Regeneração de nervos periféricos: terapia celular e fatores neurotróficos

Resumos

Peripheral nerve trauma results in functional loss in the innervated organ, and recovery without surgical intervention is rare. Many surgical techniques can be used for nerve repair. Among these, the tubulization technique can be highlighted: this allows regenerative factors to be introduced into the chamber. Cell therapy and tissue engineering have arisen as an alternative for stimulating and aiding peripheral nerve regeneration. Therefore, the aim of this review was to provide a survey and analysis on the results from experimental and clinical studies that used cell therapy and tissue engineering as tools for optimizing the regeneration process. The articles used came from the LILACS, Medline and SciELO scientific databases. Articles on the use of stem cells, Schwann cells, growth factors, collagen, laminin and platelet-rich plasma for peripheral nerve repair were summarized over the course of the review. Based on these studies, it could be concluded that the use of stem cells derived from different sources presents promising results relating to nerve regeneration, because these cells have a capacity for neuronal differentiation, thus demonstrating effective functional results. The use of tubes containing bioactive elements with controlled release also optimizes the nerve repair, thus promoting greater myelination and axonal growth of peripheral nerves. Another promising treatment is the use of platelet-rich plasma, which not only releases growth factors that are important in nerve repair, but also serves as a carrier for exogenous factors, thereby stimulating the proliferation of specific cells for peripheral nerve repair.

Peripheral Nerve System; Regenerative Medicine; Nerve Regeneration

ARTIGO DE REVISÃO

Regeneração de nervos periféricos: terapia celular e fatores neurotróficos

Alessandra Deise Sebben^I; Martina Lichtenfels^II; Jefferson Luis Braga da Silva^III

^IBióloga, Doutoranda em Medicina e Ciências da Saúde (PUCRS) - Porto Alegre, RS, Brasil

^IIBióloga, Mestranda em Medicina e Ciências da Saúde (PUCRS) - Porto Alegre, RS, Brasil

^IIIMédico; Professor Titular da Faculdade de Medicina (PUCRS) - Porto Alegre, RS, Brasil

^{Correspondência}

RESUMO

Traumatismos em nervos periféricos resultam na perda de função do órgão inervado e raramente apresentam recuperação sem a intervenção cirúrgica. Diversas técnicas cirúrgicas são passíveis de serem empregadas para o reparo nervoso. Dentre elas, ressalta-se o uso da técnica de tubulização, podendo ser acrescentados fatores com capacidade regenerativa na câmara. A terapia celular e engenharia de tecidos surgem como uma alternativa para estimular e auxiliar a regeneração de nervos periféricos. Portanto, o objetivo desta revisão é fornecer um levantamento e uma análise de estudos experimentais e clínicos, quanto aos resultados obtidos, que utilizam a terapia celular e engenharia de tecidos como ferramentas para otimizar o processo de regeneração. Os artigos utilizados são oriundos de bases de dados científicas LILACS e Medline, através de pesquisas realizadas no PubMed e SciELO. Artigos sobre o uso de células-tronco, células de Schwann, fatores de crescimento, colágeno, laminina e plasma rico em plaquetas no reparo de nervos periféricos foram sintetizados ao longo da revisão. Com base nos diversos estudos pode-se concluir que a utilização de células-tronco derivadas de diferentes fontes apresentam resultados promissores na regeneração nervosa, pois estas possuem capacidade de diferenciação neuronal, demonstrando, assim, resultados funcionais eficazes. O uso de tubos acrescidos de elementos bioativos com liberação controlada também otimiza o reparo nervoso, promovendo uma maior mielinização e crescimento axonal dos nervos periféricos. Outro tratamento promissor é o uso de plasma rico em plaquetas, que, além de liberar fatores de crescimento importantes no reparo nervoso, ainda serve como um carreador para fatores exógenos estimulando a proliferação de células específicas no reparo de nervo periférico.

Descritores: Sistema Nervoso Periférico/lesões; Medicina Regenerativa; Regeneração Nervosa

INTRODUÇÃO

Traumatismos por transecção em nervos periféricos são extremamente comuns na prática clínica e raramente apresentam recuperação sem intervenção cirúrigca. Lesões com perda de substância nervosa são responsáveis por graves problemas ao paciente. Além de causar dor e morbidade estas injúrias normalmente geram sequelas permanentes, como déficit sensitivo e disfunção funcional. Essas lesões causam danos que diminuem de maneira substancial a qualidade de vida desses pacientes, incluindo a incapacitação física e a perda total ou parcial de suas atividades produtivas, o que origina importantes consequências econômicas e sociais⁽¹⁾. As técnicas atuais de reparo oferecem resultados aleatórios e frequentemente insatisfatórios. Frente a essas limitações, muitos pesquisadores buscam alternativas terapêuticas para aprimorar o reparo de lesões com transecção de nervos periféricos⁽²⁾.

O transplante autólogo de nervo periférico representa atualmente o padrão ouro de reparo quando há perda de substância que impossibilite a neurorrafia. Apresenta, porém, algumas limitações, como a necessidade de realização de dois procedimentos cirúrgicos em locais distintos, a consequente e maior morbidade e a escassez de sítios doadores de nervo, além do déficit sensitivo resultante na área da qual foi retirado^(2,3).

Nos casos em que a extensão da lesão impossibilita a simples reunião dos cotos, uma técnica de reparo disponível e vastamente empregada é a tubulização. Essa técnica, também chamada entubulação, é um procedimento cirúrgico em que os cotos nervosos seccionados são introduzidos e fixados dentro de uma prótese tubular, objetivando propiciar um ambiente favorável à regeneração. Proporciona, ainda, o direcionamento do crescimento nervoso das extremidades rompidas ou seccionadas^(2,4), protegendo as fibras nervosas do tecido cicatricial e evitando a formação de neuroma⁽⁵⁾. A tubulização apresenta outra característica interessante: ela pode ser otimizada com acréscimo de fatores regenerativos^(6-8).

Sabe-se que o reparo tecidual requer uma complexa interação entre células, matriz extracelular e fatores tróficos, sendo todos importantes elementos envolvidos na regeneração nervosa⁽⁹⁾. Consequentemente, a terapia celular e a engenharia de tecidos vêm recebendo grande atenção nas últimas décadas, e são amplamente utilizadas em diferentes áreas^(7,10-13).

Apesar da complexidade dos eventos moleculares e celulares do reparo tecidual ainda não estar completamente esclarecida, os conhecimentos existentes sobre os mecanismos da cascata que induz a regeneração após a lesão de nervos periféricos são vastos e fornecem informações importantes para uma melhor concepção sobre o reparo nervoso. Portanto, o objetivo desta revisão é fornecer um levantamento e análise de estudos experimentais e clínicos quanto aos resultados obtidos a partir de técnicas de reparo de nervo periférico, que utilizam a terapia celular e engenharia de tecidos como ferramentas para otimizar o processo de regeneração. Os artigos utilizados são oriundos de bases de dados científicas LILACS, Medline e SciELO.

REVISÃO DE LITERATURA

Terapia celular e reparo de nervo periférico

O transplante de células é uma das estratégias da terapia celular e engenharia de tecidos que tem como objetivo a criação de um microambiente favorável para a regeneração tecidual. Células-tronco possuem características importantes que as diferenciam de outros tipos celulares, são células precursoras indiferenciadas que têm capacidade de autorrenovação e podem diferenciar-se em múltiplas linhagens⁽¹⁴⁾. Estão presentes em diversos tecidos e são responsáveis pela regeneração dos mesmos na ocorrência de injúrias ou lesões⁽¹⁵⁾. Medula óssea, tecido adiposo, sangue do cordão umbilical e sangue periférico são algumas fontes de células-tronco; porém, essas células podem ser tecido-específicas, ou seja, oriundas diretamente de tecidos especializados^(6,14,16-18). No reparo nervoso, dentre as células mais utilizadas estão as células mesenquimais da medula óssea e do tecido adiposo, assim como as próprias células de Schwann^(6,7,19-33) (Tabela 1).

Essas células podem ser aplicadas diretamente após separação por gradiente de densidade (Ficoll-Paque^®) ou ser cultivadas e diferenciadas in vitro para posterior aplicação, como é o caso da diferenciação de células- tronco em células de Schwann. A seguir, serão descritos alguns dos tipos celulares mais utilizados em pesquisas sobre reparo nervoso.

Células de Schwann no reparo nervoso

As células mais comumente utilizadas na regeneração nervosa são as células de Schwann (CS) autólogas. Essas representam as células da glia no sistema nervoso periférico, sendo sua principal função o suporte aos axônios através da liberação de fatores de crescimento e isolamento do axônio através da formação da bainha de mielina⁽³⁴⁾. A adição de CS em tubos sintéticos auxilia a regeneração em defeitos de nervo, embora o reparo com enxerto autólogo, na maioria dos estudos, ainda apresente uma recuperação superior^{(27,29,33,35-37)}. Além de sintetizarem fatores de crescimento, as SC também são capazes de produzir moléculas extracelulares, como laminina e colágeno tipo IV. A matriz extracelular pode servir como reservatório de fatores de crescimento que são secretados pelas CS⁽³⁸⁾.

Estudos experimentais baseados na utilização de SC como uma alternativa terapêutica para a recuperação de nervos com perda de substância comprovaram a eficácia destas células^(28,32,39). As SC desempenham um papel importante na manutenção, nutrição e no reparo de nervos periféricos. Embora ainda existam fatores limitantes no uso de SC, essas possuem resultados promissores na melhora tecidual, fisiológica e funcional em lesões causadas por traumas ou patologias em nervos periféricos.

Células mesenquimais da medula óssea e regeneração do nervo

Muitos pesquisadores têm desenvolvido estudos sobre células-tronco^{(19,25,27,40)}. As células-tronco embrionárias, assim como as obtidas a partir de tecido cerebral adulto, são capazes de sofrer expansão e diferenciação neuronal in vitro e in vivo. No entanto, a inacessibilidade destas células limita seu uso clínico, o que estimulou a busca por células que sejam hábeis em diferenciar-se em linhagens neuronais^(28,41). Além disso, existe uma polêmica que envolve a pesquisa com utilização de células-tronco referente às fontes das quais elas são obtidas. Particularmente, o uso de células-tronco embrionárias, apesar de estar legalmente regulamentado no Brasil, que permite a pesquisa e manipulação dessas células obtidas através de "embriões inviáveis", ainda permanece envolvido em discussões éticas e políticas^{(29,30,42,43)}.

Uma fonte alternativa e viável de células-tronco mesenquimais é a medula óssea. Células adultas derivadas da medula óssea são caracterizadas como multipotentes, pois são capazes de se diferenciar em linhagens celulares de origem mesodermal^(44,45). Diversas pesquisas sobre transplante de células-tronco mesenquimais derivadas da medula óssea (CTMO) têm relatado que essas células também apresentam habilidade de diferenciação neuronal in vitro, o que torna possível a sua utilização no reparo de nervo periférico^(46-52). Adicionalmente,

Montzka et al⁽⁵³⁾ demonstraram a capacidade de CTMO humanas expressar diferentes marcadores neuronais e de células da glia.

Estudos experimentais em roedores^(20,21,23), coelhos^(22,54) e primatas⁽⁵⁵⁾ comprovam a eficiência dessas células, apresentando desfechos funcionais positivos no reparo de nervo periférico. A combinação de células mesenquimais da medula óssea com tubo bioabsorvível aumenta a regeneração nervosa e a recuperação funcional de nervo ciático em camundongos⁽⁵⁶⁾. As CTMO podem influenciar positivamente a regeneração de nervos periféricos não somente através da liberação direta de fatores neurotróficos, como também pela modulação indireta do comportamento das CS^(24,46).

Há evidências clínicas que apontam as CTMO como um tratamento eficaz no reparo de nervo periférico. Ao comparar a técnica de tubulização com e sem adição de células mononucleares da medula óssea (esse grupo de células contém uma fração de células-tronco) em 44 pacientes com danos no nervo mediano ou ulnar, constatou-se que lesões tratadas com essas células apresentaram melhores resultados no processo de regeneração quando comparadas à tubulização convencional⁽⁷⁾.

Contudo, as CTMO apresentam algumas limitações. Além da obtenção dessas células ser realizada com aplicação de anestesia peridural ou geral, pois a coleta ocorre através de um procedimento muito doloroso, a quantidade adquirida de células muitas vezes não alcança o número necessário⁽⁵⁷⁾.

Células mesenquimais derivadas do tecido adiposo e regeneração nervosa

As células-tronco mesenquimais não estão presentes somente na medula óssea, mas também em outros tecidos incluindo o tecido adiposo⁽¹⁸⁾. São denominadas pela maioria dos autores como células-tronco derivadas do tecido adiposo (ADSC, do inglês Adipose-Derived Stem Cell).

Existe grande semelhança entre as ADSC e as CTMO, pois ambas apresentam perfil imunofenotípico similar, bem como a capacidade de se diferenciar em linhagens osteogênica, condrogênica, miogênica e adipogênica^(58,59). A vantagem no uso de ADSC é a sua ampla disponibilidade, pois a gordura subcutânea humana é abundante, podendo ser coletada facilmente através do procedimento de lipoaspiração, além de sua frequência no tecido adiposo ser bem mais elevada do que as células mesenquimais na medula óssea⁽⁶⁰⁾.

A habilidade das células mesenquimais provenientes do tecido adiposo de se diferenciar em células com características neuronais foi comprovada in vitro. Kingham et al⁽⁶¹⁾ relataram que as ADSC são capazes de se diferenciar em células semelhantes à genuína CS, quando cultivadas junto a uma combinação de fatores tróficos gliais.

Células derivadas de tecido adiposo de murinos e humanos, após indução neuronal, apresentaram morfologia típica de células nervosas, sendo essas positivas para expressão imunocitoquímica de GFAP, nestina e proteína nuclear específica de neurônios (Neu-N). O pré-tratamento com fator de crescimento epidermal (EGF) e fator de crescimento de fibroblastos básico (FGF) aumenta a diferenciação neuronal das células-tronco humanas derivadas de tecido adiposo, tendo a utilização das mesmas uma ampla implicação biológica e clínica⁽⁴¹⁾. Entretanto, a célula-tronco mesenquimal derivada do tecido adiposo deve possuir capacidade de produzir bainha de mielina, a principal função das CS. Esta característica foi confirmada em estudos in vitro, tornando-se, assim, mais uma alternativa para o tratamento de injúrias em nervos periféricos⁽⁵⁷⁾.

As células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo apresentam resultados semelhantes às derivadas da medula óssea in vivo^(25,26). Entretanto, devido à facilidade na sua coleta e abundante quantidade de células disponíveis em depósitos subcutâneos, as ADSC são apontadas como uma melhor alternativa para a aplicação clínica⁽²⁵⁾.

Fatores de crescimento no reparo nervoso

Na complexidade da regeneração nervosa, está envolvida uma gama de elementos que interagem entre si, todos fundamentais ao processo; dentre eles, os fatores de crescimento (FC) despertam grande interesse da comunidade científica⁽⁶²⁾, por sua atuação como importantes moduladores celulares^(62-78) (Tabela 2).

Os nervos periféricos degenerados são uma fonte importante destes fatores, assim como as CS. Essas proteínas são basicamente um conjunto de três famílias de moléculas e seus receptores, responsáveis por manter o crescimento e a sobrevivência dos axônios e neurônios motores e sensitivos após danos teciduais⁽⁶²⁾.

A presença local dos FC é importante no controle da sobrevivência, migração, proliferação e diferenciação de vários tipos celulares que estão engajados no reparo de nervos^(9,62). Por esses motivos, a utilização de terapias baseadas em FC tem aumentado nas últimas décadas. Os fatores de crescimento devem ser administrados localmente para atingir um efeito terapêutico mais adequado e com poucas reações adversas. Portanto, a entrega dos fatores de crescimento para regeneração de nervos pode ser idealmente combinada com condutos nervosos⁽³⁴⁾.

Dentre os fatores neurotróficos, o fator de crescimento neural (do inglês nerve growth factor - NGF) é o fator mais pesquisado, devido à sua ação na proliferação e diferenciação de neurônios⁽⁶⁴⁾ e por auxiliar o reparo e a recuperação funcional de nervos injuriados⁽⁶³⁾. Quando combinado com biomateriais e com liberação controlada, seu efeito pode ser potencializado^(79-81). Em estudos experimentais confirmou-se a capacidade do NGF de promover a recuperação funcional após lesão^(65,81).

O fator neurotrófico derivado do cérebro (do inglês brain-derived neurotrophic factor - BDNF) endógeno demonstra um importante papel na indução da resposta do corpo celular em neurônios injuriados de ratos. Quando expostas a mitógenos como BDNF, as células-tronco se diferenciam em linhagens neuronais in vitro⁽⁶⁸⁾.

O fator neurotrófico derivado de linhagem de célula glial (do inglês glial cell line-derived neurotrophic factor - GDNF) é considerado o fator mais protetor para neurônios motores⁽⁷⁰⁾, sendo fundamental na sua formação, assim como de neurônios sensitivos durante o processo de regeneração⁽⁸²⁾. O GDNF tem sua expressão elevada em modelos experimentais de neuropatias motoras em ratos, várias neuropatias humanas e em nervos humanos traumatizados⁽⁸²⁾. Em modelo de lesão de nervo periférico em ratos, demonstrou-se que a combinação de condutos nervosos compostos por quitosana, GDNF e laminina foi significativamente mais eficiente durante os estágios iniciais do reparo nervoso, promovendo maior mielinização e crescimento axonal em seis semanas após a transecção do nervo dos animais⁽⁸³⁾.

O fator neurotrófico ciliar (do inglês ciliar neurotrophic factor - CNTF) auxilia na diferenciação e na sobrevivência de uma variedade de neurônios, e os níveis de expressão de mRNA de CNTF decrescem significativamente e continuam baixos por longo período após transecção de nervo periférico⁽⁷¹⁾.

De modo semelhante, o fator de crescimento similar à insulina (do inglês insulin-like growth factor - IGF) também auxilia na regeneração de nervos. O IGF-1 está presente em vários estágios do desenvolvimento do sistema nervoso periférico, exercendo uma grande variedade de funções, dentre elas a promoção da regeneração dos axônios sensitivos e motores^(72-75). Evidências sugerem que níveis elevados de IGF em músculo denervado podem estimular a regeneração com brotamento do nervo⁽⁸⁴⁾.

O fator de crescimento endotelial vascular (do inglês vascular endothelial growth factor - VEGF), além de atuar essencialmente no tecido vascular, também auxilia a regeneração de nervos, devido à estreita relação existente entre as fibras nervosas e os vasos sanguíneos durante esse processo. A adição de VEGF aumenta significativamente a infiltração de vasos sanguíneos em câmaras de condução nervosa, estando relacionada ao aumento da regeneração axonal e migração de SC^(76,77). Além disso, o VEGF atua como neuroprotetor em neurônios in vitro após lesão isquêmica⁽⁷⁸⁾. Em trabalho experimental o uso de VEGF demonstrou efeito sobre o suprimento vascular, com um aumento significativo da regeneração axonal e de SC, estimulando a regeneração nervosa⁽⁸⁵⁾.

Colágeno e laminina como carreadores

Como componentes da matriz extracelular estão o colágeno e a laminina, fundamentais para a orientação e o crescimento axonal durante o processo de regeneração nervosa. O colágeno e a laminina estão envolvidos no processo de regeneração através da formação de um substrato para a migração de células não neuronais. O preenchimento de tubos de silicone com esses componentes apresenta aumento na taxa de regeneração⁽⁸⁶⁾ e na conexão de defeitos extensos⁽⁸⁷⁾. Esse efeito, entretanto, depende de alguns fatores como a concentração e a permeabilidade do tubo^(87,88).

Atualmente, diferentes géis contendo colágeno ou laminina (Matrigel^®) vêm sendo utilizados como suporte para células e fatores de crescimento^(27,35,37). O colágeno, como o maior componente da matriz extracelular, é utilizado em diversas próteses cirúrgicas. Estudo em modelo animal demonstrou a eficácia de uma biomatriz composta por colágeno (Tissudura^TM) quando utilizada na regeneração nervosa⁽⁸⁹⁾.

Assim como o colágeno, a laminina também desempenha um papel importante no crescimento axonal in vivo. Pesquisas incluem esse componente da matriz extracelular em modelos animais para reparar nervos ciáticos injuriados e obter melhora em algumas áreas de regeneração axonal. A aplicação de tubos compostos por quitosana combinados com laminina demonstra que o tubo otimiza o processo de regeneração nervosa durante as fases iniciais do reparo⁽⁸³⁾.

Utilização de plasma rico em plaquetas no reparo de nervo periférico

O plasma rico em plaquetas (PRP), derivado de sangue autólogo, é definido como um volume de plasma com concentração plaquetária em torno de cinco vezes acima dos níveis fisiológicos⁽⁹⁰⁾. As plaquetas que constituem o PRP são capazes de liberar diversos fatores de crescimento fundamentais para a cicatrização de lesões, como os três isômeros de fator de crescimento plaquetário (PDGF αα, ββ e αβ), VEGF, fator de crescimento transformador (TGF-β 1 β2) e fator de crescimento epitelial (EGF)^(91,92). As plaquetas também são responsáveis pela síntese e armazenamento de BDNF⁽⁹³⁾.

O PRP é há tempo utilizado por áreas como cirurgia oral e bucomaxilofacial^(94-96), e vem sendo de grande interesse na cirurgia plástica^(97,98) e ortopédica^(99,100). Em estudos experimentais, o PRP foi utilizado em lesões de nervos periféricos, promovendo a remielinização em nervo facial⁽⁹¹⁾ e nervo ciático de ratos⁽⁸⁾.

A aplicação de PRP aumenta o número de fibras nervosas após lesões de nervos periféricos, podendo exercer um efeito neurotrófico, estimulando a proliferação das células de Schwann e a mielinização, componentes importantes durante o reparo de nervo periférico^(6,101).

Os dados na literatura sobre o efeito do PRP na regeneração de nervo periférico são escassos, o que estimula a busca por informações mais precisas sobre sua atuação. Portanto, este tratamento deve receber atenção e ser aprofundado, pois tem potencial para se tornar mais uma alternativa segura e de baixo custo associado para o tratamento das mais diversas lesões e neuropatias em nervos periféricos.

CONCLUSÃO

O conceito de um tratamento ideal para auxiliar o reparo de nervos baseia-se na confecção de tubos sintéticos, preferencialmente bioabsorvíveis, com o revestimento de componentes da matriz extracelular e que sejam adequados para liberação controlada de um ou mais fatores neurotróficos, elementos bioativos ou células. A combinação de dois ou mais fatores de crescimento, provavelmente, exerce um efeito sinérgico na regeneração do nervo, especialmente quando pertencem a famílias diversas e agem por mecanismos distintos. Apesar do vasto conhecimento já adquirido sobre essas proteínas na melhora da regeneração nervosa, mais estudos experimentais são necessários antes de sua utilização na prática clínica.

O uso de células, sejam as próprias células de Schwann ou as células-tronco obtidas de fontes diversificadas, demonstram grandes benefícios no reparo de nervos periféricos, com grande potencial para se tornar uma das alternativas mais promissoras na clínica.

Outra técnica interessante e ainda pouco explorada é o uso de PRP, que libera fatores de crescimento autólogos e serve como carreador para outros fatores exógenos na regeneração nervosa.

Considerando as evidências encontradas, observou-se que um tratamento promissor baseia-se na combinação de elementos biológicos e sintéticos para que a regeneração seja otimizada e proporcione melhores resultados.

Trabalho recebido para publicação: 11/02/2011, aceito para publicação: 16/06/2011.

Trabalho realizado no Laboratório de Habilidades Médicas e Pesquisa Cirúrgica, Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul - PUCRS.

Os autores declaram inexistência de conflito de interesses na realização deste trabalho

Este artigo está disponível online nas versões Português e Inglês nos sites: www.rbo.org.br e www.scielo.br/rbort

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  24 Fev 2012
• Data do Fascículo
  2011

Histórico

• Recebido
  11 Fev 2011
• Aceito
  16 Jun 2011