Sensibilidade da PCR na amplificação do DNA bovino em diluição seriada e mistura de amostra macho e fêmea

Sensitivity of PCR to amplify sex-specific bovine DNA in diluted samples

PCR; DNA bovino; determinação sexual; sensibilidade

PCR; bovine DNA; sex determination; sensitivity

COMUNICAÇÃO

Sensibilidade da PCR na amplificação do DNA bovino em diluição seriada e mistura de amostra macho e fêmea

Sensitivity of PCR to amplify sex-specific bovine DNA in diluted samples

A.S. Cruz^{I, II}; D.C. Silva^I; E.O.A. Costa^I; D.M. Silva^I; D.A. Abreu^I; A.D. CruzI, ^*

^IN. P. Replicon, D. de Biologia, Pontifícia Universidade Católica de Goiás. Rua 235, nº 40 - S. Universitário 74605-010 - Goiânia, GO

^IIAluno de pós-graduação - Instituto de Ciências Biológicas 4 - Goiânia, GO

Palavras-chave: PCR, DNA bovino, determinação sexual, sensibilidade

ABSTRACT

A mixture of bovine DNA from a male and a female Jersey (Bos taurus taurus) bred in different proportions was used to determine the sensitivity of PCR to amplify and discriminate the bovine DNA samples. Samples were obtained from the peripheral blood of a bull and a heifer and DNA was isolated using a commercial kit for extraction and purification of nucleic acids. Two primers sets were designed to flank genomic regions: one autosomal and one Y-specific. DNA samples were diluted in water to a final concentration of 4x10^-14 ng. The results showed positive amplification of the samples diluted to a concentration of 4x10^-10ng and 4x10^-4ng for the autosomal and Y-specific regions, respectively. PCR was able to discriminate the male DNA in a mixture of 99:1 (DNA ♀: DNA ♂) heifer to bull ratio. Therefore, the PCR was successful in amplifying the bovine genome in samples containing low concentrations of DNA. Thus, PCR can be used as a sensitive and efficient tool to determine the sex of the fetus in pregnant cows, helping to promote correct and efficient animal management, sex selection, and breeding in commercial herds.

Keywords: PCR, bovine DNA, sex determination, sensitivity

A ultrassonografia e a PCR embrionária in vitro são métodos propostos com relativa eficiência para a determinação do sexo fetal em bovinos (Martinhago et al., 2006; Tellam et al., 2009). No entanto, ainda há restrições e limitações de ordem técnica, de custeio e de segurança animal, as quais provocam uma variação substancial nos resultados. Assim, as limitações mencionadas diminuem a eficiência das técnicas na prática rotineira, sobretudo no manejo de grandes rebanhos (Lopes da Costa et al., 2002). Em humanos, é possível amplificar regiões cromossômicas fetais a partir de DNA extraído do plasma materno por PCR (Lo et al., 1997). Lo et al. (1998) relataram que, para cada cópia de DNA fetal extraído do plasma materno, foram obtidas, a partir da quinta semana de gestação, até 99 cópias de DNA da mãe. Atualmente, a amplificação de regiões alossomo-específicas por PCR tem sido usada como uma estratégia de determinação precoce do sexo fetal, com resultados excelentes devido à alta sensibilidade e especificidade do método (Carvalhais et al., 2005).

O objetivo geral deste trabalho foi avaliar a capacidade de amplificação e discriminação de DNA bovino em diluição seriada por PCR. Adicionalmente, uma mistura do DNA genômico de macho e fêmea bovinos, em diferentes proporções, foi preparada com o objetivo de se estabelecer a sensibilidade da PCR para discriminar em uma amostra a presença de DNA masculino, simulando as condições presentes no plasma de vacas prenhes.

Dos animais doadores foram obtidas duas amostras de sangue periférico, sendo uma amostra de um touro e uma amostra de uma novilha, não prenha, da raça Jersey. O sangue total foi coletado por punção da veia caudal com seringas contendo heparina. As amostras foram processadas, separando-se o plasma do componente celular por centrifugação (1000rpm/ 10min). O DNA total foi isolado e purificado usando-se o kit comercial Illustra Blood GenomicPrep Mini Spin^® (GE Healthcare, UK), seguindo as instruções do fabricante. A quantificação do DNA foi realizada em um fluorômetro - GeneQuant Pro^® (Amersham Biosciences, EUA), conforme instrução do fabricante.

Após a extração e a quantificação do DNA bovino, as amostras foram diluídas para a concentração inicial de 40ng/µL de DNA, usadas como controle (AC) para amplificação por PCR. As ACs foram diluídas em série quatro vezes, partindo de um fator de diluição igual a 1000 (amostras 1 a 4). Subsequentemente, foram realizados dois passos de diluição com fator de diluição de 100 (amostras 5 e 6). Ao final da diluição seriada, foi obtida a proporção de uma parte do DNA extraído para 10¹⁶ partes de água mili-Q. De cada amostra foram utilizados 10µL da solução para a PCR. Portanto, a quantidade total de DNA inicial no sistema de amplificação por PCR foi de 400ng de DNA (Tab. 1).

Todo o procedimento foi realizado em triplicata. A PCR foi preparada para um volume final de 25µL. Para as amostras testadas, foram usados 10µL de solução aquosa contendo DNA bovino. As condições de PCR incluíram 0,150 pmoles de cada conjunto de primers, 5µL de tampão de PCR Gold STR^® (Promega Corporation, EUA), 50mM de cloreto de magnésio e 0,5µL de Taq DNA polimerase (5U/µL). O protocolo de termociclagem utilizado continha um passo inicial de desnaturação a 94°C por 5min, 40 ciclos a 94°C por 1min de desnaturação, anelamento a 58°C por 30seg e extensão a 72°C por 1min, e de extensão final de 7min a 72ºC.

O conjunto de primers descritos por Resende et al. (2008) foi usado para a amplificação do genoma bovino. Um conjunto (5' CCTCCCCTTGTTCAAACG CCCGGAATCATT 3' e 5'TGCTTGACTGCAGGGACCGAGAGGTTTGGG 3') foi desenhado para detectar uma sequência de 210pb localizada no cromossomo Y, e outro conjunto (5' AGGTCGCGAGATTGGTCGCTAGGTCATGCA 3' e 5' AAGACCTCGAGAGACCCTCTTCAACACGT 3') foi preparado para identificar uma sequência autossômica de 280pb localizada no cromossomo 1.

A amostra de DNA extraída do sangue do macho foi misturada à amostra de DNA extraída da fêmea. O sistema, assim preparado, permitiu a determinação da sensibilidade da PCR para amplificar a região Y-específica, simulando as condições do plasma de vacas prenhes de conceptos machos. As amostras foram ajustadas percentualmente, e suas proporções estão descritas na Tab. 2.

A amplificação das amostras diluídas de fêmea foi possível até uma diluição de 1x10¹⁴(^DNA/_ÁGUA ) e concentração estimada em 4x10^-12ng de DNA. Não foi observada a amplificação do fragmento autossômico de DNA esperado para a amostra da canaleta 6, demonstrado na Fig. 1I. A partir da diluição seriada das amostras, foi possível identificar a concentração mínima de DNA do macho que ainda pôde ser amplificado. A amplificação de 280pb indicava a região autossômica, e 210pb a região específica do cromossomo Y. Na Fig. 1II, mostra-se a amplificação por PCR da região autossômica, identificável nas amostras A, 1, 2, 3, 4 e 5, o que equivale a uma quantidade de DNA de 4x10² a 4x10^-12ng de DNA. A amplificação da região Y-específica foi possível até a amostra 2, correspondente a 4x10^-4ng de DNA. A amostra da canaleta 6 não amplificou. Um controle negativo de amplificação foi incluído nas reações.

A amplificação por PCR das amostras da diluição seriada em macho e fêmea comportou-se de forma semelhante. Assim, foi possível inferir que a sensibilidade de amplificação da região autossômica de bovinos correu até a concentração de 4x10^-12 de DNA por amostra, representada nas Fig. 1I e II. Como a mistura das amostras foi oriunda de material extraído de sangue total de macho e fêmea, as proporções de genomas Y-específico e autossômico estão distribuídas na Tab. 2.

A amplificação da região Y-específico foi possível até a quantidade de 4x10^-4ng/µL de DNA. A determinação cromossômica do sexo em bovinos é feita por um sistema simples, sendo os machos heterogaméticos. Isto justifica a observação de a variação na amplificação entre as regiões autossômicas e alossômicas ser 2:1, ou seja, existem duas partes de região autossômica para uma parte de Y-específico. Na amostra 5 da Fig. 1III, foi observada a amplificação apenas do DNA de ♀. Assim, este limite indica a sensibilidade da PCR para discriminar o DNA do ♂ e da ♀ (200:1) no presente estudo.

Nesse sentido, os resultados do presente ensaio demonstraram que a amplificação de amostras misturadas contendo regiões genômicas Y-específico de macho diluída em amostra de fêmea é possível. Os resultados foram seguramente positivos até a mistura de 200 partes autossômicas para 1 parte Y-específico, indicando, assim, a sensibilidade do método em bovinos. Os resultados do presente estudo sugerem que a amplificação da região Y-específico em amostra de sangue de vacas prenhes pode ser convenientemente usada como ferramenta de sexagem fetal. Encontram-se em fase de conclusão experimentos laboratoriais de sexagem fetal por PCR a partir do DNA extraído de vacas prenhes, em diferentes estágios gestacionais, pelo grupo deste estudo, com taxas de concordância de 100% (dados não publicados).

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem ao Departamento de Zootecnia da PUC Goiás, pela doação das amostras de sangue dos animais.

Recebido em 2 de abril de 2010

Aceito em 8 de junho de 2011

E-mail: [e-mail]

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*

Autor para correspondência (

corresponding author)

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  06 Set 2011
• Data do Fascículo
  Ago 2011

Histórico

• Aceito
  08 Jun 2011
• Recebido
  02 Abr 2010