Efeitos da escarificação química e da concentração de nitrogênio sobre a germinação e o desenvolvimento in vitro de Vanilla planifolia Jack ex Andr. (Orchidaceae: Vanilloideae)

Effect of chemical scarification and concentration of nitrogen on the germination and in vitro development of Vanilla planifolia Jack ex Andr. (Orchidaceae: Vanilloideae)

ARTIGOS

Efeitos da escarificação química e da concentração de nitrogênio sobre a germinação e o desenvolvimento in vitro de Vanilla planifolia Jack ex Andr. (Orchidaceae: Vanilloideae)

Effect of chemical scarification and concentration of nitrogen on the germination and in vitro development of Vanilla planifolia Jack ex Andr. (Orchidaceae: Vanilloideae)

Cristiano Pedroso-de-Moraes^I,*; Thiago de Souza-Leal^I; Alan Rodrigo Panosso^II; Marcelo Claro de Souza^III

^ICentro Universitário Hermínio Ometto, Araras, SP, Brasil

^IIUniversidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Jabotical, SP, Brasil

^IIIUniversidade Estadual Paulista, Departamento de Botânica, Rio Claro, SP, Brasil

RESUMO

Vanilla planifolia é uma espécie com grande valor comercial, porém sua propagação é dificultada devido à baixa germinação de suas sementes. No presente estudo procurou-se avaliar a influência da escarificação destas sementes por meio da imersão em H₂SO₄ concentrado durante 60, 120 e 180 segundos, bem como de diferentes concentrações de nitrogênio sobre a germinação e o desenvolvimento das plântulas. Sessenta segundos de escarificação e 25% de nitrogênio no meio de cultura proporcionaram os melhores resultados sobre a germinação e desenvolvimento de V. planifolia, constituindo-se em um procedimento viável para a produção comercial dessa espécie.

Palavras-chave: Baunilha, orquídea, sementes, propagação in vitro

ABSTRACT

Vanilla planifolia is a species with a large commercial value; however, it is difficult to propagate due to low seeds germination. In the present study we aimed to evaluate the influence of scarification of the seeds by soaking them in concentrated H₂SO₄ for 60, 120 and 180 seconds, as well as different concentrations of nitrogen, on germination and plant development. Sixty seconds of scarification and 25% nitrogen in the culture medium provided the best results for germination and is a viable procedure for the commercial production of this species.

Key words:In vitro propagation, orchid, seeds, Vanilla

Introdução

Baunilheira é o nome popular dado a diversas espécies do gênero Vanilla Plum. ex Mill., nas quais o desenvolvimento inicial de seus representantes ocorre como ervas sarmentosas, que posteriormente adquirem o hábito hemiepífito. Os caules das espécies apresentam-se cilíndricos, suculentos, nodosos e podem atingir até 20 m de comprimento, encontrando-se sempre fortemente fixados a seus forófitos por meio de inúmeras raízes adventícias (Hoehne 1945).

No Brasil, Vanilla planifolia Jacks. ex Andrews representa grande potencial econômico, devido à qualidade e o elevado teor de vanilina produzida em seus frutos (Pedroso-de-Moraes & Fontana 2005; Kalimuthu et al. 2006), bem como ao fato de vários pontos do Brasil apresentarem condições edafoclimáticas favoráveis para sua produção e possível exportação (Bicalho 1969). O aroma de baunilha, ou seja, a vanilina é obtido da planta na forma de gluco-vanilina, na proporção de 2% em peso. A fonte natural da gluco-vanilina, o fruto da baunilha, atualmente fornece 20 das 12.000 toneladas consumidas anualmente, o equivalente a cerca de 0,2% da produção nacional (Berger 2000). Apesar da produção de baunilha representar um processo trabalhoso e de alto custo, apresenta-se rentável, uma vez que a vanilina de extrato natural chega a atingir US$ 4.000 por kg no mercado mundial (Daugsch & Pastore 2005).

Os frutos maduros desta espécie são cápsulas siliquiformes de coloração pardo-escura (pré-secagem) ou preta (pós-secagem), suculentas e úmidas ao tato, contendo milhares de sementes pequenas e pretas (Corrêa 1984), de diferentes tamanhos, mas com semelhante potencial germinativo e de desenvolvimento (Arditti & Ernest 1992). Apesar de pequenas, tais sementes enquadram-se entre as maiores dentro das Orchidaceae, podendo ser contadas à vista desarmada (Kalimuthu et al. 2006).

A propagação da baunilheira, em âmbito mundial é realizada por estaquia, pois a germinação de sementes de Vanilla spp., assim como da grande maioria das Orchidaceae, é extremamente baixa ou quase nula em condições naturais (Kalimuthu et al. 2006). Não obstante, para orquídeas em geral, podem ser obtidas elevadas taxas de germinação quando germinadas assimbioticamente desde que em meios de cultura adequados (Pedroso-de-Moraes et al. 2009a; b).

Pesquisas sobre a germinação assimbiótica de espécies de Vanilla spp. (Knudson 1950; Lugo 1955; Knorr et al. 1997), indicam a existência de dois fatores limitantes à germinabilidade e desenvolvimento das mesmas: a permeabilidade do tegumento e a concentração de sais nitrogenados nos meios. Contudo, na literatura, tais fatores não foram estudados de forma conjunta, demonstrando a necessidade da realização de trabalhos envolvendo escarificação e diminuição nas concentrações de sais nitrogenados conjuntamente, visando à otimização de produção destas plantas.

O presente trabalho teve como objetivo avaliar a viabilidade da utilização da escarificação química de sementes de Vanilla planifolia, bem como a redução da concentração de nitrogênio no meio de cultura visando à produção de mudas da espécie.

Material e métodos

Em abril de 2009, cinco flores de diferentes indivíduos de Vanilla planifolia cultivados sob tela de sombreamento 50%, temperatura de 25 ± 2 ºC e intensidade luminosa de 236 µmol.m^-2.s^-1, em casa de vegetação do Centro Universitário Hermínio Ometto - Uniararas, Araras, São Paulo, foram autopolinizadas e suas sementes foram coletadas após seis meses.

Sementes de Vanilla planifolia intactas (controle) e escarificadas em diferentes períodos de exposição ao ácido sulfúrico concentrado (60, 120 e 180 segundos) (Tab. 1), foram pré-embebidas em água destilada por 24 horas.

Posteriormente, foram lavadas em água corrente por três vezes e desinfestadas utilizando hipoclorito de sódio a 5% com duas gotas de detergente comercial, sob agitação durante cinco minutos em tubos Eppendorf^®. Em seguida, os tubos contendo as sementes foram mergulhados em álcool 70% e levados à câmara de fluxo laminar, onde foram lavadas em água destilada autoclavada por quatro vezes com o auxílio de seringa de 1 mL esterilizada (Arditti & Ernst 1992).

Em ambiente estéril, as sementes foram depositadas, juntamente com 1 mL de água destilada autoclavada, em placas de Petri (12 cm), como descrito por Arditti & Ernest (1992), as quais continham o meio de cultura MS (Murashige & Skoog, 1962) em sua formulação original e com modificações quanto à concentração de seus sais nitrogenados: nitrato de amônia (NH₄NO₃) e nitrato de potássio (KNO₃). Estes aparecem no meio de cultura em concentrações de 20 mg.L^-1 na formulação original (100%), alterando-se, portanto, para 10 mg.L^-1 quando reduzidos pela metade (50%) e 5 mg.L^-1 reduzidos a 1/4 da formulação original (25%). As placas semeadas foram mantidas em câmara climatizada tipo B.O.D., por 120 dias a 25 ± 2ºC no escuro, devido a essa espécie ser fotoblástica negativa (Lugo 1955).

O monitoramento diário da germinação foi realizado sob luz verde de segurança, sendo consideradas germinadas as sementes que apresentaram folhas a partir de protocormos visíveis "a olho nu". Os dados obtidos foram utilizados para o cálculo da germinabilidade (G%) e índice de velocidade de germinação (IVG) (Labouriau & Agudo 1987). O delineamento experimental utilizado foi do tipo inteiramente casualizado com quatro repetições de 250 sementes cada, compondo assim esquema fatorial 4x3 com quatro repetições.

Na segunda etapa, foi avaliado o desenvolvimento de plântulas a partir das sementes germinadas nos diferentes tratamentos da primeira etapa. Em ambiente estéril, sessenta plântulas por tratamento foram transferidas aleatoriamente para quatro recipientes de vidro esterilizados, com volume de 250 mL contendo 50 mL do mesmo meio de cultura utilizado durante a germinação, totalizando, assim, 15 plântulas por frasco (Pedroso-de-Moraes et al. 2009a,b). Estes foram fechados com tampa plástica transparente e mantidos em B.O.D. a 25 ± 2 ºC e fotoperíodo de 16 horas sob intensidade luminosa de aproximadamente 40 µmol.m^-2s^-1 por 120 dias.

Foram avaliados os seguintes parâmetros morfológicos: altura das plântulas (AP), número de raízes (NR), matéria fresca (MF) e matéria seca (MS) total, comprimento da maior raiz (CR) e da maior folha (CF). Os dados obtidos no experimento foram submetidos à análise de variância pelo teste F e, para comparação das médias, utilizou-se o teste Tukey a 5% de probabilidade, sendo utilizada a transformação em Asen para as avaliações referentes ao percentual germinativo (Zar 1999).

Resultados e discussão

De modo geral, todas as características avaliadas apresentaram resultados semelhantes, sendo os melhores verificados no tratamento representado pelo menor período de escarificação, associado à menor concentração de sais nitrogenados (NH₄NO₃ e KNO₃) em meio de cultura MS (5 mg.L^-1 ou 25% da formulação original) para desenvolvimento das plântulas (Tab. 2).

Em relação ao percentual germinativo foi observado um máximo de 64% para 60 segundos de escarificação em HSO₄ associada a 25% de NH₄NO₃ e KNO₃ no meio, diferindo significativamente dos demais tratamentos, bem como o menor percentual (6,5%) foi obtido pela escarificação por 180 segundos e a totalidade de sais nitrogenados no meio de cultura (20 mg.L^-1). Os testes envolvendo apenas pré-embebição das sementes de Vanilla planifolia em água destilada por 24h, seguido por semeadura em meio MS a 100, 50 e 25% da concentração de sais nitrogenados, obtiveram percentuais germinativos de 5%, sugerindo que o H₂SO₄ tanto pode interferir de forma positiva como negativa sobre a germinação das sementes dessa espécie, dependendo do tempo de exposição.

É amplo o uso de ácidos em experimentos de germinação de sementes das mais variadas espécies (Medeiros-Filho et al. 2005; Alves et al. 2007; Dutra et al. 2007; Dutra & Medeiros-Filho 2009). Porém, esse método, mesmo em baixas concentrações, pode não ser eficiente para a superação de dormência em algumas espécies vegetais, em razão de alguns tegumentos apresentarem certa porosidade, o que permite a absorção rápida dos ácidos, causando efeito deletério ao embrião (Alvarenga et al. 2007) como observado em Chrysophyllum albidum G. Don., no qual foi verificada uma relação inversamente proporcional entre o período de exposição ao ácido sulfúrico associado ao aumento de sua concentração e o percentual germinativo, sendo que maiores concentrações e tempos de exposição ao ácido, geraram menores percentuais germinativos, devido às lesões ocorridas nos embriões (Aduradola et al. 2005).

São escassos na literatura trabalhos envolvendo a escarificação e a germinação de sementes de plantas epífitas. Contudo, os resultados obtidos neste trabalho (Tab. 2) corroboram os observados em sementes de Dyckia encholirioides var. encholirioides (Gaud.) Mez. (Pompelli 2006), Bromelia laciniosa Mart. ex Schult. f. (Angelim et al. 2007), Echinopsis rhodotricha Schütz e Echinopsis calochlora K. Schumann (Alcântara et al. 2008; Yule & Dias 2009), nas quais o aumento do período de exposição ao ácido sulfúrico resultou na redução da germinabilidade devido às lesões causadas aos embriões pela permeabilidade concedida pela delgada espessura dos tegumentos das sementes destas espécies e de V. planifolia (Porras-Alfaro & Bayman 2007).

Em meios nutritivos utilizados para germinação e crescimento, são incluídos os mais exigidos elementos minerais pelas plantas, sendo tais elementos utilizados na forma de sais inorgânicos, podendo o nitrogênio ser adicionado como componente de suplementos orgânicos (Caldas et al. 1998), pois tal elemento contribui de forma efetiva tanto no metabolismo celular como na regulação do seu potencial osmótico sendo o principal componente em quantidade de meios de cultura (Nagao et al. 1994).

Em condições naturais, as orquídeas epífitas encontram sua pequena fonte de nutrientes na atmosfera, podendo resultar de deposição seca ou úmida. No último caso, os nutrientes ficam disponíveis às plantas por meio da água de chuva, da água de gotejamento, isto é, aquela que atravessa o dossel, e da água de escorrimento do caule, sendo que o nitrato e o amônio, oriundos do escorrimento do caule, são as principais fontes de nitrogênio para as epífitas (Endres & Mercier 2000).

O desenvolvimento é influenciado pela disponibilidade de nitrogênio e pela forma como o mesmo é fornecido (George & Sherrington 1984). Dessa forma, altas concentrações de amônio (NH₄⁺) e nitrato (NO₃^-) podem ser críticas no processo de crescimento de plântulas (Sakuta et al. 1987), sendo que tais constatações estão relacionadas com a própria função metabólica do nitrogênio, como constituinte de aminoácidos, enzimas e proteínas. No presente trabalho os tratamentos contendo 25% de sais nitrogenados pelo meio MS, apresentaram os maiores percentuais germinativos assim como observado para Cattleya loddigesii Lindl., onde a diminuição do N total em meio de cultura WPM para 1/3, foi responsável pelo aumento na produção de plântulas germinadas in vitro (Araújo et al. 2009).

Outras características importantes a serem avaliadas, levando em consideração o vigor das plântulas, mediante propagação in vitro para produção de mudas comerciais, seriam as características visuais do produto como altura das plântulas, comprimento foliar e radicular e número de raízes, características essas que foram severamente comprometidas ao cultivar essas plântulas no meio MS nas concentrações de 50 e 100% de sais nitrogenados, sugerindo que a espécie apresenta algum tipo de inibição no seu desenvolvimento quando expostas a elevadas concentrações de N, devido a alterações nos mecanismos responsáveis pela formação de massa seca e acúmulo de água para formação da massa fresca (Tab. 2), assim como observado para Vanilla fragrans (Salisb.) Ames (Knudson 1950) e V. planifolia (Lugo 1955), germinadas em meio Knudson B o qual apresenta menores concentrações de sais nitrogenados que o meio MS (Murashige & Skoog 1962). Contudo, mesmo que o meio MS tenha sido desenvolvido inicialmente para o uso em cultivo de tecido de tabaco, o mesmo tem sido muito efetivo como substrato nutritivo para muitas espécies de orquídeas. Este meio apresenta altos níveis de nitrogênio em relação a outros meios utilizados para o cultivo in vitro de orquídeas, além de possuir menor percentual de nitrato de amônio em relação a outros meios de cultivo (Rodríguez et al. 2005). Apesar dos bons resultados em germinação e regeneração (Knudson 1946; George et al. 1987; Griesbach 2002) na utilização do meio de cultivo MS ainda não foram padronizadas as concentrações ideais para os muitos genótipos existentes (Krikorian 1991). A avaliação do desenvolvimento do sistema radicular de Cattleya nobilior Reichb. f. e das bromélias Pitcairnia flammea Lindl. e Vriesea philippocoburgii Wawra constataram que em concentrações decrescentes de sais nitrogenados o desenvolvimento do sistema radicular de tais espécies foi favorecido (Mercier & Kerbauy 1991; Araújo et al. 2005), assim como observado para V. planifolia neste trabalho (Tab. 1, 2) onde os melhores resultados foram obtidos pela escarificação por 60 segundos e 25% da carga de sais nitrogenados no meio de cultura (5 mg.L^-1).

Quanto às variáveis, altura das plantas (AP), comprimento da maior folha (CF), peso da matéria fresca (MF) e peso da matéria seca (MS) os resultados obtidos podem ser explicados pela existência de uma relação quadrática explicitada no desenvolvimento de plântulas ocorrente em meios de cultivo com relação às fontes de nitrogênio nítrico e amoniacal. O aumento da concentração de nitrogênio nítrico e a diminuição da de nitrogênio amoniacal, gera incremento quadrático principalmente na variável biométrica altura de plântulas (Bernardi et al. 2004). O mesmo foi observado em pesquisas envolvendo orquídeas terrícolas do gênero Cymbidium, nas quais foram constatadas que doses diferentes das duas fontes de nitrogênio, principalmente dosagens decrescente de nitrogênio amoniacal, influenciaram positivamente no desenvolvimento de AP, CF, MF e MS (Wen & Hew 1993; Pan & Chen 1994; Powell et al. 1988).

Muitas espécies de orquídeas apresentam alterações no padrão vegetativo pela ação de diferentes concentrações de nitrogênio, podendo influenciar significativamente a síntese de citocininas endógenas, como observado para Epidendrum fulgens Brongn. (Mercier & Kerbauy 1991). Para a orquídea Cattleya cinnabarina (Bateman ex Lindl.) Van der Berg em trabalho envolvendo diferentes composições de meio de cultivo, foram observados resultados satisfatórios no cultivo in vitro em meio MS a 50% da concentração de macronutrientes (Stancato & Faria 1996). O mesmo foi observado para Catasetum fimbriatum Lindl., onde os maiores índices de matéria fresca, matéria seca, e comprimento de plântulas se deram pela utilização de meio de cultivo MS a 50% da concentração de macronutrientes em comparação aos meios à base de fertilizantes NPK (Rego-Oliveira & Faria 2005), assim como observado para as mesmas variáveis analisadas neste trabalho para o meio de cultivo MS a 50% da concentração de sais nitrogenados (Tab. 2). E para Oncidium baueri Lindl. as análises biométricas relativas à altura da parte aérea indicaram melhores resultados com a utilização do meio de cultivo MS a 50% da concentração de macronutrientes, com adição de 40 g.L^-1 de sacarose (Sorace et al. 2008), resultado semelhante ao encontrado neste trabalho para as variáveis comprimento da parte aérea (CPA) e comprimento da maior folha (CMF).

Nesse ínterim, vale citar que a redução do KNO₃ leva, além do nitrogênio, também a diminuição da quantidade de potássio, nutriente essencial aos vegetais, fator que pode prejudicar o desenvolvimento das plântulas. Pasqual (2001) sugere que há uma correlação entre esse elemento e o fósforo e Malavolta et al. (1997) afirma que a absorção de um dado nutriente pode ser influenciada por outro, sendo que a deficiência no meio de cultura conduz a hiperidricidade e ao decréscimo na taxa de absorção de fosfato. Porém, o meio MS é conhecido por conter altas taxas de potássio (Rodríguez et al. 2005), e oferece como fontes deste, além do KNO₃, outros dois sais: KH₂PO₄ e KI, sendo que nenhum destes teve suas concentrações alteradas no presente estudo. Diante disso, possivelmente o KH₂PO₄ e KI foram suficientes para suprir satisfatoriamente as necessidades das sementes e plântulas de V. planifolia, uma vez que a melhor concentração para tal espécie foi aquela com 25% da concentração total de KNO₃ e NH₄NO₃.

Conclusão

A escarificação de sementes de Vanilla planifolia com ácido sulfúrico concentrado durante 60 segundos, associada à presença de 5 mg.L^-1 de sais nitrogenados no meio MS (25% da carga total) proporcionou os melhores resultados de germinabilidade, velocidade de germinação e crescimento, constituindo assim em um processo factível para aumentar a produção comercial desta espécie de orquídea.

Recebido em 11/10/2011

Aceito em 19/06/2012

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  30 Out 2012
• Data do Fascículo
  Set 2012

Histórico

• Recebido
  11 Out 2011
• Aceito
  19 Jun 2012