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Revista Brasileira de Ortopedia

Print version ISSN 0102-3616

Rev. bras. ortop. vol.46 no.4 São Paulo  2011

https://doi.org/10.1590/S0102-36162011000400017 

ARTIGO ORIGINAL

 

Caracterização físico-química do enxerto de osso bovino liofilizado

 

 

Carlos Roberto GaliaI; André Luis LourençoII; Ricardo RositoIII; Carlos Alberto Souza MacedoIV; Lourdes Maria Araujo Quaresma CamargoV

IMédico do Grupo do Quadril; Coordenador Técnico do Banco de Tecidos do HCPA; Mestre em Cirurgia pela UFRGS - Porto Alegre, RS, Brasil
IIMédico Ortopedista e Traumatologista; Residente de Cirurgia da Mão do Hospital das Clínicas de Curitiba-UFPR - Curitiba, PR, Brasil
IIIMédico do Grupo do Quadril e Banco de Tecidos do HCPA - Porto Alegre, RS, Brasil
IVProfessor Adjunto do Departamento de Cirurgia da Faculdade de Medicina da UFRGS e Serviço de Ortopedia e Traumatologia do HCPA; Chefe do Serviço de Ortopedia e Traumatologia do HCPA; Chefe do Grupo do Quadril - Porto Alegre, RS, Brasil
VPesquisadora Convidada, Banco Tecidos HCPA - Porto Alegre, RS, Brasil

Correspondência

 

 


RESUMO

OBJETIVO: Avaliar as características físico-químicas do enxerto bovino liofilizado manufaturado em escala semi-industrial (OrthoGen, Baumer S/A*) de acordo com protocolo previamente desenvolvido pelos autores.
MÉTODOS: A caracterização do enxerto de osso bovino liofilizado foi feita por meio de microscopia eletrônica de varredura (MEV), energy dispersive spectroscopy (EDS), difratometria de raios-X, análise por termogravimetria, análise de calorimetria exploratória diferencial (DSC) e espectroscopia por infravermelho Fourier-transform (FT-IR).
RESULTADOS: Ca foi o principal componente (60%) encontrado nas amostras, seguido por P (28%) e O (5%). O tamanho médio (dp) dos poros foi 316µm (146,7), variando de 91,2 a 497,8µm, e 333,5µm (304,8), variando de 87,2 a 963,9µm com 50x e 150x magnificação, respectivamente. Picos de hidroxiapatita foram a 26ºC e 32ºC, e perda de massa foi observada entre 250ºC e 640ºC, correspondendo material orgânico e água. Duas transições de temperatura (45,67°C e 91,89°C) mostraram desnaturação de colágeno tipo I e desidratação da hidroxiapatita.
CONCLUSÃO: A avaliação físico-química do enxerto de osso bovino liofilizado, de acordo com o protocolo desenvolvido em escala semi-industrial, confirma que este produto apresenta excelente biocompatibilidade, com características semelhantes ao osso in natura.

Descritores: Materiais Biocompatíveis; Transplante Ósseo; Cirurgia Geral


 

 

INTRODUÇÃO

A utilização de enxertos ósseos em cirurgias ortopédicas, crânio-maxilo-faciais e odontológicas está cada vez mais difundida(1). O enxerto autólogo fresco permanece como padrão ouro devido a suas propriedades, como resposta imune e capacidades osteoindutora, osteocondutora e osteogênica. Porém, suas desvantagens, como o aumento do tempo cirúrgico, a pequena quantidade obtida e a morbidade associada a esse procedimento, têm limitado sua utilização(2,3).

O enxerto homólogo congelado também é muito utilizado e considerado excelente alternativa, uma vez que evita a morbidade relacionada ao sítio doador. Sua disponibilidade, entretanto, ainda é muito limitada em nosso meio e, embora raras, existem possibilidades de transmissão de doenças infectocontagiosas e tumorais relacionadas ao seu uso(4-6).

Dessa forma, biomateriais alternativos de natureza sintética ou natural e diferentes métodos de processamento e armazenamento de tecido ósseo têm sido propostos e exaustivamente estudados. Entre eles está o enxerto ósseo, de origem bovina, processado e liofilizado(7). O osso bovino possui disponibilidade praticamente ilimitada além de grande similaridade físicoquímica e estrutural com o humano(8).

Baseados nesses dados, os autores desenvolveram um protocolo de processamento de enxerto ósseo bovino integral medular liofilizado visando diminuir significativamente sua antigenicidade, além de alterar minimamente a sua composição em relação aos enxertos ósseos não processados(9). Os ossos in natura são constituídos, basicamente, de: uma matriz orgânica de colágeno tipo I contendo proteoglicanas de baixa massa molecular e proteínas não colágenas que correspondem a 25% do seu peso; uma parte mineral que corresponde a 65% e 10% de água(10,11). Para tanto, é fundamental a determinação das características físico-químicas do produto final processado para validação do protocolo desenvolvido.

O objetivo deste estudo é caracterizar as propriedades físico-químicas do osso bovino integral medular liofilizado, OrthoGen, por meio de microscopia eletrônica de varredura (MEV) energy dispersive spectroscopy (EDS), difratometria de raios-X, análise por termogravimetria, análise de calorimetria exploratória diferencial (DSC) e análise por infravermelho (FT-IR).

 

MATERIAL E MÉTODOS

Amostras

São amostras de OrthoGen, e que seguem basicamente as seguintes etapas: a matéria prima é submetida a processos físicos e químicos para remoção de agentes antigênicos, bacterianos, virais ou proteínas infecciosas. Os ossos são expostos a banhos sucessivos de agentes oxidantes, solventes orgânicos e soluções alcalinas. Após, são cortados em diversos formatos, liofilizados, embalados e esterilizados com irradiação gama.

Os ensaios relatados foram realizados no Centro de Qualidade Analítica (CQA) e Caracterização e Desenvolvimento de Materiais (CCDM-UFSCar/UNESP) e no Centro Tecnológico Tecno PUC/RS, em Porto Alegre.

Foram utilizadas as seguintes técnicas para caracterização da amostra de enxerto ósseo medular liofilizado em estudo: MEV/EDS, difração de Raios-x (DRX), análise termogravimétrica (TG), calorimetria exploratória diferencial (DCS) e análise por infravermelho (FT-IR).

Análise MEV/EDS

A análise via MEV/EDS permite a determinação da composição química (qualitativa e semiquantitativa) na superfície da amostra. As quantidades indicadas nas tabelas de microanálise por EDS são apenas semiquantitativas, servindo como um indicador das quantidades de cada elemento presente e não podem ser tomadas como análises quantitativas. Foram, ainda, medidos por essa técnica, os tamanhos dos poros da amostra e calculado seu tamanho médio.

Difratometria de Raios-X (DRX)

Esta técnica consiste em incidir um feixe de raios-X de comprimento de onda igual a 1,5418 Angstroms na amostra para o registro das fases cristalinas presentes. Através desse registro, pela determinação das intensidades das linhas de difração correspondentes às fases, é possível a determinação qualitativa das fases presentes. O equipamento utilizado para a caracterização foi o difratômetro de raios-X Siemens modelo Kristaloflex D500 operando com tubo de alvo de Cobalto seguindo a geometria de focalização de Bragg-Brentano. A base de procedimentos foi a IT-DRX-220 calibração do equipamento, IT-DRX-108 obtenção de figuras de pólo e/ou difratogramas(11,12).

Termogravimetria (TG)

Uma pequena quantidade de OrthoGen foi colocada em um suporte de amostra de alumina, onde sua massa é constantemente monitorada por uma termobalança. O resultado da análise é mostrado sob a forma de um gráfico cuja abscissa contém os registros de temperatura (ou tempo) e a ordenada, a massa residual.

A curva termogravimétrica (TG) e sua derivada em relação à temperatura (DTG) foram obtidas em um analisador térmico TA 2050 (TA Instruments). As amostras foram aquecidas a partir da temperatura ambiente (23°C) até 950°C, utilizando-se uma taxa de aquecimento de 20°C/min, em um suporte de alumina sob atmosfera dinâmica de nitrogênio (N2), com vazão de gás da ordem de 50mL/min(13).

Calorimetria exploratória diferencial (DSC)

Técnica termoanalítica na qual se mede a diferença de energia fornecida a uma substância e a um material de referência em função da temperatura, enquanto a substância e o material são submetidos a uma programação controlada de temperatura. As transições térmicas dos materiais ocorrem liberando (processos exotérmicos) ou absorvendo calor (processos endotérmicos). Desta forma, podem-se estudar as transições térmicas de materiais, tais como: temperatura de transição vítrea (Tg); temperatura de fusão (Tm); temperatura de cristalização (Tk), temperatura de oxidação. As curvas DSC foram obtidas utilizando suporte de amostra de alumínio tampado. As amostras foram aquecidas de -23°C até 250°C, a uma razão de aquecimento de 5°C min-1 e com dois aquecimentos. Os experimentos foram realizados sob atmosfera dinâmica de nitrogênio (N2), a uma vazão de 30mL min-1, utilizando um 822e da Mettler Toledo(14).

Espectroscopia no infravermelho (FT-IR)

Esta técnica consiste em incidir radiação eletromagnética correspondente à faixa do infravermelho (4.000 - 400cm-1) na amostra. A energia associada a estes comprimentos de onda, uma vez absorvida pela molécula, converte-se em energia de rotação-vibração molecular. Este fenômeno de absorção é extremamente quantizado e altamente dependente dos grupamentos químicos que estão presentes na amostra, demonstrando, dessa forma, sua estrutura. Foi utilizado um espectrofotômetro Nexus 4700 FTIR da Thermo Nicolet. Os espectros foram obtidos com 32 repetições, leitura de 4.000 a 400cm-1, e resolução igual a 4cm-1. À amostra foi incorporada uma pastilha de brometo de potássio (KBr) para esta análise(14).

A análise estatística foi feita pelo teste t de Student. Foi considerada significância p < 0,05 com 95% de intervalo de confiança.

 

RESULTADOS

MEV/EDS

Os resultados obtidos da composição química, de pontos aleatórios da superfície da amostra, via MED/EDS, estão apresentados na Tabela 1. A Figura 1 mostra as imagens da superfície da amostra obtidas via MEV. O tamanho dos poros está representado nas imagens de medidas na Figura 2, e seus respectivos resultados demonstrados na Tabela 2.

 

 

 

 

 

 

 

 

Difratometria de Raios-X (DRX)

A partir do espectro obtido, observou-se a presença dos picos característicos da hidroxiapatita, sendo o primeiro por volta de 26° e o segundo, 32°, em dois tempos, que são designados pela reflexão (002) e (211), respectivamente. A Figura 3 apresenta o espectro obtido para a amostra de enxerto ósseo analisada.

 

 

Termogravimetria (TG)

Os resultados obtidos pela termogravimetria da amostra analisada (Tabela 3) revelaram que a perda de massa inicial (22,8279mg) em temperatura ambiente e 250ºC, 250ºC e 640ºC, 640ºC e 950ºC, foi de 8,99%, 22,4% e 6,2%, respectivamente, que, juntamente com o DSC, apontam para uma perda inicial de água da amostra. O nível de resíduos estáveis a 950º foi 62,6%. A segunda perda de massa (22,4%) corresponde, provavelmente, à perda do material orgânico e de água estrutural. Já a terceira perda pode estar associada à decomposição térmica do carbonato da hidroxiapatita (Figura 4).

 

 

 

 

Calorimetria exploratória diferencial (DSC)

É possível observar a curva DSC obtida, tanto no primeiro quanto no segundo aquecimento. No primeiro aquecimento, há três transições térmicas distintas: a 45,67°C, 91,89°C e 125,89°C. A primeira temperatura de transição observada foi (45,67°C) provavelmente correspondente à temperatura de desnaturação do colágeno tipo I. O grande pico endotérmico a 91,89°C está associado à perda de água da hidroxiapatita, sendo isso corroborado pela inexistência deste pico endotérmico durante o segundo aquecimento (Figura 5).

 

 

Espectroscopia no infravermelho (FT-IR)

O espectro no infravermelho da amostra de enxerto ósseo na região de 4.000cm-1 a 400cm-1 está demonstrado na Figura 6, na qual estão indicadas as principais bandas (picos) observadas.

 

 

Bandas características foram identificadas para os grupos de fosfato de hidroxiapatita (entre 600 e 1.100), para colágeno - deformação axial da cadeia C=O e deformação angular das cadeias N-H e C-N -, e moléculas estruturais de água.

A Tabela 4 apresenta a descrição das bandas destacadas e numeradas da esquerda para direita na Figura 6. As bandas de absorção encontradas e apresentadas na Tabela 4 são as esperadas para compostos a base de colágeno e hidroxiapatita.

 

 

DISCUSSÃO

A estrutura microscópica do enxerto ósseo Baumer - Integral (OrthoGen), analisada por MEV/EDS, revelou que o produto apresenta estrutura típica de osso medular com poros interconectados, e que, após o processo físico-químico ao qual a matéria prima é submetida para fabricação, foi possível manter a estrutura característica desse tipo de tecido. A presença dos poros e a manutenção da estrutura cristalina trabeculada do osso são fatores fundamentais para sucesso dos fenômenos celulares de deposição de células osteoprogenitoras sobre o enxerto, reabsorção do mesmo e formação de osso novo no lugar(15,16).

Alguns autores relataram as mesmas observações quanto à estrutura microscópica, tanto para produtos comerciais submetidos a processos térmicos de desproteinização quanto BioOss ou GenOx Inorg(10,11,17) ou submetidos a processamentos físico-químicos não envolvendo tratamentos a altas temperaturas como TutoPlast bovine, Tutobone ou TutoPlast human(17), bem como para produtos não comerciais submetidos a processos físico-químicos de limpeza e purificação OBM(10) ou Kiel bone(17).

A análise com EDS, acoplada ao MEV, permitiu determinar a composição química qualitativa e semiquantitativa na superfície da amostra. Com a técnica de EDS, analisando três regiões diferentes da mesma amostra, observa-se a homogeneidade do material. Pelo resultado apresentado, observa-se que há uma distribuição homogênea da fase química do produto, tendo sido detectada a presença dos elementos Alumínio, Cloro e Sódio em quantidades muito baixas. Os elementos Oxigênio, Carbono e os minerais Ca e P foram encontrados em teores esperados para material derivado de tecido ósseo não submetido a processo de desmineralização. Os resultados obtidos estão de acordo com os relatados por outros autores para produtos derivados de tecido ósseo de origem humana ou bovina não submetidos a processos de desmineralização(10).

Foi determinada a porcentagem e tamanho dos poros a partir das análises obtidas no MEV. O tamanho médio dos poros foi 316µm (146,7µm), variando de 91,2 a 497,8µm, e 333,5µm (304,8µm), variando de 87,2 a 963,9µm com 50x e 150x magnificação, respectivamente (Tabela 2)(17,18).

O estudo de difração de raios-X foi utilizado para determinar a composição química do OrthoGen, sendo indicativo da presença de diferentes fases na amostra, da pureza do material e do percentual de cristalinidade(17,19,20). Existem diversos sistemas que permitem determinar o pico produzido por um dado elemento e o localizar na amostra em teste, produzindo, assim, um mapa de sua distribuição. Há uma relação entre a largura do pico e a cristalinidade da amostra, sendo que amostras mais cristalinas apresentam picos mais estreitos, enquanto que a caracterização se faz pela localização dos picos característicos para cada componente.

Os espectros obtidos nas amostras de OrthoGen (Figura 3) apresentaram picos principais referentes à hidroxiapatita. O primeiro estando a cerca de 26°2θ e o segundo a 32°2θ, denotando que o processo de produção permite a manutenção da fase mineral característica do tecido ósseo original, com menor cristalinidade e similar ao apresentado para outros substitutos de osso derivados de osso natural que não são submetidos a tratamento térmico ou desmineralização durante o processo de fabricação/produção.

No estudo realizado por Tadic e Epple(17), foram caracterizados diversos tipos de substitutos de osso de origem sintética ou natural. Quanto à determinação da fase mineral, o pico característico da hidroxiapatita localizado ao redor de 32°2θ foi detectado em todas as amostras estudadas, estando presente, com maior ou menor pureza ou grau de cristalinidade, tanto nos produtos comerciais de origem bovina (BioOss®, Endobon®, Cerabone® e Tutoplast bovine®) ou de origem humana (Tutoplast human®) quanto nas amostras de Kiel bone (enxerto ósseo de origem bovina tratado com mistura de solventes orgânicos e agentes oxidantes) e nas amostras de calo ósseo ou osso tumoral humanos. Em relação aos produtos estudados que são submetidos a diferentes processos de fabricação, essa informação pode ser utilizada como uma forma de avaliar a eficiência do processamento na manutenção das características químicas funcionais da matéria prima após processamento. Na determinação da cristalinidade das fases minerais através de difração de raios-X, para os produtos de origem bovina Cerabone® e Endobon®, por serem processados termicamente (calcinados) à alta temperatura, apresentam característica de hidroxiapatita altamente cristalina. A rapidez na reabsorção está relacionada com a cristalinidade dessa cerâmica, sendo que quanto mais cristalina mais lentamente reabsorvida será(10). Para o produto BioOss® foi observado padrão de cristalinidade intermediária, e para os produtos TutoPlast® bovine ou human foi observado padrão mais amorfo ou presença de cristais de pequeno tamanho, o que é denotado pela presença de picos mais largos e com menor intensidade, embora característicos.

Mendonça(10) avaliou a fase mineral e a cristalinidade de produtos comerciais BioOss®, GenOx Inorg® e amostras de OBM - osso bovino processado com agente oxidante e agente desnaturante, liofilizado e esterilizado com radiação gama que apresenta composição similar ao osso humano: 60-70% mineral/40-30% orgânico e água. Foram observados, para todos os produtos, picos característicos da hidroxiapatita a 32° 2θ. BioOss e OBM apresentaram picos mais largos, o que pode estar associado à presença de cristais em dimensões nanométricas, presença de defeitos na estrutura e baixa cristalinidade do pós-formado. Os resultados apresentados para o OBM são similares aos obtidos para o enxerto ósseo bovino liofilizado utilizado nesta pesquisa, indicando um padrão de cristalinidade bem menor em relação ao apresentado pelos produtos que foram submetidos a alta temperatura durante o processo de fabricação.

Foi determinado o perfil termogravimétrico (TG) de amostras de OrthoGen. A determinação do perfil termogravimétrico permite avaliar a perda ou ganho de massa da amostra em função do aquecimento, enquanto a amostra é submetida a uma programação controlada de temperatura. É uma técnica essencialmente quantitativa que também apresenta informações sobre a estabilidade do material ao calor, o que pode ser traduzido em informações sobre propriedades como decomposição de um material de composição proteica e mineral.

A massa inicial da amostra foi de 22,8270mg. Houve uma perda de massa inicial da ordem de 8,99% (2,052mg) entre a temperatura ambiente e 205ºC que, juntamente com o DSC, indicam uma perda inicial de água. Uma segunda perda ocorre entre 205ºC e 640ºC, equivalendo a 22,4% (5,07mg) e provavelmente correspondendo à perda de material orgânico e água residual. Há uma terceira perda aos 640ºC e que se estende até a temperatura final de 950ºC equivalente a 6,2% (1,04mg) do material inicial, que pode estar relacionada com a perda do carbonato de hidroxiapatita havendo um resíduo final de 62,6% (14,29mg), provavelmente material inorgânico estável até 950ºC. Esses resultados indicam a natureza orgânica e mineral do produto similar à do tecido ósseo integral(12).

A calorimetria exploratória diferencial (DSC) é uma das técnicas de análise térmica utilizada para caracterização de diferentes tipos de produtos quanto às mudanças frente ao calor. Nessa técnica é possível acompanhar a variação de energia (diferença de energia) entre a amostra e um material de referência, enquanto ambos são aquecidos ou resfriados de acordo com uma programação controlada de temperatura. O caráter dos picos, endotérmicos ou exotérmicos, pode variar de acordo com a natureza do fenômeno que se deseja estudar. Fenômenos químicos, como temperatura de degradação oxidativa ou decomposição, são informações importantes quando se faz a caracterização de um produto que possui composição proteica. A identificação dos componentes presentes na amostra se faz através da comparação do comportamento dos picos encontrados com as informações de referência dos grandes grupos de macromoléculas ou materiais, como é o caso do colágeno do tipo I ou hidroxiapatita, que se procura identificar em um material de enxerto. A primeira temperatura de transição observada ao redor dos 45ºC pode ser considerada a temperatura de desnaturação do colágeno tipo I presente na amostra. O grande pico endotérmico, observado aos 91ºC, provavelmente está associado à perda de água da hidroxiapatita, sendo esse dado corroborado pela inexistência desse pico endotérmico durante a segunda exposição da amostra ao calor(10).

A espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier (FTIR) é considerada a ferramenta mais clássica para identificação de tipos de ligações químicas, sendo os comprimentos de ondas de 4.000-1.500 obtidos tipicamente devido à presença de grupos funcionais conhecidos como -OH, C=O, N-H, CH3. Nesta técnica incide-se radiação eletromagnética correspondente à faixa do infravermelho (ondas de luz entre 4.000-400/cm) e mede a absorção de várias ondas de luz infravermelha pelo material de interesse. As bandas de absorção de infravermelho identificam estruturas e componentes moleculares específicos. Foram identificadas bandas características para grupamentos fosfato da hidroxiapatita (de 600 a 1.100), para colágeno (como a deformação axial da ligação C=O, onda 1.654, e deformação angular da ligação N-H e estiramento C-N, onda 1.559), e ainda para moléculas de água estruturais ou adsorvidas na amostra (onda 3.427).

No estudo de Tadic e Epple(17), no qual foram caracterizados diversos materiais de enxerto comerciais ou não, os resultados obtidos para os enxertos ósseos de natureza parcialmente mineral ou parcialmente orgânica, como o Tutoplast® bovine e Kiel bone, assemelham-se aos obtidos para o material analisado no presente estudo. Foram encontrados os grupamentos correspondentes a colágenos e compostos orgânicos em quantidades variáveis, porém com bandas características nos números de onda de 1.560 a 3.000. Além das bandas características para os grupamentos fosfato, diversas bandas foram observadas referentes ao material orgânico e água incorporada(17).

 

CONCLUSÃO

As características físico-químicas estudadas no enxerto ósseo bovino liofilizado (OrthoGen - Baumer) confirmam um produto de excelente qualidade, apresentando características de acordo com as normas sugeridas na literatura, além de demonstrar similaridade com outros enxertos ósseos processados e amplamente utilizados.

 

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Correspondência:
André Luis Lourenço
Rua Ramiro Barcelos, 2.350, Bairro Rio Branco
90035-903 - Porto Alegre, RS
E-mail: alalourenco@ig.com.br

Trabalho recebido para publicação: 27/07/2010, aceito para publicação: 23/12/2010.

 

 

Trabalho realizado no Hospital de Clinicas de Porto Alegre - RS, Brasil
Os autores declaram inexistência de conflito de interesses na realização deste trabalho / The authors declare that there was no conflict of interest in conducting this work

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