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Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia

Print version ISSN 0102-0935

Arq. Bras. Med. Vet. Zootec. vol.62 no.5 Belo Horizonte Oct. 2010

http://dx.doi.org/10.1590/S0102-09352010000500006 

MEDICINA VETERINÁRIA

 

Detecção dos genes da toxina citoletal distensiva em estirpes de Campylobacter jejuni isoladas de carcaças de frangos

 

Detection of cytolethal distending toxin genes in strains of Campylobacter jejuni isolated from broiler carcasses

 

 

A.F. CarvalhoI, IV, V; D.M. SilvaII, IV; S.S. AzevedoIII; R.M. PiattiII; M.E. GenovezII; E. ScarcelliII, *

IAluna de pós-graduação - Instituto Biológico - São Paulo, SP
IIInstituto Biológico. Av. Conselheiro Rodrigues Alves, 1252. 04014-002 - São Paulo, SP
IIIUniversidade Federal de Campina Grande - Patos, PB
IVBolsista da FAPESP (TT3)
VBolsista da FUNDAG

 

 


RESUMO

Foram analisadas 80 amostras de sobrecoxas de frangos de corte resfriados provenientes de feiras livres e hipermercados do município de São Paulo, SP. Treze estirpes de Campylobacter spp. foram isoladas em 10 (12,5%) sobrecoxas, sendo cinco amostras originárias de feiras livres e cinco de hipermercados. Onze estirpes foram identificadas como Campylobacter jejuni e duas como Campylobacter coli. As 11 estirpes foram confirmadas como C. jejuni pela PCR do gene da hipuricase (hip), e destas, quatro (36,4%) apresentaram os três genes (cdtA, cdtB e cdtC) codificantes da toxina citoletal distensiva pela multiplex-PCR, sendo três estirpes provenientes de hipermercados e uma de feira livre. Observou-se a presença de estirpes virulentas de C. jejuni, portadoras do complexo de genes cdt, nas amostras de frango resfriado, não só na linha de abate, mas até o ponto final da cadeia de distribuição, nos dois principais centros de venda a varejo.

Palavras-chave: frango de corte, Campylobacter jejuni, toxina citoletal distensiva, PCR


ABSTRACT

Eighty samples of refrigerated broiler thighs purchased in street markets and supermarkets in the city of São Paulo, SP, were analyzed. Thirteen Campylobacter spp. strains were isolated in 10 (12.5%) thighs, five of them from street market samples and other five from supermarkets. Eleven strains were identified as Campylobacter jejuni and two of them as Campylobacter coli. The 11 strains were confirmed to be C. jejuni using PCR for hippuricase (hip) gene. From these, multiplex-PCR showed that four (36.4%) strains presented the three genes (cdtA, cdtB, and cdtC) encoding cytolethal distending toxin: three strains from supermarket and one from street market samples. These results are important, because they demonstrate the presence of virulent C. jejuni strains in refrigerated broiler thigh samples, not only in the slaughterhouse but in the final point of the distribution chain, at the two most important food retail commercer.

Keywords: broiler, Campylobacter jejuni, cytolethal distending toxin, PCR


 

 

INTRODUÇÃO

A campilobacteriose é uma zoonose de distribuição mundial, e seu principal representante, Campylobacter jejuni, é considerado um microrganismo extremamente ubiquitário, que se encontra tanto disperso no ambiente quanto no trato gastrintestinal de animais domésticos e selvagens (Scarcelli et al., 2005b). Atribui-se como via de transmissão para o ser humano a ingestão de carnes de aves cruas ou mal cozidas, bem como de leite não pasteurizado, o consumo de água e alimentos de origem animal e vegetal contaminados e o contato direto com animais portadores (Kumar et al., 2001; Scarcelli et al., 2005a). A contaminação de carcaças de frangos em abatedouros é considerada o principal fator de risco para infecções humanas (Rozynek et al., 2005).

Campylobacter jejuni destaca-se nos países desenvolvidos como o principal agente etiológico de diarreia humana, especialmente em crianças (Carvalho et al., 2001). Nos Estados Unidos, estimam-se anualmente mais de dois milhões e quinhentos mil casos de enterite humana por C. jejuni, índice que já superou os casos de salmonelose e shigelose (Fitzgerald et al., 2001). Nos últimos anos, também tem sido demonstrada associação entre a infecção por C. jejuni e duas doenças neurológicas emergentes: a síndrome de Guillain-Barré (GBS) e a síndrome de Muller - Fisher (MFS), uma rara variante da GBS (Endtz et al., 2000).

Nos Estados Unidos, o isolamento de C. jejuni e C. coli de carcaças de frango varia de 30 a 100% de positividade (Stern et al., 1985). Whyte et al. (2003) isolaram 49,9% de Campylobacter spp. em 444 frangos de três diferentes cidades da Irlanda. Rozynek et al. (2005) pesquisaram Campylobacter spp. na Polônia e encontraram 53/92 (57,6%) estirpes de C. jejuni e 39/92 (42,4%) de C. coli isoladas de carcaças de frango. Mena et al. (2008) identificaram 99 (60,3%) estirpes de Campylobacter spp. em 164 amostras de frangos obtidas a partir de estabelecimentos varejistas de Portugal.

No Brasil, estudos demonstraram diferentes percentuais de isolamentos de C. jejuni e C. coli a partir de fezes de frangos, que oscilaram de 22 a 25,8% (Castro et al., 1997; Cortez et al., 2006), destacando-se o processo de evisceração como ponto crítico da linha de abate para a contaminação de carcaças (Castro et al., 1997). Com relação à análise de carcaças e miúdos de frangos resfriados prontos para o consumo, Machado et al. (1994) relataram a frequência de 15 (50%) estirpes de Campylobacter spp. em Santa Catarina, Castro et al. (1997) isolaram 33 (23,6%) e Cortez et al. (2006) 14 (4,9%) estirpes de C. jejuni de diferentes abatedouros do estado de São Paulo.

Talvez a forma mais importante para o alimento cárneo tornar-se fonte de transmissão da campilobacteriose intestinal seja a transferência passiva do agente para outros alimentos durante o descongelamento e o processamento em locais comuns (Skirrow, 1991). Neste aspecto, a carcaça de frango assume capital importância, pois a água de degelo em contato com alimentos ingeridos in natura poderia explicar a origem dos frequentes surtos (Scarcelli et al., 1998). Outro dado relevante que poderia explicar a grande frequência dos surtos de campilobacteriose é o fato de a dose infectante de Campylobacter ser baixa. A ingestão de apenas 500 microrganismos, facilmente presentes em uma gota de água de degelo de frango cru, pode resultar em enterite no homem (Outbreak ..., 1998).

Atualmente, 11 fatores de virulência têm sido relacionados à patogênese de C. jejuni em infecções humanas e animais (Datta et al., 2003), dentre elas a toxina citoletal distensiva (CDT), que afeta as camadas das células epiteliais, causando progressiva distensão e morte em várias linhagens celulares (CHO, Vero, HeLa e HEp-2) pelo acúmulo intracelular dos níveis de cAMP (Martinez et al., 2006). A atividade da toxina CDT é codificada pelos genes cdt, que, no caso de C. jejuni, consistem em três genes adjacentes denominados cdtA, cdtB e cdtC (Martinez et al., 2006), sendo que a presença dos três genes é requerida para a plena atividade da toxina (Asakura et al., 2007). Mutações nos genes cdt que possam causar perda da função em alguma das três subunidades impedem a célula bacteriana de induzir a citotoxicidade (Smith e Bayles, 2006).

No Brasil, são escassos os estudos sobre a ecologia, transmissibilidade e patogenicidade de C. jejuni isolados de alimentos. Para tanto, os objetivos do presente estudo foram isolar e identificar estirpes de Campylobacter spp., a partir de frangos de corte resfriados colhidos em feiras livres e hipermercados; detectar, pela técnica da multiplex-PCR, a presença do complexo de genes cdt, responsáveis pela expressão do fator de virulência da produção da toxina citoletal distensiva (CDT) nas estirpes de C. jejuni; e verificar a inter-relação entre estirpes de Campylobacter spp. isoladas de feiras livres e hipermercados.

 

MATERIAL E MÉTODOS

Foram analisadas 80 amostras de sobrecoxas de frango de corte resfriados, originárias de diferentes pontos comerciais - feiras livres A e B e hipermercados A e B - do município de São Paulo, SP, no período de abril a outubro de 2008, sendo colhidas 20 amostras de cada ponto de venda. Na ocasião de cada colheita, as amostras foram acondicionadas em sacos plásticos estéreis descartáveis e transportadas ao laboratório em caixa isotérmica, com gelo reciclável, à temperatura de até 8ºC.

As amostras de sobrecoxa foram submetidas ao procedimento bacteriológico (no mesmo dia da colheita), para isolamento e identificação bioquímica de Campylobacter spp. e posterior seleção de estirpes de C. jejuni, segundo Castro et al. (1997) e Bacteriological Analytical Manual (Hunt et al., 2001), com algumas modificações: para cada 25g de sobrecoxa (composto por músculo e pele), foram adicionados 100mL de caldo infusão cérebro coração (BHI; Difco) dentro de bolsas plásticas estéreis (Nasco), e homogeneizadas por até quatro minutos em homogeneizador mecânico (Stomacher 80-Lab System). Visando à eliminação de grandes partículas em suspensão, que pudessem interferir no futuro processo de filtração (Modolo, 2000), o homogenato obtido pós-homogeneização foi submetido a duas centrifugações sucessivas, a segunda com o objetivo de obter a concentração do agente: 1º) 50mL do homogenato centrifugados a 3.000 x g por 15 minutos; 2º) 3mL do sobrenadante centrifugados a 14.000 x g por 15 minutos.

Após a segunda centrifugação, 2mL do sobrenadante mais o pélete foram filtrados em membrana de éster de celulose (Millipore) com poro de 0,65μm, utilizando-se suporte plástico (swinex; Millipore) e seringas estéreis, sendo que 100μL do filtrado foram semeados em meio de ágar brucella (Difco) acrescido de 10% de sangue desfibrinado de carneiro (ABS) e 100μL (sem filtração) foram semeados em meio seletivo (ABS-ATB), constituído por ágar brucella sangue e suplementado com mistura antibiótica (Dufty, 1967), composta por polimixina B (1.000UI/L), cicloheximida (20mg/L), novobiocina (5mg/L) e bacitracina (15.000UI/L). As placas foram incubadas em estufa por 48-72 horas, a 37ºC, sob atmosfera de microaerofilia (5% de CO2).

Após o período de incubação, as colônias suspeitas foram identificadas por métodos presuntivos: coloração de Gram, observação de mobilidade em microscópio de campo escuro e teste de oxidase; e, uma vez caracterizado o gênero Campylobacter, foram determinadas as espécies e as subespécies pelas provas bioquímicas: catalase, formação de H2S em TSI (meio de tríplice açúcar ferro; Difco), hidrólise do hipurato, tolerância às temperaturas de 25ºC e 42ºC, susceptibilidade ao ácido nalidíxico (30μg) e à cefalotina (30μg) (Hunt et al., 2001).

Como estirpe-controle, foi empregada a cepa padrão de C. jejuni ATCC 33291.

Para confirmação da espécie C. jejuni, as estirpes previamente caracterizadas pelos testes fenotípicos foram submetidas à PCR para detecção do gene hip, codificante da enzima hipuricase, específica para a espécie C. jejuni. As suspensões das estirpes de Campylobacter spp. isoladas tiveram seu DNA extraído pelo kit comercial Ilustra Bacterial Genomic PREP Mini Spin (GE Healthcare), segundo especificações do fabricante. O DNA extraído foi submetido à amplificação pela PCR utilizando-se oligonucleotídeos iniciadores da região conservada do gene hip, que corresponde a um fragmento de 735 pares de bases (pb), segundo Linton et al. (1997): HIP400F 5'-GAA GAG GGT TTG GGT GGT G-3' e HIP1134R 5'-AGC TAG CTT CGC ATA ATA ACT TG-3'.

Para o volume final de reação de 50μL, foi empregado tampão PCR 10 X (500mM de KCl, 15mM de MgCl2, 100mM de TRIS-HCl, pH 9,0); 2,5mM de MgCl2; 200mM de dNTPs (200mM de cada nucleotídeo dCTP, dATP, dGTP, dTTP); 40pmol de cada primer (HIP400F e HIP1134R); 2,5U de Taq DNA polimerase (Invitrogen) e 10μL do DNA extraído. No termociclador PT 200 (MJ Research), o ciclo de amplificação foi precedido de desnaturação inicial a 94ºC por 5min, seguidos de 25 ciclos de desnaturação a 94ºC por 1min, hibridização a 66ºC por 1min, extensão a 72ºC por 1min, e extensão final a 72ºC por 10min. Como controle positivo foi utilizada a estirpe padrão de C. jejuni ATCC 33291

A análise do produto amplificado do gene hip foi realizada por eletroforese em gel de agarose a 2,0%. O gel foi corado por brometo de etídeo (0,5μg/mL) e posteriormente fotografado sob luz ultravioleta (300-320nm) pelo sistema de fotodocumentação, Câmera Kodak Digital DC/120 Zoom, e analisado com o software 1D Image Analysis (Kodak Digital Science).

A partir do mesmo DNA das estirpes de C. jejuni confirmadas pela PCR, foi realizada a técnica de multiplex-PCR com os primers (Tab. 1) descritos por Martinez et al. (2006), para detecção simultânea dos genes cdtA, cdtB e cdtC que amplificam fragmentos de 422pb, 531pb e 339pb, respectivamente. Para o volume final de reação de 50μL, foi empregado tampão PCR 10 X (500mM de KCl, 15mM de MgCl2, 100mM de TRIS-HCl, pH 9,0); 3,0mM de MgCl2; 200mM de dNTPs (200mM de cada nucleotídeo dCTP, dATP, dGTP, dTTP); 20 pmol de cada primer (cdtAF, cdtAR, cdtBF, cdtBR, cdtCF e cdtCR); 2,0U de Taq DNA polimerase (Invitrogen) e 10μL do DNA extraído. No termociclador PT 200 (MJ Research), o ciclo de amplificação foi precedido de desnaturação inicial a 94ºC por 5min, seguidos de 30 ciclos de desnaturação a 94ºC por 1min, hibridização a 57ºC por 1min, extensão a 72ºC por 1min, e extensão final a 72ºC por 5min.

 

 

A análise do produto amplificado seguiu os mesmos procedimentos empregados para o gene hip.

Para verificar a inter-relação entre estirpes de Campylobacter spp. isoladas de feiras livres e hipermercados, utilizou-se o teste do qui-quadrado, considerando-se o nível de significância P<0,05, segundo Callegari-Jacques (2003). Os cálculos estatísticos foram realizados pelo programa EpiInfo versão 6.04 (Dean, 1994).

 

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Foram isoladas 13 estirpes de Campylobacter spp. em 10 (12,5%) sobrecoxas de frangos resfriados, sendo cinco amostras de frango originárias de feiras livres e cinco de hipermercados. Onze estirpes foram identificadas como C. jejuni e duas como C. coli, verificando-se, portanto, que em três amostras foi possível isolar mais de uma espécie ou estirpe de Campylobacter spp. (Tab. 2). As estirpes provenientes da mesma amostra foram diferenciadas pelas características bioquímicas e/ou morfológicas das colônias isoladas.

 

 

As 11 estirpes de C. jejuni foram confirmadas pela PCR como portadoras do gene da hipuricase (hip). O uso exclusivo de testes bioquímicos para identificação da espécie de Campylobacter é limitado pela ocorrência de estirpes com reações atípicas. Pequenas alterações na quantidade do inóculo, excessivos subcultivos, deleções no gene hip ou até mesmo a presença deste gene, mas ausência de sua transcrição, podem interferir na correta identificação da espécie (Linton et al., 1997; Kolackova e Karpiskova, 2005).

O percentual observado no presente estudo para Campylobacter spp. (12,5%) foi mais alto que o verificado por Scarcelli et al. (2005a), que analisaram frangos congelados e obtiveram cinco (5/74; 6,8%) amostras positivas pela PCR para C. jejuni e nenhuma positiva pelo exame bacteriológico, indicando a susceptibilidade do microrganismo às condições adversas como congelamento, aditivos, excessiva contaminação, alta tensão de oxigênio ou ressecamento (Scarcelli et al., 2005a).

Segundo Franchin et al. (2005), a ocorrência de patógenos - Campylobacter spp. - de origem alimentar em carcaças e produtos de frangos importados de países da União Europeia e vendidos em supermercados foi: 21,9% de 247 amostras da Bélgica, 30,2% de 427 amostras da França, 15,4% de 13 amostras da Itália e 54,5% de 44 amostras do Reino Unido.

Hussain et al. (2007) isolaram Campylobacter spp. em 236 (236/492; 48%) frangos coletados em pontos do comércio varejista do Paquistão, e Prencipe et al. (2007), em 178 (178/392; 45,4%) carcaças de frango de supermercados e açougues da Itália. Esses últimos isolaram mais de uma espécie de Campylobacter em 23,1% das amostras positivas.

A contaminação da carne de frango pode ocorrer durante o abate, sendo mais comum no escaldamento e na evisceração, quando há a possibilidade da transmissão de microrganismos dos intestinos para a superfície das carcaças (Castro et al., 1997; Cortez et al., 2006; Prencipe et al., 2007). Mead et al. (1995) relataram que o aumento nos níveis de cloro na água de processamento das aves, aliado à melhora das condições de higiene do abatedouro, promove significativa diminuição na contaminação das carcaças. Porém, Peyrat et al. (2008) demonstraram que algumas estirpes de Campylobacter spp. podem sobreviver à limpeza e desinfecção nos abatedouros de aves e podem contaminar as carcaças durante o processamento.

Com relação ao ponto de venda, não foi observada diferença significativa (χ2=0,11; P=0,735) quanto ao número de estirpes de Campylobacter spp., entre hipermercados (5/40; 12,5%) e feiras livres (5/40; 12,5%). Prencipe et al. (2007) também observaram que não há diferença quanto à frequência de contaminação por Campylobacter spp. em frangos provenientes de supermercados ou de açougues das regiões de Abruzzo e Molise, Itália.

Recentemente, tem aumentado o número de estudos que visam à detecção dos genes cdt em estirpes de C. jejuni de diferentes fontes, entretanto a prevalência desses genes nesta espécie, isolada de reservatórios e potenciais fontes de infecção, ainda não está plenamente investigada (Martinez et al., 2006), principalmente no Brasil. No presente estudo, quatro (4/11; 36,4%) estirpes de C. jejuni apresentaram os três genes (cdtA, cdtB e cdtC) codificantes da toxina citoletal distensiva (CDT) na multiplex-PCR, sendo três estirpes provenientes de frangos de hipermercados e uma de feira livre (Fig. 1).

Na Polônia, Rozynek et al. (2005) isolaram 53 estirpes de C. jejuni em carcaças de frangos de supermercados e abatedouros, sendo que 100% apresentaram os três genes cdt. Samosornsuk et al. (2007) isolaram, na Tailândia, 20 estirpes de C. jejuni provenientes de frangos, sendo que destas, 19 (95%) apresentavam o gene cdtA, 20 (100%) o gene cdtB e 19 (95%) o cdtC. Martinez et al. (2006), ao aplicarem a multiplex-PCR para pesquisa dos genes cdt em 100 estirpes de C. jejuni isolados de diferentes fontes e países, observaram os três genes, cdtA, cdtB e cdtC, em 98 (98%) das estirpes isoladas. Wardak e Szych (2006) isolaram, na Polônia, 102 estirpes de C. jejuni a partir de fezes diarreicas humanas e identificaram prevalência do gene cdtA em 100 (98%) das estirpes, cdtB em 98 (96%) e cdtC em 94 (92%), determinando que a alta prevalência do complexo de genes cdt indica que estes genes são importantes fatores de virulência desta bactéria. Semelhantemente, Van Deun et al. (2007) afirmaram que a produção da toxina CDT está associada a estirpes causadoras de enterites em humanos. Talukder et al. (2008) também identificaram C. jejuni de pacientes com diarreia em Bangladesh e detectaram os genes cdtA, cdtB e cdtC em 39/40 (97,5%) das estirpes.

No presente estudo, os percentuais de estirpes de C. jejuni portadoras do complexo cdt foram mais baixos que os relatados por outros autores em diferentes países, e a ocorrência de linhagens de estirpes de C. jejuni negativas na multiplex-PCR (63,6%) foi mais elevada que a de amostras positivas (36,4%). Segundo Martinez et al. (2006), essencialmente todas as estirpes de C. jejuni apresentam os genes cdt, e a maioria tem atividade da toxina. Porém, há exceções de isolamentos que sofrem mutação e não expressam a atividade do gene. Asakura et al. (2007) também observaram que alguns genes cdt não são identificados devido a mutações como deleção, inserção ou substituição de nucleotídeos, e sugerem que essas mutações podem afetar a atividade da toxina. Bang et al. (2003) relataram que a produção da toxina é baixa ou negativa quando há mutações em regiões do gene cdt, porém, segundo Park (2002), mesmo algumas estirpes sendo CDT negativas mutantes, ainda mantêm alguma atividade toxigênica.

Os resultados do presente estudo são dignos de atenção, pois demonstraram em frangos de corte a presença de estirpes virulentas de C. jejuni, portadoras do complexo de genes cdt, e que Campylobacter spp. continua viável nas amostras de frango resfriado, não só na linha de abate, mas até o ponto final da cadeia de distribuição, ou seja, nos dois principais centros de venda a varejo, que dão acesso direto à mesa do consumidor.

 

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Recebido em 3 de março de 2009
Aceito em 30 de agosto de 2010
Apoio financeiro: FAPESP

 

 

* Autor para correspondência (corresponding author): E-mail: pinheiro@biologico.sp.gov.br