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Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia

Print version ISSN 0102-0935

Arq. Bras. Med. Vet. Zootec. vol.65 no.4 Belo Horizonte Aug. 2013

https://doi.org/10.1590/S0102-09352013000400010 

MEDICINA VETERINÁRIA VETERINARY MEDICINE

 

Genes de enterotoxinas e perfil antimicrobiano de Escherichia coli isoladas de suínos hígidos no Distrito Federal

 

Enterotoxin genes and antimicrobial profile of Escherichia coli isolated from healthy swines in Distrito Federal, Brazil

 

 

V.O. Drummond; S. Perecmanis

Laboratório de Microbiologia Médica Veterinária - FAV - Universidade de Brasília (UnB) - Brasília, DF

 

 


RESUMO

Um total de 127 cepas de Escherichia coli foi isolado de suínos no Distrito Federal, testado para a presença de genes de enterotoxinas (STa, LT-I, LT-II, Stx1 e Stx2) e para resistência antimicrobiana. Das cepas isoladas, oito (6,3%) possuíam genes para enterotoxinas, sendo quatro (3,2%) positivas somente para LT-I, três (2,4%) somente para STa e uma (0,8%) positiva para STa e LT-I. Nenhuma das cepas isoladas apresentou genes para LT-II, Stx1 ou Stx2. Quanto ao perfil de resistência antimicrobiano, os antibióticos com maiores porcentagens de resistência foram lincomicina (100%), sulfonamidas (74,8%) e tetraciclina (70,1%), enquanto os maiores índices de sensibilidade foram observados na norfloxacina (82,7%), gentamicina (75,6%) e sulfametoxazol + trimetoprim (63%). Esses resultados demonstraram a presença de genes de enterotoxinas e altas taxas de resistência antimicrobiana em E. coli isoladas de suínos hígidos no DF.

Palavras-chave: Escherichia coli, suíno, enterotoxinas, resistência antimicrobiana


ABSTRACT

A total of 127 strains of Escherichia coli were isolated from swines in Distrito Federal, Brazil, tested for enterotoxin genes (STa, LT-I, LT-II, Stx1 and Stx2) and for antimicrobial resistance. Eight strains (6.3%) had enterotoxin genes, of which four (3.2%) were positive only for LT-I, three (2.4%) positive only for STa and one (0.8%) positive for STa and LT-I. There were no positive strains for LT-II, Stx1 or Stx2. When antimicrobial resistance was analyzed, the most resistant antibiotics were Lincomycin (100%), Sulfonamide (74.8%) and Tetracycline (70.1%), and the most sensitive antimicrobials were Norfloxacin (82.7%), Gentamicin (75.6%) and Sulfamethoxazole + Trimethoprim (63%). These results demonstrated the presence of enterotoxin genes and high numbers of antimicrobial resistance of E. coli strains isolated from healthy swines in Distrito Federal.

Keywords: Escherichia coli, swine, enterotoxins, antimicrobial resistance


 

 

INTRODUÇÃO

Doenças entéricas de etiologia bacteriana, principalmente por Escherichia coli, têm crescente importância na suinocultura, com grande impacto na indústria de produtos de origem suína em todo o mundo (Menin et al., 2008). Essa bactéria foi considerada, por muito tempo, um organismo não patogênico do trato entérico, mas estabeleceu-se nas últimas décadas como importante agente de doenças entéricas (Kaper et al., 2004), sendo que as E. coli enterotoxigênicas (ETEC) produtoras de toxinas termolábil (LT) e termoestável (ST) estão entre as principais causadoras de diarreia nos suínos (Zhang e Francis, 2010).

A resistência antimicrobiana é um problema sério tanto na medicina veterinária quanto na humana, e o estudo do perfil de resistência previne o uso de antibióticos de amplo espectro no tratamento dos animais, o que pode evitar o aparecimento de bactérias resistentes encontradas nos animais e no ambiente em que vivem (Macêdo et al., 2007).

No Brasil são escassos os estudos que analisam a frequência de fatores de virulência de E. coli isoladas de suínos hígidos (Martins et al., 2010; Carlos et al., 2011). Esses dados têm grande importância quando se pretende identificar e solucionar problemas sanitários e implantar, nas unidades de produção suína, programas de biosseguridade (Menin et al., 2008).

O objetivo deste estudo foi verificar a existência de genes codificadores de enterotoxinas termolábil-I (LT-I), termolábil-II (LT-II), termoestável a (STa) e verotoxinas 1 (Stx1) e 2 (Stx2) em E. coli isoladas de fezes de suínos hígidos em suinoculturas no Distrito Federal e avaliar o perfil fenotípico de resistência antibacteriana.

 

MATERIAL E MÉTODOS

Amostras fecais de 109 suínos de raças distintas, de ambos os sexos e com idades variando de 21 dias a um ano, foram obtidas com swab diretamente da ampola retal, e processadas no Laboratório de Microbiologia Médica Veterinária da Universidade de Brasília (UnB). Os animais foram escolhidos aleatoriamente nas propriedades criadoras, em seis diferentes Regiões Administrativas do Distrito Federal (Ceilândia, Gama, Paranoá, Planaltina, Recanto das Emas e São Sebastião).

As colônias de E. coli foram isoladas em ágar MacConkey (MERCK, Jacarepaguá, RJ), sendo que algumas amostras apresentavam dois tipos de colônia (mucoide e não mucoide), o que resultou em 127 cepas estudadas. Foram também cultivadas em caldo BHI (MERCK, Jacarepaguá, RJ) para extração de DNA, segundo protocolo citado por Blanco et al. (1997).

As reações de PCR foram realizadas em volume final de 25μL, contendo 5μL do DNA extraído; 2,5μL de solução tampão 10x (PHONEUTRIA, Belo Horizonte, MG); 0,75μL de MgCl2 50mM (PHONEUTRIA, Belo Horizonte, MG); 1,25μL de dNTP 10mM (INVITROGEN, São Paulo, SP); 0,5μL de Taq DNA polimerase 5U/μL (PHONEUTRIA, Belo Horizonte, MG) e 0,5μL de cada primer (forward e reverse) específico para enterotoxina (10pmol/μL). A sequência de nucleotídeos, o tamanho dos amplicons e a temperatura de anelamento (T.A.) estão descritos na Tab. 1.

As colônias foram inoculadas em caldo e ágar Müeller-Hinton (MERCK, Jacarepaguá, RJ) ‒ para realização do antibiograma segundo o método de Kirby-Bauer modificado ‒ e testadas para antibióticos comumente utilizados na suinocultura (Menin et al., 2008; Silva et al., 2008; Costa et al., 2006): amicacina (AMI), ampicilina (AMP), cefalexina (CFE), cloranfenicol (CLO), doxiciclina (DOX), enrofloxacina (ENO), estreptomicina (EST), gentamicina (GEN), lincomicina (LIN), neomicina (NEO), norfloxacina (NOR), sulfametoxazol + trimetoprim (SUT), sulfonamidas (SUL) e tetraciclina (TET).

Este trabalho foi avaliado pelo Comitê de Ética no Uso Animal (Ceua) da Universidade de Brasília, tendo sido aprovado (UnBDoc 59523/2009).

 

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Do total de 127 cepas, oito (6,3%) possuíam genes para enterotoxinas, sendo que três foram positivas somente para STa (2,4%), quatro somente para LT-I (3,2%), e uma possuía genes para essas duas toxinas (Fig. 1). Nenhuma cepa foi positiva para as demais toxinas testadas (LT-II, Stx1 e Stx2).

 

 

Os suínos não são considerados a principal fonte de E. coli produtoras de toxinas de Shiga (STEC) pelo fato de terem uma prevalência normalmente muito baixa, enquanto as E. coli produtoras de LT e ST normalmente são isoladas de suínos com diarreia pós-desmame (Martins et al., 2010). Genes codificadores de toxinas são comumente isolados em casos de suínos com diarreia (Menin et al., 2008), mas a identificação de genes de toxinas em suínos hígidos não é tão frequente (Kaper et al., 2004).

Schierack et al. (2006), em trabalho com suínos hígidos, encontraram 8,5% de cepas contendo apenas gene para STa e 3,9% somente para LT-I, valores próximos aos encontrados neste estudo. Valores semelhantes também foram encontrados por Martins et al. (2010), que estudaram a prevalência de E. coli com genes para enterotoxinas em suínos de abatedouros no Mato Grosso e isolaram 1,35% de cepas positivas para Stx2; 6,76% de cepas positivas para STa apenas; e 2,70% com genes de STa e LT-I associadas. Estes números demonstram uma baixa ‒ porém existente ‒ presença de genes de enterotoxinas de cepas isoladas em animais hígidos.

Com o antibiograma, traçou-se um perfil de sensibilidade das E. coli. Cento e vinte e sete amostras foram resistentes a pelo menos um antibiótico; 92 (72,44%) a pelo menos quatro antibióticos; e quatro (3,2%) não apresentaram sensibilidade a nenhum dos antibióticos testados. Os antibióticos que tiveram maior porcentagem de E. coli sensíveis neste estudo foram a norfloxacina (82,7%), gentamicina (75,6%), e sulfametoxazol + trimetoprim (63%), enquanto as mais resistentes foram lincomicina ‒ com todas as cepas resistentes ‒, sulfonamidas (74,8%) e tetraciclina (70,1%). As porcentagens aos antibióticos podem ser vistas na Fig. 2.

Neste trabalho, verificou-se um alto índice de bactérias com multirresistência aos antimicrobianos testados, resultados condizentes com Hirsh e Zee (2003), que afirmam que cepas de E. coli usualmente são resistentes às sulfonamidas, tetraciclina, estreptomicina, ampicilina e kanamicina. Os resultados observados neste estudo também estão de acordo com os trabalhos de Silva et al. (2008) e Costa et al. (2006), os quais também identificaram cepas com altas taxas de resistência.

Considerando que a utilização do cloranfenicol para uso veterinário foi proibida desde a publicação da Instrução Normativa n°9, de 27 de junho de 2003 (Brasil, 2003), a presença de 34,7% de cepas resistentes a esse antibiótico demonstra um dado interessante, principalmente porque a quase totalidade (90,9%) dessas cepas resistentes foram isoladas de granjas comerciais. Isso talvez possa ser explicado pela manutenção por meio de cosseleção dos genes de resistência a esse antibiótico com outros genes de resistência e genes de virulência (Rosengren et al., 2009).

Observou-se também uma alta prevalência de cepas resistentes à lincomicina. Todas as cepas isoladas foram resistentes a esse antibiótico, o que demonstra ser um dado preocupante para a produção animal. Essa resistência pode estar relacionada à utilização em larga escala de lincomicina no tratamento e na profilaxia de diarreias e como facilitador de crescimento na suinocultura (Baccaro et al., 2002). Três cepas que apresentaram multirresistência foram isoladas de uma mesma propriedade ‒ uma suinocultura industrial ‒, o que talvez possa ser justificado pelo costume da utilização, em larga escala de antimicrobianos na prevenção e no favorecimento de crescimento na suinocultura industrial quando comparada com a suinocultura de subsistência (Wang et al., 2010).

 

CONCLUSÕES

Neste estudo, foram identificadas cepas de E. coli com genes codificadores de STa e LT-I em suínos hígidos, o que pode favorecer o aparecimento de diarreias nos animais e o risco de transmissão para o homem. A alta taxa de resistência a antibióticos encontrada neste estudo demonstra uma tendência mundial ao isolamento de bactérias multirresistentes, que pode ser devido à utilização indiscriminada de antibióticos na suinocultura.

 

AGRADECIMENTOS

Ao Professor Marcos Bryan Heinemann, da Escola de Veterinária da UFMG, por ter cedido as cepas-controle positivas.

 

REFERÊNCIAS

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Recebido em 9 de março de 2012
Aceito em 11 de março de 2013

 

 

E-mail: vodrummond@yahoo.com.br

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