procedeu à sua desmineralização em EDTA a 5%, pH 7,4, durante 7-10 dias.

Após a desmineralização, os fragmentos foram processados em um sistema automático, incluídos em parafina e cortados em micrótomo em secções com 5μm de espessura. As secções foram estendidas em lâminas de vidro de 75 x 25mm, tratadas com polilisina. Para a imunoistoquímica, utilizou-se o método LAB-SA (UltraVision Detection System Kit, NeoMarkers, USA, ref. TP-015-HD), de acordo com as indicações do fabricante, com anticorpo primário comercial (NeoMarkers, ref. RB-044, diluição 1:100, e incubação overnight, a 4ºC). Como controle negativo, usaram-se secções sem o anticorpo primário. As preparações definitivas foram observadas em microscópio (Nikon Eclipse 600), com a ampliação de 100x, em secções correspondendo a 4-5 animais/grupo e uma secção/animal, sendo as imagens obtidas por meio de câmara digital Nikon DN100.

Foram observados condrócitos positivos na zona de hipertrofia, nas placas de crescimento normais e discondroplásicas (Fig. 1 e Tab. 1). Nestas últimas, foi evidente a expressão citoplasmática da proteína S-100 no interior das lesões, embora algumas células proliferativas tenham exibido expressão nuclear. Alguns condrócitos na fase final de hipertrofia, junto aos canais vasculares e aos locais de mineralização, mostraram, igualmente, imunomarcação citoplasmática intensa. Evidenciou-se também imunomarcação positiva de osteoblastos, osteoclastos, osteócitos e de inúmeras células da medula óssea. Não foi observada imunomarcação nas secções de controle negativo.

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Os resultados obtidos estão de acordo com os de outros autores, uma vez que foram observados condrócitos positivos fundamentalmente na zona de hipertrofia e junto aos canais vasculares, nas placas de crescimento normais (Weiss e Dorfman, 1986), e nas placas de crescimento discondroplásicas, embora algumas células proliferativas tenham exibido expressão nuclear. Nas placas de crescimento discondroplásicas, foram observados condrócitos hipertróficos positivos no interior das lesões, o que pode estar associado à reparação dos tecidos adjacentes (Leonardi et al., 2000), ou pode tratar-se de uma resposta à situação de inflamação crônica derivada do estresse bioquímico e mecânico provocado pela acumulação de matriz (Dascalu et al., 1996).

Os dados deste trabalho sugerem ainda que as proteínas da família S-100 podem estar envolvidas na proliferação, na hipertrofia e na apoptose dos condrócitos, como evidenciado por outros autores para outros tecidos (Donato, 2003), na estimulação da angiogênese da placa de crescimento (Ambartsumian et al., 2001) e na participação da homeostase do cálcio (Barger e Van Eldik, 1992). O conhecimento da participação das proteínas S-100 na mineralização da cartilagem (Weiss e Dorfman, 1986; Balmain et al., 2003) e do seu envolvimento na regulação da remodelação da matriz extracelular, influenciando a expressão das metaloproteinases da matriz (MMPs) e dos seus inibidores tecidulares (TIMPs) (Elenjord et al., 2008), torna interessante um estudo mais aprofundado sobre a eventual ligação dessas proteínas no desenvolvimento de lesões discondroplásicas.

A expressão da proteína S-100 nos osteoblastos, nos osteoclastos e nos osteócitos, bem como em inúmeras células da medula óssea, similar em ambos os tipos de placas de crescimento, provavelmente, estaria relacionada com a participação da S-100 na proliferação, na diferenciação - processos essenciais no normal decurso da ossificação endocondral - e na sobrevivência desses tipos celulares (Donato, 2003).

Recebido em 28 de outubro de 2009

Aceito em 26 de fevereiro de 2010

E-mail: fcs@uevora.pt

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