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ω-Conotoxina MVIIC e células-tronco mesenquimais promovem recuperação motora em ratos Wistar após trauma medular agudo

[ω-Conotoxin MVIIC and mesenchymal stem cells promote motor recovery in Wistar rats after acute spinal cord injury]

RESUMO

O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da ω-conotoxina MVIIC e das células-tronco mesenquimais (CTM) de forma isolada e sua associação nos ratos submetidos ao trauma medular agudo (TMA). Trinta Rattus novergicus, linhagem Wistar, três meses de idade, foram distribuídos igualmente em cinco grupos experimentais: controle negativo (CN), controle positivo (CP), ω-conotoxina MVIIC (MVIIC), células-tronco mesenquimais da medula óssea (CTM-MO) e associação (MVIIC + CTM-MO). O grupo CN foi submetido à laminectomia sem trauma medular, e os grupos CP, MVIIC, CTM-MO e MVIIC + CTM-MO foram submetidos ao trauma medular contusivo. O grupo CP recebeu, uma hora após o TMA, 10μL de PBS estéril, e os grupos MVIIC e MVIIC + CTM-MO receberam 10μL de PBS contendo 20pmol da ω-conotoxina MVIIC, todos por via intratecal. Os grupos CTM-MO e MVIIC + CTM-MO receberam, 24 horas após, 1x106 de CTM via intravenosa. Avaliou-se a recuperação da função locomotora até o sétimo dia pós-trauma. Os animais tratados com MVIIC + CTM-MO obtiveram recuperação motora após o trauma medular agudo (P<0,05). Conclui-se que essa associação apresentou efeito neuroprotetor com melhora na função locomotora em ratos Wistar.

Palavras-chave:
terapia celular; lesão medular; bloqueadores de canais de cálcio; neuroproteção

ABSTRACT

The objective of this study was to evaluate the effect of isolated ω-conotoxin MVIIC and mesenchymal stem cells (MSCs) and its association in rats submitted to acute spinal cord injury (SCI). Thirty Rattus norvegicus, Wistar strain, three-month-old rats were randomly distributed in five experimental groups with six animals: negative control (CN), positive control (CP), ω-conotoxin MVIIC (MVIIC), bone marrow mesenchymal stem cells (CTM-MO) and the association (MVIIC + CTM-MO). The CN group underwent laminectomy without spinal cord trauma, and groups CP, MVIIC, CTM-MO and MVIIC + CTM-MO were submitted to contusive spinal cord trauma. The CP group received 10μl of PBS one hour after SCI, and groups MVIIC and MVIIC + CTM-MO received 10μl of PBS containing 20pmol of ω-conotoxin MVIIC, both intrathecally. Groups CTM-MO and MVIIC + CTM-MO received 1x106 of MSCs intravenously 24 hours later. The recovery of locomotor function was evaluated up to seven days post-injury. The animals treated with MVIIC + CTM-MO obtained motor recovery after SCI (P<0.05). It is concluded that this association showed neuroprotective effect with improvements in locomotor function in Wistar rats.

Keywords:
cell therapy; spinal cord injury; calcium channel blockers; neuroprotection

INTRODUÇÃO

O trauma medular agudo (TMA) é frequente na rotina da clínica de pequenos animais, considerada uma afecção grave com alta morbidade e mortalidade, que leva ao comprometimento das funções da medula espinhal (Bahr Arias et al., 2007; Kjell e Olson, 2016KJELL, J.; OLSON, L. Rat models of spinal cord injury: from pathology to potential therapies. Dis. Model. Mech., v.9., p.1125-1137, 2016.). Os tratamentos terapêuticos disponíveis têm ação limitada na recuperação neurológica e, por isso, são desenvolvidos estudos que avaliem estratégias eficazes para o tratamento da lesão medular (Kwon et al., 2004KWON, B.K.; TETZLAFF, W.; GRAUER, J.N. et al. Pathophysiology and pharmacologic treatment of acute spinal cord injury. Spine J., v.4, p.451-464, 2004.; Kjell e Olson, 2016). O impacto mecânico no momento do trauma causa lesão primária, com ruptura de osteoligamentos, morte neuronal, dano axonal, hemorragia e morte celular, e desencadeia os processos fisiopatológicos após a injúria medular. A lesão primária pode resultar em uma concussão medular a déficits neurológicos transitórios ou permanentes, como a paralisia, além da perda somatossensorial, como consequências das interrupções nervosas (Janssens, 1991JANSSENS, L.A.A. Mechanical and pathophysiological aspects of acute spinal cord trauma. J. Small Anim. Pract., v.32, p.572-578, 1991.; Kwon et al., 2004; Oyinbo, 2011OYINBO, C.A. Secondary injury mechanisms in traumatic spinal cord injury: a nugget of this multiply cascada. Acta Neurobiol. Exp., v.71, p.281-299, 2011.).

A lesão secundária é iniciada em alguns minutos e dura dias após o trauma. Essa fase é caracterizada por alteração na perfusão vascular, infarto isquêmico da substância cinzenta, com possibilidade de necrose dentro de 24 horas das células sobreviventes ao impacto mecânico, desequilíbrio da homeostase iônica, apoptose e morte celular, geração de radicais livres e peroxidação lipídica. Todos esses processos são inter-relacionados, com feedback positivo, contribuindo para a disseminação do dano secundário ao tecido adjacente sobrevivente a partir do epicentro da lesão. No dano neuronal, a ruptura da membrana celular leva ao efluxo de potássio e ao influxo de íons de cálcio e sódio, com perda de condutibilidade, causando o disparo neurotóxico.

A excitotoxicidade mediada por glutamato acarreta disfunção mitocondrial, ativação de enzimas líticas, produção de espécies reativas de oxigênio e ativação da cascata de ácido aracdônico, este último responsável pelo início da resposta inflamatória, resultando na necrose da substância cinzenta e na intensa degeneração axonal na substância branca (Janssens, 1991JANSSENS, L.A.A. Mechanical and pathophysiological aspects of acute spinal cord trauma. J. Small Anim. Pract., v.32, p.572-578, 1991.; Kwon et al., 2004KWON, B.K.; TETZLAFF, W.; GRAUER, J.N. et al. Pathophysiology and pharmacologic treatment of acute spinal cord injury. Spine J., v.4, p.451-464, 2004.; Bahr Arias et al., 2007).

Com o intuito de reduzir o dano secundário no TMA, são realizados estudos com substâncias farmacológicas neuroprotetoras, para diminuir os efeitos deletérios e promover a melhora das funções neurológicas nesses pacientes (Bahr Arias et al., 2007). O estudo com agentes bloqueadores de canais de cálcio demonstra potencial terapêutico nessa afecção por impedir o fluxo exacerbado desse íon, reduzindo a progressão da lesão secundária (Bergman et al., 2000BERGMAN, R.; LANZ, O.; SHELL, L. A review of experimental and clinical treatments for acute spinal cord injury. Vet. Med., v.95, p.855-866, 2000.). A toxina de caramujos marinhos do gênero Conus é considerada uma substância com alto potencial terapêutico por apresentar estabilidade, facilidade de síntese e alta seletividade presente nas classes das conotoxinas μ (mu) e ω (ômega) pelos canais de sódio e cálcio na membrana plasmática (Lewis e Garcia, 2003LEWIS, R.J.; GARCIA, M.L. Therapeutic potential of venom peptides. Nat. Rev. Drug. Discov., v.2, p.790-802, 2003.; Olivera e Teichert, 2007OLIVERA, B.M.; TEICHERT, R.W. Diversity of the neurotoxic conus peptides: a model for concerted pharmacological discovery. Mol. Interv., v.7, p.251-260, 2007.).

A ação das ω-conotoxinas MVIIC e MVIIA nos receptores de membrana de canais de Ca2+ voltagem-dependentes (CCVD) causa o bloqueio dos canais do tipo N e P/Q na medula espinhal, a regulação da liberação de neurotransmissores e a redução dos efeitos deletérios no TMA, como excitotoxicidade glutamatérgica e excesso de influxo de íons de cálcio e sódio (Matute et al., 2007MATUTE, C.; ALBERDI, E.; DOMERCQ, M. et al. Excitotoxic damage to white matter. J. Anat., v.210, p.693-702, 2007.; Oliveira et al., 2014aOLIVEIRA, K.M.; LAVOR, M.S.L.; SILVA, C.M.O. et al. Omega-conotoxin MVIIC attenuates neuronal apoptosis in vitro and improves significant recovery after spinal cord injury in vivo in rats. Int. J. Clin. Exp. Pathol., v.7, p.3524-3536, 2014a.; 2014b, 2018; Azevedo, 2018AZEVEDO, S.C. Ômega conotoxina MVIIC no tratamento do trauma medular agudo em ratos Wistar. 2018, 56f. Dissertação (Mestrado em Ciência Animal) - Escola de Veterinária, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, MG.).

A terapia com células-tronco mesenquimais (CTM) se destaca pela capacidade de autorrenovação e diferenciação celular com função regenerativa (Caplan e Dennis, 2006CAPLAN, A.I.; DENNIS, J.E. Mesenchymal stem cells as trophic mediators. J. Cell. Biochem., v.98, p.1076-1084, 2006.). O uso de CTM em ratos no trauma medular agudo demonstrou neuroproteção nas lesões espinhais (Osaka et al., 2010OSAKA, M.; HONMOU, O.; MURAKAMI, T. et al. Intravenous administration of mesenchymal stem cells derived from bone marrow after contusive spinal cord injury improves functional outcome. Brain Res., v.1343, p.226-235, 2010.; Silva et al., 2018SILVA, C.M.O.; OLIVEIRA, K.M.; LAVOR, M.S.L. et al. Benefícios da condroitinase abc associada a células-tronco mesenquimais na lesão espinhal aguda em ratos. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.70, p.857-872, 2018.; Torres et al., 2018TORRES, B.B.J.; TORRES, B.B.J.; MARTINS, B.C.; SILVA, C.M.O. et al. Dantrolene e células-tronco mesenquimais promovem melhora funcional em ratos Wistar com trauma espinhal agudo. Pesqui. Vet. Bras., v.38, p.703-709, 2018.), pois promoveu regeneração celular, redução de apoptose de neurônios e de células da glia, com produção de citocinas pró e anti-inflamatórias que podem modular a inflamação pelo trauma espinhal (Caplan e Dennis, 2006; Rosado et al., 2017ROSADO, I.R.; CARVALHO, P.H.; ALVES, E.G.L. et al. Immunomodulatory and neuroprotective effect of cryopreserved allogeneic mesenchymal stem cells on spinal cord injury in rats. Genet. Mol. Res., v.16, p.1-24, 2017.; Silva et al., 2018), diminuiu o dano do tecido nervoso durante a lesão secundária, bem como promoveu recuperação da função locomotora (Han et al., 2015HAN, D.; WU, C.; XIONG, Q. et al. Anti-inflammatory Mechanism of bone marrow mesenchymal stem cell transplantation in rat model of spinal cord injury. Cell Biochem. Biophys., v.71, p.1341-1347, 2015.). Na literatura, não existem relatos que avaliam essas duas terapias em associação, sendo este o primeiro estudo a avaliar a possibilidade de sinergia entre a ω-conotoxina MVIIC e as células-tronco no trauma medular em associação e no trauma medular agudo em ratos Wistar.

MATERIAL E MÉTODOS

Este estudo foi aprovado e desenvolvido de acordo com as normas estabelecidas pelo Comitê de Ética no Uso de Animais da Universidade Federal de Minas Gerais (Ceua-UFMG), sob protocolo nº 369/2017. Trinta ratos machos da espécie Rattus norvegicus, linhagem Wistar, três meses de idade e com peso médio de 350 gramas, foram mantidos com ração comercial para roedores (Presence Alimentos, Brasil) e água ad libitum, submetidos a ciclo claro-escuro de 12 horas, em ambiente climatizado. Os animais foram distribuídos aleatoriamente em cinco grupos experimentais, com seis ratos em cada: controle negativo (CN), controle positivo (CP), ω-conotoxina MVIIC (MVIIC), CTM da medula óssea (CTM-MO) e ω-conotoxina MVIIC associada às CTM (MVIIC + CTM-MO) (Tab. 1). Outros seis Rattus novergicus da linhagem Wistar, machos, 30 dias de idade, com 100g de massa corporal, foram utilizados para a coleta da medula óssea e a obtenção das CTM-MO.

Tabela 1
Distribuição dos grupos experimentais e protocolos de tratamento

A extração e o cultivo de células-tronco mesenquimais da medula óssea foram realizados conforme protocolo adotado pelo Núcleo de Células-Tronco e Terapia Celular da UFMG (Ocarino et al., 2008OCARINO, N.M.; BOELONI, J.N.; GOES, A.M. et al. Osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells from osteopenic rats subjected to physical activity with and without nitric oxide synthase inhibition. Nitric Oxide, v.19, p.320-325, 2008.). Os animais foram submetidos à eutanásia com sobredose de tiopental sódico 100mg/kg (Thiopentax®, Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda., Brasil) e lidocaína 10mg/kg (Xylestein®, Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos, Brasil), via intraperitoneal. As CTM foram obtidas dos fêmures e das tíbias dos seis ratos Wistar e cultivadas no meio de cultura DMEN (Dulbecco's Modified Eagle Medium) (Gibco®, Invitrogen, USA) com soro fetal bovino (Gibco®, Invitrogen, USA), mantidas em estufa a 37ºC e 5% de CO2.

As células que não se aderiram foram removidas, e o meio de cultivo foi trocado três vezes por semana, até atingir a confluência celular de 80% a 90%. Ao atingir essa confluência, era realizada a tripsinização e o repique do cultivo celular até as células atingirem a terceira passagem para serem inoculadas nos animais. O fenótipo celular foi caracterizado pela expressão do antígeno de superfície celular (CD - cluster of differentiation), em citômetro de fluxo FACScan - (Fluorescence Activated Cell Analyser) (FACScan™, Becton Dickinson Immunocytometry, USA), utilizando-se os seguintes anticorpos monoclonais primários (BD Biosciences, USA): anti-CD 45 (clone 69 mouse), anti-CD 54 (clone 1A29 mouse), anti-CD 73 (clone 5F/B9 mouse) e anti-CD 90 (clone OX-7 mouse), segundo protocolo estabelecido (Castanheira et al., 2009CASTANHEIRA, P.; TORQUETTI, L.T.; MAGALHÃES, D.R.S. et al. DAPI diffusion after intravitreal injection of mesenchymal stem cells in the injured retina of rats. Cell Transplant., v.18, p.1-100, 2009.).

Para o procedimento cirúrgico de laminectomia experimental, os animais receberam antibioticoprofilaxia com cefalotina sódica (Keflin®, ABL -Antibióticos do Brasil Ltda., Brasil), na dose de 60mg/kg e, para analgesia, sulfato de morfina (Dimorf®, Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda., Brasil), na dose de 5mg/kg, ambos via intramuscular, 30 minutos antes da cirurgia. A indução anestésica foi realizada em câmara com isoflurano (Isoforine®, Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda., Brasil), e a manutenção do plano anestésico cirúrgico foi realizada com o mesmo agente, em máscara facial, em sistema de não-reinalação.

Os ratos foram posicionados em decúbito esternal sobre a mesa do disposto de trauma Multicenter Animal Spinal Injury Study (MASCIS) Impactor (Impactor Model III, The State University of New Jersey, USA). A antissepsia da região dorsal do tronco foi realizada com solução aquosa de digliconato de clorexidina 2% (Riohex® 2% Solução com tensoativos, Rioquímica Ltda., Brasil) e com solução alcoólica de digliconato de clorexidina 0,5% (Riohex® 0,5% Solução alcoólica, Rioquímica Ltda., Brasil). O procedimento cirúrgico iniciou-se com a identificação do processo espinhoso da 12ª vértebra torácica (T12); em seguida, foram realizadas incisões de pele e tecido subcutâneo na linha média dorsal, divulsão lateral dos músculos epiaxiais e ostectomia com pinça hemostática de Kocher, seguida de laminectomia dorsal do segmento vertebral T12 com drill pneumático neurológico (ECCOS® Aesculap, Laboratório B. Braun S.A., Brasil) (Fig. 1A).

Após exposição da medula (Fig. 1B), realizou-se o trauma medular, com exceção do grupo controle negativo, pelo sistema de estabilização vertebral do aparelho estereotáxico MASCIS Impactor (Fig. 1C), obedecendo ao protocolo internacional utilizado no Multicenter Animal Spinal Cord Injury Study (Young, 2009YOUNG, W. MASCIS spinal cord contusion model. In: CHEN, J.; XU, Z.C.; XU, X.M.; ZHANG, J.H. Animal models of acute neurological injuries. [s.l.]: Springer, 2009. p.411-421.). O trauma contusivo agudo foi gerado pela queda de haste de 10g a uma altura de 25mm, durante cinco segundos. O dispositivo foi conectado ao software Impactor 7.0, no computador, para acompanhamento das curvas de trajetória do impacto, objetivando apontar possíveis erros de velocidade, tempo e altura de queda, conforme Santos e colaboradores (2011SANTOS, G.B.; CRISTANTE, A.F.; MARCON, R.M. et al. Modelo experimental de lesão medular e protocolo de avaliação motora em ratos Wistar. Acta Ortop. Bras., v.19, p. 87-91, 2011.).

Os músculos foram aproximados com padrão de sutura Reverdin e redução do espaço morto com sutura simples contínua e dermorrafia com ponto simples separado, utilizando-se fio inabsorvível sintético de nylon 2-0 (Procare®, Lamidid, Brasil). Os animais foram mantidos aquecidos com bolsa térmica, durante o procedimento cirúrgico e no pós-operatório imediato, com oxigenoterapia até a completa recuperação anestésica e fluidoterapia com solução de NaCl 0,9% (15mL/kg, via subcutânea). A analgesia foi realizada com sulfato de morfina, na dose de 5mg/kg, via subcutânea, a cada oito horas, durante três dias, e massagem vesical duas vezes ao dia, para o esvaziamento da bexiga, até o dia da eutanásia.

A ω-conotoxina MVIIC (ω-®, Latoxan, France) utilizada estava na concentração de 20pmol, diluídos em PBS estéril (Phosphate buffered saline - tampão fosfato salino), em volume total de 10μL, com administração intratecal no espaço subaracnoideo entre a quinta e a sexta vértebras lombares, utilizando-se uma seringa de Hamilton 701LT (10 microL Model 701 LT SYR, Hamilton® Company, USA) acoplada à agulha 26G (BD Biosciences, Brasil). Os grupos MVIIC e CTM-MO + MVIIC receberam a aplicação da conotoxina uma hora após o trauma medular, e os grupos CP e CTM-MO receberam somente 10μL de PBS estéril uma hora após o trauma. Todos os animais foram induzidos à anestesia geral com isoflurano para contenção e prevenção de possível trauma espinhal decorrente da aplicação.

As CTM imediatamente antes da aplicação intravenosa foram avaliadas quanto à viabilidade celular pelo azul de Tripan, sendo ressuspendidas com o volume necessário para se obter 1x106 CTM em 0,2mL de PBS. A injeção de células-tronco mesenquimais nos grupos CTM-MO e CTM-MO + MVIIC ocorreu 24 horas após o procedimento de indução do trauma medular, com uma única aplicação na veia lateral da cauda de 1x106 de CTM, via intravenosa. Os grupos CP e MVIIC receberam o mesmo volume de 0,2mL de PBS. O procedimento foi realizado com indução dos animais na câmara anestésica com isoflurano, para contenção física, no entanto sem atingir plano anestésico cirúrgico para compressão da veia lateral da cauda e aplicação de PBS e CTM.

A avaliação da função locomotora foi feita 24 horas antes do procedimento cirúrgico e diariamente até o sétimo dia após o TMA. Essa avaliação foi realizada posicionando-se cada animal em uma superfície plana, em campo aberto de 1m2, e foi filmada durante dois minutos. Os vídeos foram avaliados por dois observadores, sem conhecimento da identificação dos animais e seus respectivos grupos, e a classificação foi estabelecida de acordo com a escala de avaliação locomotora proposta por Basso (1996BASSO, D.M.; BEATTIE, M.S.; BRESNAHAN, J.C. Graded histological and locomotor outcomes after spinal cord contusion using the NYU weight-drop device versus transection. Exp. Neurol., v.139, p.244-256, 1996.), com escore de 0-21, em que o zero caracteriza-se por nenhum movimento dos membros pélvicos, e o 21 indica preservação de todas as funções locomotoras preservadas. Após o sétimo dia de indução do trauma medular, os animais foram submetidos à eutanásia com sobredose de tiopental sódico (100mg/kg) e lidocaína (10mg/kg), via intraperitoneal. Coletaram-se segmentos medulares de 1,0cm craniais e caudais ao epicentro da lesão para posterior estudo.

Neste estudo, utilizou-se o delineamento inteiramente ao acaso. A normalidade dos parâmetros foi verificada com o teste de Shapiro-Wilk, e constatou-se que os dados eram não paramétricos. Os escores referentes à avaliação motora dos ratos Wistar foram comparados entre os dias de avaliação em cada grupo pelo teste de Friedman, e, ao sétimo dia, os grupos foram avaliados entre si pelo teste de Kruskal-Wallis, com nível de significância de 5% (P<0,05). As análises estatísticas foram realizadas com o software estatístico InfoStat, versão 2016 (Universidade Nacional de Córdoba, Argentina).

Figura 1
Fotografias do procedimento cirúrgico de trauma medular experimental em ratos Wistar. A) Remoção da lâmina dorsal da vértebra T12 com o drill pneumático neurológico. B) Medula espinhal exposta com hemorragia após a laminectomia. C) Aparelho MASCIS Impactor utilizado para induzir o trauma contusivo agudo na medula espinhal.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

As células-tronco mesenquimais da medula óssea de ratos Wistar cultivadas até a terceira passagem apresentaram as características morfológicas típicas in vitro descritas na literatura, com morfologia semelhante ao fibroblasto, aderência ao material plástico e rápida expansão celular (Caplan e Dennis, 2006CAPLAN, A.I.; DENNIS, J.E. Mesenchymal stem cells as trophic mediators. J. Cell. Biochem., v.98, p.1076-1084, 2006.; Dominici et al., 2006DOMINICI, M.; LE BLANC, K.; MUELLER, I. et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy, v.8, p.315-317, 2006.). A expressão dos marcadores fenotípicos das CTM, nos seguintes antígenos, foram: CD45 (3,06%), CD73 (93,99%), CD54 (95,10%) e CD (86,77%) (Ocarino et al., 2008OCARINO, N.M.; BOELONI, J.N.; GOES, A.M. et al. Osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells from osteopenic rats subjected to physical activity with and without nitric oxide synthase inhibition. Nitric Oxide, v.19, p.320-325, 2008.), mostrando que as células cultivadas apresentaram as características necessárias para serem consideradas células-tronco, e não pertencendo à linhagem hematopoiética, conforme determinado pelo Mesenchymal and Tissue Stem Cell Committee of International Society for Cellular Therapy (Dominici et al., 2006).

Os modelos animais de laboratório são necessários para se compreenderem os aspectos da lesão traumática, avaliando-se as alterações moleculares, bioquímicas e histológicas decorrentes do TMA (Onifer et al., 2007ONIFER, S.M.; RABCHEVSKY, A.G.; SCHEFF, S.W. Rat models of traumatic spinal cord injury to assess motor recovery. ILAR J., v.48, p.385-395, 2007.). No intuito de descobrir e desenvolver novos fármacos e terapias que visem à prevenção da perda neuronal, ainda é necessário o uso de animais em modelos experimentais (Rowland et al., 2008ROWLAND, J.W.; HAWRYLUK, G.W.J.; KWON, B.; FEHLINGS, M.G. Current status of acute spinal cord injury pathophysiology and emerging therapies: promise on the horizon. Neurosurg. Focus, v.25, p.1-17, 2008.). O trauma medular induzido por haste com queda de peso é o modelo mais aceito pelos pesquisadores, por mimetizar situações semelhantes que ocorrem com os seres humanos (Rodrigues et al., 2010RODRIGUES, N.R.; LETAIF, O.B.; CRISTANTE, A.F. et al. Padronização da lesão de medula espinal em ratos Wistar. Acta Ortop. Bras., v.18, p.182-186, 2010.).

A utilização do dispositivo de trauma estereotáxico MASCIS Impactor permitiu a realização de um trauma medular compressivo padronizado em todos os grupos submetidos ao trauma, o que possibilitou o acompanhamento do processo de injúria medular, corroborando os estudos realizados por Santos e colaboradores (2011SANTOS, G.B.; CRISTANTE, A.F.; MARCON, R.M. et al. Modelo experimental de lesão medular e protocolo de avaliação motora em ratos Wistar. Acta Ortop. Bras., v.19, p. 87-91, 2011.) e Azevedo (2018AZEVEDO, S.C. Ômega conotoxina MVIIC no tratamento do trauma medular agudo em ratos Wistar. 2018, 56f. Dissertação (Mestrado em Ciência Animal) - Escola de Veterinária, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, MG.). Todos os animais desses grupos apresentaram o escore BBB entre 0 e 1 na primeira avaliação após a lesão medular.

Os animais do estudo submetidos à contusão com uma haste de 10g em queda livre a 25mm de altura apresentam paraplegia nos membros pélvicos e alguns ratos tiveram hematúria nos primeiros dias após a lesão medular. Os resultados obtidos foram considerados trauma grave, contrapondo outros autores (Rodrigues et al., 2010RODRIGUES, N.R.; LETAIF, O.B.; CRISTANTE, A.F. et al. Padronização da lesão de medula espinal em ratos Wistar. Acta Ortop. Bras., v.18, p.182-186, 2010.; Santos et al., 2011SANTOS, G.B.; CRISTANTE, A.F.; MARCON, R.M. et al. Modelo experimental de lesão medular e protocolo de avaliação motora em ratos Wistar. Acta Ortop. Bras., v.19, p. 87-91, 2011.), que obtiveram trauma moderado em modelos experimentais semelhantes de trauma. Essa diferença de classificação entre trauma moderado e grave por esses autores poderia ser devido à escolha de animais de idade, sexo e pesos diferentes, em comparação ao presente estudo, além da localização da lesão do trauma contusivo. Entretanto, Agrawal e colaboradores (2010AGRAWAL, G.; KERR, C.; THAKOR, N.V.; ALL, A.H. Characterization of graded multicenter animal spinal cord injury study contusion spinal cord injury using somatosensory-evoked potentials. Spine, v.35, p.1122-1127, 2010.) realizaram um estudo com trauma contusivo utilizando o MASCIS com classificação das seguintes alturas de impacto: 6,25mm (leve), 12,5mm (moderado), 25mm (grave) e 50mm (muito grave), com dados que corroboram os deste estudo.

O grupo controle negativo (CN) não teve nenhuma alteração motora, o que demonstra que o procedimento cirúrgico de laminectomia não comprometeu a integridade da medula espinhal e, consequentemente, a função motora, conforme observado em outros estudos com trauma medular agudo em ratos Wistar (Oliveira et al., 2014aOLIVEIRA, K.M.; LAVOR, M.S.L.; SILVA, C.M.O. et al. Omega-conotoxin MVIIC attenuates neuronal apoptosis in vitro and improves significant recovery after spinal cord injury in vivo in rats. Int. J. Clin. Exp. Pathol., v.7, p.3524-3536, 2014a., 2014b, 2018, Silva et al., 2018SILVA, C.M.O.; OLIVEIRA, K.M.; LAVOR, M.S.L. et al. Benefícios da condroitinase abc associada a células-tronco mesenquimais na lesão espinhal aguda em ratos. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.70, p.857-872, 2018.). Os animais não mudaram seu comportamento durante o experimento, não demonstraram dor e mantiveram a ingestão diária de alimento, o que sugere que a analgesia realizada com a administração de sulfato de morfina foi eficiente. Não houve alteração clínica nos animais que receberam as células-tronco mesenquimais, a ω-conotoxina MVIIC e a associação das duas terapias, o que indica a ausência de efeitos colaterais clínicos decorrentes desses tratamentos.

A avaliação da função locomotora em campo aberto por meio do teste BBB (Basso, Beattie e Bresnahan) permitiu uma avaliação de fácil execução e aplicável nos animais, sem causar nenhum dano ou estresse. Os ratos avaliados previamente ao trauma apresentaram o escore máximo 21, caracterizado pela ausência de déficit neurológico, portanto com deambulação normal, suporte de peso nos quatros membros, estabilidade do tronco e cauda elevada. Os animais do grupo CN mantiveram o escore 21 na avaliação durante todo o experimento (Fig. 3A), e os demais grupos submetidos ao TMA apresentaram paraplegia dos membros posteriores imediatamente após o trauma, com escore 0 e 1 (Fig. 3B).

Esse resultado demonstra que o trauma efetuado foi padronizado e grave, e esses animais gradualmente recuperaram a função locomotora em diferentes graus, classificados de acordo com escorre BBB (1 a 21) (Fig. 3C). A Tab. 2 apresenta as medianas do escore BBB dos grupos experimentais do primeiro ao sétimo dia de avaliação.

Os animais de todos os grupos (CP, MVIIC, CTM-MO e MVIIC + CTM-MO), com exceção do controle negativo, apresentaram diferença significativa entre dias avaliados (P<0,05), demonstrando a melhora da locomoção de cada grupo durante esse período. Os animais que receberam a associação terapêutica (MVIIC + CTM-MO) atingiram a melhor classificação no escore BBB.

Quando os grupos foram comparados entre si ao sétimo dia de avaliação, foi observada diferença significativa dos grupos CP, MVIIC e CTM-MO em relação ao grupo CN. Entretanto, o grupo MVIIC + CTM-MO foi semelhante ao grupo controle negativo (Fig. 4). Esse resultado indica que houve rápida recuperação motora do grupo MVIIC + CTM-MO, sugerindo que as células-tronco em associação com a MVIIC apresentaram efeito neuroprotetor no TMA.

Os estudos com ω-conotoxina MVIIC no TMA demonstraram melhora na função motora quando esta foi aplicada pelas vias intralesional e intratecal (Oliveira et al., 2014aOLIVEIRA, K.M.; LAVOR, M.S.L.; SILVA, C.M.O. et al. Omega-conotoxin MVIIC attenuates neuronal apoptosis in vitro and improves significant recovery after spinal cord injury in vivo in rats. Int. J. Clin. Exp. Pathol., v.7, p.3524-3536, 2014a.; Lozano, 2017LOZANO, J.S.G. Efeito neuroprotetor da ômega-conotoxina MVIIC no trauma experimental da medula espinhal em ratos. 2017. 67f. Dissertação (Mestrado em Ciência Animal) - Escola de Veterinária, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, MG.; Azevedo, 2018AZEVEDO, S.C. Ômega conotoxina MVIIC no tratamento do trauma medular agudo em ratos Wistar. 2018, 56f. Dissertação (Mestrado em Ciência Animal) - Escola de Veterinária, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, MG.), o que não foi observado no presente estudo. Essas diferenças podem ser devido a tempos diferentes de estudo e à administração da conotoxina, além da via de aplicação. Conclui-se que este tratamento, de forma isolada, não trouxe benefício para os animais dos grupos tratados em comparação ao grupo positivo.

As células-tronco mesenquimais em sua aplicação isolada ou associada à conotoxina promoveram melhor recuperação nos ratos Wistar, corroborando os resultados de outros estudos, com efeito terapêutico na recuperação motora na lesão medular (Osaka et al., 2010OSAKA, M.; HONMOU, O.; MURAKAMI, T. et al. Intravenous administration of mesenchymal stem cells derived from bone marrow after contusive spinal cord injury improves functional outcome. Brain Res., v.1343, p.226-235, 2010.; Silva et al., 2018SILVA, C.M.O.; OLIVEIRA, K.M.; LAVOR, M.S.L. et al. Benefícios da condroitinase abc associada a células-tronco mesenquimais na lesão espinhal aguda em ratos. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.70, p.857-872, 2018.; Torres et al., 2018TORRES, B.B.J.; TORRES, B.B.J.; MARTINS, B.C.; SILVA, C.M.O. et al. Dantrolene e células-tronco mesenquimais promovem melhora funcional em ratos Wistar com trauma espinhal agudo. Pesqui. Vet. Bras., v.38, p.703-709, 2018.). Outros pesquisadores obtiveram resultados positivos, com os mesmos efeitos sobre a recuperação da função motora com aplicações, vias intralesional e intravenosa de CTM (Silva et al., 2018; Torres et al., 2018). A aplicação intravenosa de células-tronco é considerada um procedimento não invasivo, e as células possuem a capacidade de atingir o local da injúria, dispensando a cirurgia para aplicação intralesional; assim, evita-se uma nova exposição e lesão na medula espinhal (Osaka et al., 2010; Han et al., 2015HAN, D.; WU, C.; XIONG, Q. et al. Anti-inflammatory Mechanism of bone marrow mesenchymal stem cell transplantation in rat model of spinal cord injury. Cell Biochem. Biophys., v.71, p.1341-1347, 2015.; Ohta et al., 2017OHTA, Y.; HAMAGUCHI, A.; OOTAKI, M. et al. Intravenous infusion of adipose-derived stem/stromal cells improves functional recovery of rats with spinal cord injury. Cytotherapy, v.19, p.839-848, 2017.).

Figura 3
Avaliação da função locomotora em campo aberto ao sétimo dia pela escala de BBB em ratos Wistar . A) Animal do grupo CN, classificado no escore 21: observa-se sustentação de peso nos membros torácicos e pélvicos, com estabilidade do tronco e cauda elevada. B) Animal do grupo CP, classificado no escore 0 a 1: nenhum movimento observável a movimento discreto de uma a duas articulações do membro pélvico. C) Animal do grupo CTM-MO, classificado no escore 20: observa-se sustentação de peso nos membros torácicos e pélvicos, com instabilidade do tronco, e cauda elevada (esta última não observável na imagem).

Tabela 2
Valores medianos do escorre BBB de avaliação da função locomotora de ratos Wistar submetidos à laminectomia (CN) e a trauma medular associado aos tratamentos com PBS estéril (CP), ω-conotoxina (MVIIC), células-tronco mesenquimais da medula óssea (CTM-MO) e sua associação (CTM-MO + MVIIC).

Figura 4
Representação gráfica da mediana do escore BBB de avaliação da função locomotora em campo aberto, durante os sete dias, de ratos Wistar submetidos à laminectomia (CN) e a trauma medular associado aos tratamentos com PBS estéril (CP), ω-conotoxina (MVIIC), células-tronco mesenquimais da medula óssea (CTM-MO) e sua associação (CTM-MO + MVIIC). Letras minúsculas diferem entre si pelo teste de Kruskal-Wallis (P<0,05).

O grupo MVIIC + CTM-MO apresentou os escores BBB mais altos em relação aos outros grupos, evidenciando que houve sinergia entre as terapias, o que favoreceu a recuperação neurológica, comprovada pela não diferença estatística entre esse grupo e o controle negativo. A melhora da função motora poderia ser pela ação da conotoxina no bloqueio dos CCVD, que diminuiu os efeitos deletérios da lesão secundária, e das células-tronco, que teriam agido na regeneração do tecido medular lesionado.

CONCLUSÕES

O tratamento proposto com a administração ω-conotoxina MVIIC associada às células-tronco mesenquimais da medula óssea promoveu rápida recuperação da função locomotora após o trauma medular agudo experimental em ratos Wistar.

AGRADECIMENTOS

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pela bolsa de estudos; à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes) e à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (Fapemig), pelo auxílio financeiro do projeto.

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Datas de Publicação

  • Publicação nesta coleção
    27 Nov 2020
  • Data do Fascículo
    Nov-Dec 2020

Histórico

  • Recebido
    31 Dez 2019
  • Aceito
    10 Jul 2020
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