Atividade in vitro do óleo essencial de Origanum vulgare L. em isolados clínicos de Aspergillus spp.

In vitro activity of essential oil of Origanum vulgare L. in clinical isolates from Aspergillus spp.

RESUMO

Aspergillus fumigatus, A. flavus e A. niger são os mais importantes agentes etiológicos da aspergilose, relevante micose aviária, com tratamento ineficaz e altas taxas de mortalidade. Em vista da importância da aspergilose, da necessidade de prospectar novos fármacos e do potencial terapêutico do óleo essencial de Origanum vulgare L. (OEO), o orégano, objetivou-se avaliar a sensibilidade in vitro de isolados clínicos de Aspergillus spp. em relação ao OEO. O óleo foi obtido por hidrodestilação em Clevenger, e a análise química realizada por cromatografia de massa (GC/MS). Observaram-se 15 diferentes compostos ativos, sendo 4-terpineol, hidrato de sabinene e timol os majoritários. Nos testes de microdiluição em caldo (Reference..., 2008), todos os isolados (n= 23) foram sensíveis ao OEO: A. fumigatus teve CIM entre 28,125mg/mL (0,1875%) e 450mg/mL (3,0%), A. flavus entre 112,5mg/mL (0,75%) e 450mg/mL, e A. niger 112,5mg/mL. CFM variou de 112,5mg/mL a 450mg/mL nos isolados de A. fumigatus, de 225mg/mL (1,5%) a 450mg/mL em A. flavus, e foi de 450mg/mL em A. niger. CIM e CFM foram idênticos em 6/14 isolados, o que demonstra que o óleo com a mesma concentração pode ter capacidade fungistática e fungicida. CIM 90 correspondeu à CIM máxima. Os resultados demonstram a atividade anti-Aspergillus do OEO, com CIM 90 de 450mg/mL (3%).

Palavras-chave:
orégano; atividade anti-Aspergillus; Lamiaceae; antifungigrama

ABSTRACT

Aspergillus fumigatus, A. flavus and A. niger are the most important etiological agents of aspergillosis, a relevant avian mycosis, with innefective treatment and high mortality rates. Due the importance of aspergillosis, the necessity of prospection of new drugs and the therapeutic potential of the essential oil of Origanum vulgare L. (OEO), popularly known as oregano, aims to evaluate the in vitro sensitivity of Aspergillus spp. opposing to OEO. The oil was obtained by hydrodistillation in Clevenger, and the chemical analysis performed by mass chromatography (GC/MS). 15 different active compounds were observed, being 4-terpineol (18.4%), sabinene hydrate (15.6%) and thymol (13.6%), the majority components. In the in vitro susceptibility test, all strains showed sensitivity to OEO, MIC of Aspergillus fumigatus ranged from 28,125mg/mL (0,1875%) to 450mg/mL (3,0%), A. flavus 112,5mg/mL (0,75%) to 450mg/mL, and A. niger 112,5mg/mL. MFC ranged from 112,5mg/mL to 450mg/mL in the A. fumigatus isolates, 225mg/mL (1,5%) to 450mg/mL in A. flavus, and 450mg/mL for A. niger. The MIC and FMC values were identical in 6/14 of the isolated subjects, demonstrating that the oil with the same concentration can have fungistatic and fungicidal capacity. The results demonstrates anti-Aspergillus activities of OEO with CIM90 de 450mg/mL (3%).

Keywords:
oregano; anti-Aspergillus activity; lamiacea; antifungigram

INTRODUÇÃO

Aspergillus spp. são fungos ubíquos cujos conídios infectantes estão constantemente em contato com diferentes sistemas dos animais, sem que haja infecção. Porém, quando ocorre desequilíbrio na relação entre fungo e hospedeiro, dependendo da imunidade do animal, do volume de conídios inalados e dos fatores de patogenicidade da cepa envolvida, pode-se desenvolver um quadro de aspergilose (Arné et al., 2011; Munir et al., 2017). Por participarem de diferentes formas de quadros clínicos, como aspergilose e micotoxicoses, Aspergillus spp. são considerados, por Cruz (2010), como os mais importantes fungos em medicina veterinária.

A aspergilose é causada por diferentes espécies do gênero Aspergillus, entre as quais se destaca A. fumigatus, responsável por mais de 90% dos casos da micose, seguido por A. flavus e A. niger. A doença acomete diversas espécies, porém aves são particularmente suscetíveis, sendo a enfermidade responsável por altas taxas de mortalidade em centros de reabilitação e zoológicos, em aviários comerciais e em ovos embrionados (Abundis-Santamaria, 2003; Munir et al., 2017).

Em humanos, os antifúngicos de eleição para aspergilose são voriconazol (Pagano, 2010) e anfotericina B (Filippin e Souza, 2006), entretanto, em medicina veterinária, destaca-se o uso do itraconazol (Nobre et al., 2002; Beernaert et al., 2009; Munir et al., 2017). Porém, apesar de os antifúngicos estarem padronizados para uso em aves, na maioria dos casos o tratamento é ineficaz. A esse quadro se somam agravantes como a interrupção ou a não adoção da terapia, devido ao alto custo do tratamento e à resistência fúngica. A. fumigatus com resistência cruzada ao itraconazol e voriconazol, isolados de aspergilose aviária, já foram relatados por Beernaert et al. (2009), que consideraram baixa a possibilidade de aves e humanos infectados com estes isolados responderem à terapia antifúngica conhecida. Tais dados instigam, ainda mais, as crescentes buscas por novos antimicrobianos nos óleos essenciais (Fukayama et al., 2005). Nessa linha, ao se comparar carvacrol, um monoterpeno fenólico bastante identificado em óleos essenciais de plantas aromáticas, com voriconazol como profiláticos e no tratamento da aspergilose aviária, ambos apresentaram bons resultados, porém o uso do carvacrol ainda reduziu as taxas de colesterol e provocou menores perdas econômicas (Tartor e Hassan, 2017).

Origanum vulgare L. (orégano) tem-se mostrado promissor em estudos de bioprospecção, com atividade antimicrobiana in vitro e in vivo em relação a diversas espécies de fungos e bactérias (Cleff et al., 2010b; Mitchell et al., 2010; Cleff et al., 2013). No óleo essencial de orégano, foram descritos em torno de 34 compostos ativos, entre o quais 80 a 98% são fenóis, considerados os responsáveis pela atividade antimicrobiana e antioxidante (Kabouche et al., 2005). Em contrapartida, o extrato aquoso tem apenas cerca de 22% de compostos fenólicos (Scientific..., 2010). Sabendo-se que altas concentrações desses compostos e a sua relação são de grande importância para a eficácia dos extratos (Kabouche et al., 2005), fica evidente que estudos que visem a atividade antimicrobiana conduzidos com o óleo essencial sejam mais promissores do que quando conduzidos com os demais extratos.

Em vista dessa realidade, o presente estudo teve como objetivo realizar testes de sensibilidade in vitro de Aspergillus spp. isolados, provenientes de casos clínicos de aspergilose aviária ao óleo essencial de O. vulgare.

MATERIAL E MÉTODOS

O O. vulgare foi adquirido em distribuidor comercial, com certificação botânica, e as folhas secas submetidas à hidrodestilação em Clevenger para obtenção do óleo essencial. A análise cromatográfica do óleo foi realizada em cromatógrafo gasoso com detector de ionização de chama (GC/MS), caracterizado em função dos principais constituintes químicos e comparado com o tempo de retenção de padrões. Após a extração e análise, o óleo foi armazenado em frascos de vidro âmbar e mantido sob refrigeração, conforme descrito por Hollenbach et al. (2015).

Os isolados utilizados de Aspergillus spp. foram provenientes da micoteca do Laboratório de Doenças Infecciosas da Faculdade de Veterinária da Universidade Federal de Pelotas (MicVet - UFPel). Foram utilizados 23 isolados: A. fumigatus (n= 18), A. flavus (n= 3) e A. niger (n= 2) provenientes de casos clínicos de aspergilose em pinguins-de-Magalhães (Spheniscus magellanicus), coletados post mortem de trato respiratório.

Os testes de sensibilidade in vitro com Aspergillus spp. foram realizados de acordo com a normativa CLSI M38-A2 (Reference..., 2008) adaptada para óleo essencial. As colônias do gênero Aspergillus foram repicadas em ágar batata (PDA) e incubadas a 37ºC durante sete dias. Decorrido esse período, foram cobertas com 1,0mL de solução salina 0,85% estéril e uma gota de tween 20, e então a solução foi transferida para tubo de ensaio estéril. Após três a cinco minutos, a suspensão homogênea superior foi transferida para outro tubo estéril e homogeneizada em um agitador de tubos Vortex® durante 15 segundos, e sua concentração final foi ajustada a 5x10⁴UFC/mL.

Utilizaram-se microplacas com 96 orifícios, com a primeira coluna como controle para crescimento fúngico (controle positivo), e a última como controle de esterilidade (controle negativo). O óleo essencial de orégano foi utilizado em 10 diferentes concentrações no meio RPMI, indo de 900mg/mL (6,0%) até 1,65mg/mL (0,011%), em diluições seriadas em base log2, distribuídas no sentido das linhas das microplacas. Da segunda à 10ª coluna, foi distribuído 0,1mL do inóculo em triplicata. As microplacas foram, então, incubadas em estufa Shaker (Certomat® BS-1), regulada a uma temperatura de 35ºC e constante agitação (40 ciclos/min), para homogeneização do óleo ao meio de cultura. A leitura das microplacas foi realizada visualmente após 96 horas, determinando a concentração inibitória mínima (CIM) como a menor concentração do óleo necessária para inibir o crescimento fúngico. Já a concentração fungicida mínima (CFM) foi determinada pelo subcultivo de todos os poços da microplaca que não apresentaram crescimento fúngico visível, sendo a CFM considerada a menor concentração que impediu crescimento do fungo no subcultivo. CIM 50, CIM 90 e CIM máxima foram definidas como as menores concentrações capazes de inibir, respectivamente, o crescimento de 50%, 90% e de todos os isolados testados.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A análise do óleo essencial do orégano obtido resultou na identificação de 15 diferentes compostos ativos, todos apresentando probabilidade superior a 92%, conforme demonstrado na Fig. 1, com os picos numerados, e detalhados na Tab. 1.

Os componentes majoritários encontrados no óleo essencial de O. vulgare utilizado no estudo foram 4-terpineol (18,4%), hidrato de sabinene (15,6%) e timol (13,6%), respectivamente, os mesmos encontrados em estudo toxicológico com óleo essencial de orégano, porém com maior percentual para sabinene, seguido de timol e de 4-terpineol (Hollenbach, 2013). Da mesma forma, Soliman et al. (2009), visando à análise cromatográfica de amostras de óleo essencial de O. majorana, extraídos em diferentes épocas do ano, encontraram os mesmos componentes majoritários, também em concentrações variadas entre as amostras estudadas. Já Cleff et al. (2010b) obtiveram 4-terpineol e timol como componentes majoritários do óleo de orégano, não sendo citado hidrato de sabinene. Em estudo envolvendo cinco diferentes amostras de óleo essencial de orégano, foram encontrados 17 diferentes compostos, porém o carvacrol foi o componente majoritário em todas as amostras; já o timol esteve presente em três, sendo o segundo componente em maior concentração em dois dos óleos estudados (Silva et al., 2010). Ao compilar esses estudos, confirma-se a existência de grande variabilidade de componentes em diferentes amostras de óleos essenciais de orégano, conforme já foi relatado por D’Antuono et al. (2000).

Diferentes autores creditam a atividade antimicrobiana do óleo essencial de orégano à presença principalmente de timol e carvacrol como componentes majoritários (Kabouche et al., 2005; Chatzifragkou et al., 2011; Tartor e Hassan, 2017). Contudo, mesmo sem identificação de carvacrol no óleo utilizado no presente estudo, demonstrou-se atividade in vitro em relação a Aspergillus spp., tanto como fungistático, quanto como fungicida, o que corrobora o proposto por Cleff et al. (2013) de que a associação dos diferentes compostos dos óleos essenciais, em detrimento de seus componentes isolados, é responsável pela atividade antifúngica.

Figura 1
Espectro de CG/MS do óleo essencial de orégano, mostrando como compostos majoritários 4-terpineol (pico 9), hidrato de sabinene (pico 8) e timol (pico 13).

Tabela 1
CG/MS de óleo essencial de orégano

Pico
Número	Composto	Tempo	Área	% de área	CG/MS %*
1	ß-terpineno	7,858	4740644	3,40	95
2	4-carene	9,042	9258878	6,63	97
3	cymol	9,267	4686883	3,36	96
4	ß-phellandrene	9,392	3827719	2,74	92
5	gamma-terpinen	10,275	17291793	12,39	97
6	4-isopropyl-1-methyl-2-cyclohexen-1-ol	10,500	4022179	2,88	92
7	2-carene	11,117	2954008	2,12	96
8	5-isopropyl-2-methylbicyclo[3.1.0]hexan-2-ol (sabinene hydrate)	11,450	21703165	15,55	96
9	3-cyclohexen-1-ol, 4-methyl-1-(1-methylethyl)-, (R)- (terpinen-4-ol)	13,758	25719274	18,42	98
10	alpha-terpineol	14,108	4628508	3,32	98
11	thymol methyl ether	15,583	3074301	2,20	97
12	linalool acetate	15,900	10391631	7,44	95
13	thymol	16,975	18998356	13,61	96
14	caryophyllene	20,350	5312380	3,81	97
15	gamma-elemene	22,275	2976671	2,13	93

• *Probabilidade.

No teste de microdiluição em caldo, todas as cepas apresentaram sensibilidade ao óleo essencial de orégano, com CIM variando entre 28,125mg/mL (0,1875%) e 450mg/mL (3,0%) e CFM entre 112,5mg/mL (0,75%) e 450mg/mL (3,0%), conforme demonstrado na Tab. 2. A sensibilidade de todos os isolados ao óleo reforça a teoria de que óleos essenciais são estruturas complexas e suas atividades biológicas estão amplamente relacionadas à associação de diferentes compostos (Tisserand e Young, 2014). CIM 50 foi de 112mg/mL (0,75%) e CIM 90 e CIM máxima foram de 450mg/mL (3,0%), ou seja, futuros testes in vivo devem partir da concentração de 450mg/mL. Em estudo que confrontou timol, carvacrol e óleo essencial de O. vulgare com bactérias, constatou-se que o efeito antibacteriano do óleo foi superior ao encontrado quando utilizados os compostos isolados. Os autores citam o sinergismo entre os componentes do óleo essencial como um dos fatores determinantes para seus resultados; em contrapartida, questionam a possibilidade de haver efeito antagônico, dependendo da combinação desses componentes (Lambert et al., 2001).

O 4-terpineol, componente majoritário do óleo testado, é um monoterpeno de ação farmacológica comprovada, presente em diversas plantas como componente majoritário, sendo o principal responsável por seus efeitos farmacológicos. Óleos contendo altas concentrações de 4-terpineol podem, ainda, favorecer no tratamento in vivo de aspergilose, não só por sua atividade antimicrobiana, mas também pela atividade redutora de pressão arterial e baixa toxicidade (Joca, 2010). Como a micose acomete principalmente o sistema respiratório das aves, acarretando oxigenação deficiente e consequente hipertensão pulmonar, propiciando a ocorrência de síndrome ascítica (Jaenisch et al., 2001), o uso do óleo com capacidade hipotensora poderia reduzir os sinais clínicos respiratórios e auxiliar na cura e no bem-estar animal.

Tabela 2
Relação entre CIM e CFM dos isolados de Aspergillu s spp. (MicVet-UFPel), provenientes de casos clínicos de aspergilose em pinguins-de-Magalhães (Sphenicus magellanicus) utilizados em teste de sensibilidade in vitro ao óleo essencial de Origanum vulgar e

Isolados	CIM (%)	CFM (%)
A. fumigatus (MicVetA1)	1,5	3,0
A. fumigatus (MicVetA2)	1,5	3,0
A. fumigatus (MicVetA3)	3,0	3,0
A. fumigatus (MicVetA4)	1,5	1,5
A. fumigatus (MicVetA5)	0,75	0,75
A. fumigatus (MicVetA6)	0,75	1,5
A. fumigatus (MicVetA7)	0,1875	0,75
A. fumigatus (MicVetA8)	0,75	0,75
A. fumigatus (MicVetA9)	0,75	0,75
A. fumigatus (MicVetA10)	3,0	3,0
A. fumigatus (MicVetA11)	0,75	1,5
A. fumigatus (MicVetA12)	0,1875	0,75
A. fumigatus (MicVetA13)	1,5	3,0
A. fumigatus (MicVetA14)	0,75	0,75
A. fumigatus (MicVetA15)	0,75	0,75
A. fuimgatus (MicVetA16)	0,75	1,5
A. fumigatus (MicVetA17)	0,75	0,75
A. fumigatus (MicVetA18)	1,5	3,0
A. flavus (MicVetA19)	3,0	3,0
A. flavus (MicVetA20)	0,75	1,5
A. flavus (MicVetA21)	1,5	3,0
A. niger (MicVetA23)	0,75	3,0
A. niger (MicVetA24)	0,75	3,0

Assim como no presente estudo, o qual revelou forte atividade anti-Aspergillus do OEO, que provocou a inibição de todas as cepas fúngicas ensaiadas, Carmo et al. (2008) observaram sensibilidade de isolados do gênero Aspergillus ao OEO, porém em concentrações maiores, e efeito fungicida em relação a apenas algumas cepas. Já Mitchell et al. (2010) testaram um óleo essencial de orégano diante de cinco diferentes Aspergillus spp., o qual apresentou efeito inibitório sobre todas as cepas, com CIM inferior à CFM em todas, diferentemente do observado no presente estudo, no qual foram obtidos efeitos fungistático e fungicida em relação a cepas ensaiadas, com 42% (10/24) de coincidência entre CIM e CFM, o que demonstra que uma mesma concentração do óleo tem tanto capacidade de inibir quanto de debelar o fungo. Cleff et al. (2010a) obtiveram todos os resultados de CIM inferiores às apresentadas no presente estudo, com 0,06% para duas amostras de A. flavus e uma de A. fumigatus, e 0,03% para um isolado de A. fumigatus. A variedade das concentrações observadas pelos diferentes autores pode ser justificada por fatores individuais tanto dos agentes quanto dos óleos ensaiados.

Neste estudo, foram utilizados somente isolados patogênicos de Aspergillus spp., uma vez que todas as amostras eram provenientes de casos clínicos que evoluíram para óbito, tendo como causa mortis aspergilose. Zanandrea et al. (2004) trabalharam com testes de sensibilidade in vitro de fungos patogênicos do arroz e relataram atividade antimicrobiana do OEO em altas concentrações (óleo puro, 1:2; 1:4; 1:8; 1:16; 1:32), tendo os melhores resultados quando da utilização do óleo a 100%. O presente estudo trabalhou com menores concentrações, obtendo, também, resultados satisfatórios. Apenas três isolados (dois A. fumigatus e um A. flavus) apresentaram CIM com a maior concentração obtida entre todos os isolados (3%). Fatores individuais do fungo podem influenciar em sua patogenicidade e resistência antimicrobiana, o que justifica a grande variação entre a sensibilidade microbiana mesmo quando comparada dentro de uma mesma espécie. Ao compararem bactérias de casos clínicos de pododermatite aviária, Osório et al. (2013) demonstraram que isolados de mesmo gênero, quando confrontados com antimicrobianos de uso rotineiro em medicina veterinária, apresentaram resultados diferentes de sensibilidade aos fármacos, o que reforça que fatores individuais do micro-organismo têm influência sobre sua sensibilidade a determinados agentes.

O presente estudo é pioneiro no que tange à sensibilidade de isolados de aspergilose aviária em relação ao óleo essencial de orégano e demonstra o potencial deste para novos estudos, incluindo testes de toxicidade e sensibilidade in vivo que utilizem aves como animais experimentais. Estudos anteriores, realizados com ratos (Rattus novergicus), determinaram que o óleo essencial de O. vulgare L. a 3% não apresentou toxicidade sistêmica nem reprodutiva (Cleff et al., 2008; Hollenbach, 2013), o que cria perspectivas de uso terapêutico do orégano, abrindo, dessa forma, caminhos para estudos mais aprofundados com extratos da planta, incluindo testes in vivo.

CONCLUSÕES

O óleo essencial de orégano utilizado no estudo apresentou 4-terpineol, hidrato de sabinene e timol como componentes majoritários. Todos os isolados de A. fumigatus, A. flavus e A. niger apresentaram sensibilidade a esse óleo essencial, que demonstrou atividade fungicida e fungistática, com CIM 90 e CIM máxima de 450mg/mL (3%).

AGRADECIMENTOS

Capes, CNPq, MicVet-UFPel, PPGCV-UFRGS.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  Jan-Feb 2019

Histórico

• Recebido
  28 Jun 2017
• Aceito
  08 Jan 2018