Histomorfometria da matriz orgânica do fêmur de ratas ovariectomizadas tratadas com alendronato de sódio ^☆

Resumos

OBJETIVO:

avaliar a efeito de duas concentrações diferentes de alendronato de sódio (ALN) sobre a quantidade de matriz orgânica no fêmur de ratas com supressão estrogênica provocada por ovariectomia.

MÉTODOS:

ratas Wistar (Rattus norvegicus) com 60 dias foram submetidas a laparotomia bilateral para remoção dos ovários. Os animais foram divididos em grupo controle, no qual os animais foram apenas laparotomizados; grupo ovariectomizado (OVX); grupo ovariectomizado tratado com 1 mg/kg de ALN (OVX 1 mg); e grupo ovariectomizado tratado com 2 mg/kg de ALN (OVX 2 mg). Receberam ALN duas vezes por semana durante 90 dias. O fêmur esquerdo foi coletado, fixado e processado para inclusão em parafina. Cortes semisseriados corados com H&E foram usados para a obtenção, com um software de análise de imagens, da área ocupada por matriz óssea orgânica. O peso dos animais foi obtido no inicio e no fim do experimento.

RESULTADOS:

os animais ovariectomizados e aqueles tratados com 1 mg/kg de ALN tiveram um aumento significativo (p < 0,05) no peso corporal quando comparados com o grupo controle. A análise histomorfométrica revelou que nos animais tratados com 2 mg/kg de ALN a área (µm²) ocupada por matriz orgânica (181.900 ± 18.130) foi semelhante (p > 0,05) àquela dos animais controle não ovariectomizados (204.800 ± 9.590), o que indica um efeito preventivo desse medicamento sobre a perda de massa óssea.

CONCLUSÃO:

a maior concentração do medicamento administrado duas vezes por semana por 90 dias foi mais eficaz do que a dose de 1 mg/kg no mesmo período.

Ovariectomia; Alendronato; Osteoporose; Matriz óssea

OBJECTIVE:

To evaluate the effect of two different concentrations of sodium alendronate on the quantity of organic matrix in the femur of rats with estrogen suppression caused by ovariectomy.

METHODS:

Sixty-days-old Wistar rats (Rattus norvegicus) were subjected to bilateral laparotomy to remove the ovaries. The animals were divided into a control group, in which they only underwent laparotomy; an ovariectomized group (OVX); an ovariectomized group treated with 1 mg/kg of alendronate (OVX 1 mg); and an ovariectomized group treated with 2 mg/kg of alendronate (OVX 2 mg). The rats received alendronate twice a week for 90 days. The left femur was then removed, fixed and processed for embedding in paraffin. Semi-serial sections stained with hematoxylin and eosin were used to determine the area occupied by organic bone matrix, by means of image analysis software. The animals' weights were obtained at the beginning and end of the experiment.

RESULTS:

The ovariectomized animals and those treated with 1 mg/kg of alendronate presented significant increases in body weight (p < 0.05), in comparison with the control group. Histomorphometric analysis revealed that in the animals treated with 2 mg/kg of alendronate, the area (µm²) occupied by organic matrix (1,81,900 ± 18,130) was similar (p > 0.05) to that of the non-ovariectomized control animals (2,04,800 ± 9590), which indicates that this medication had a preventive effect with regard to bone mass loss.

CONCLUSION:

The higher concentration of the medication, administered twice a week for 90 days, was more effective than the dose of 1 mg/kg over the same period.

Ovariectomy; Alendronate; Osteoporosis; Bone matrix

Introdução

A osteoporose pós-menopausa é uma doença caracterizada pela deterioração da microarquitetura e redução da massa óssea em função do aumento na reabsorção pelos osteoclastos, com consequente aumento na susceptibilidade a fraturas, cuja prevalência é muito alta, mais frequente do que a soma dos casos de infarto do miocárdio, câncer de mama e acidente vascular cerebral.¹ A osteoporose deve ser considerada como um problema de saúde pública,² porque afeta o indivíduo em sua função social, física e laboral e, portanto, provoca impacto socioeconômico.³ A principal causa da perda de massa óssea nas mulheres é a deficiência de estrogênio na menopausa.⁴

Os bifosfonatos tornaram-se na última década a pedra angular no tratamento da osteoporose.⁵ São usados para o tratamento e a prevenção dessa doença e de doenças oncológicas que resultam no aumento de remodelação óssea.⁶ Os bifosfonatos têm uma estrutura química que tem forte afinidade com o fosfato de cálcio, o que facilita sua ligação ao osso. Durante a reabsorção óssea,⁷o fármaco é absorvido pelos osteoclastos e provoca o rompimento do citoesqueleto, perda da borda pregueada, inibição das enzimas lisossomais, perda da atividade reabsortiva e morte por apoptose.⁸ Dessa forma, há uma diminuição da atividade osteoclástica, sem interferência direta na atividade neoformadora.⁹

O ALN é um aminobifosfonato de segunda geração, potente inibidor da reabsorção osteoclástica.¹⁰ O uso do ALN suprime a remodelação óssea^{11 and 12} e aumenta a densidade mineral óssea (DMO), o que contribui para evitar as fraturas vertebrais e não vertebrais. Com o uso do ALN, os marcadores de turn over ósseo apresentam-se reduzidos. ¹² O uso de uma dose específica de ALN para o tratamento da osteoporose resulta em desaceleração importante na progressão da doença. ⁸

O modelo animal mais usado para o estudo da osteoporose pós-menopausa é a ovariectomia, porque em um período relativamente curto pós-ovariectomia já se obtém um estado de osteopenia muito semelhante à humana.^{13 and 14} Com o uso de animais também é possível investigar as diferentes formas de tratamento e de medicamentos existentes no mercado. Entretanto, não há um consenso a respeito da dose adequada para testes em animais. O objetivo deste trabalho é avaliar a resposta do tecido ósseo em ratas ovariectomizadas frente a duas concentrações distintas de ALN, um dos fármacos disponíveis no mercado mais usados para o tratamento da osteoporose.

Material e métodos

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Universidade Estadual de Maringá (protocolo n° 033/2009).

Procedimento experimental

Ratas Wistar (Rattus norvegicus) com 60 dias foram anestesiadas com uma injeção intramuscular de cloridrato de 2-(2,6 xilidino)-5,6-dihidro-4H-1,3-tiazina (Ronpun^(r)) e cloridrato de quetamina (Ketalar^(r)) na relação 1:1. Empregou-se dessa associação 1 mL.Kg^{- 1} de peso corporal para a laparotomia e a remoção dos ovários. Aguardou-se até que desaparecessem os reflexos interdigital e ocular. A ventilação pulmonar foi mantida de maneira espontânea. Até a recuperação da anestesia os animais foram observados quanto ao reflexo ocular (pela estimulação da pálpebra superior com gaze), à frequência respiratória (observação direta dos movimentos torácico-abdominais) e à frequência cardíaca (verificada com estetoscópio pediátrico fixado na região anterior do tórax).

Os animais foram divididos em quatro grupos de oito cada: um grupo controle, no qual os animais foram apenas laparotomizados; um grupo ovariectomizado (OVX); um grupo ovariectomizado tratado com 1 mg/kg de ALN (OVX 1 mg); e um grupo ovariectomizado tratado com 2 mg/kg de ALN (OVX 2 mg). Após a recuperação da anestesia, os animais foram mantidos em número de quatro por gaiola sob a temperatura de 20 °C, ciclo de claro/escuro de 12 horas e livre acesso a água e alimentação durante todo o período experimental. Todos os animais foram pesados no início e no fim do experimento.

Na semana seguinte à ovariectomia e durante os 90 dias seguintes os grupos tratados foram injetados por via intramuscular com ALN 1 mg/kg ou 2 mg/kg duas vezes por semana, sempre na mesma hora. Após o período de tratamento os animais foram sacrificados com uma sobredose de cetamina. O fêmur esquerdo de cada animal foi removido e fixado em solução de paraformaldeído 4% por 48 horas. Procedeu-se então à dissecção dos tecidos moles e posterior desmineralização do osso em ácido fórmico por 21 dias. A seguir as amostras foram lavadas em água corrente por seis horas e processadas para inclusão em parafina. Foram feitos cortes semisseriados de 7 µm ao longo do maior eixo do fêmur. Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina (H&E) para análise.

Para a determinação da área ocupada pela matriz orgânica, foram capturadas duas imagens de uma área padronizada na diáfise proximal, logo abaixo do disco epifisário do fêmur esquerdo (figs. 1A-B). As imagens foram obtidas de três cortes por lâmina, em quatro lâminas por animal, totalizando 24 imagens por animal. Foi usado um sistema de captura de imagens composto por microscópio Olympus BX41 (Tóquio, Japão) com câmara Q. Color 3 RT Olympus (Tóquio, Japão) acoplada. As imagens foram obtidas com objetiva de 20×.

Figura 1 -
Fotomicrografia do fêmur esquerdo de rata Wistar. (A) As áreas marcadas indicam os campos microscópicos que foram capturados pelo sotware Image Pro Plus, para a análise morfométrica da área ocupada por colágeno. Aumento original 4×. (B) Representa a forma como foi obtida a medida da área ocupada por colágeno: a área total foi determinada e as áreas dos espaços vazios foram somadas e posteriormente subtraídas da área total. Aumento original 20×. Hematoxilina e eosina.

A área ocupada por colágeno foi submetida a um software de análise de imagem (Imagem Pro-Plus^(r), versão 4.5, Media Cibernética, Silver Spring, MD), que obteve a área em micrometros quadrados.

A área avaliada era composta por osso trabecular e para o cálculo da área ocupada pela matriz orgânica a seguinte metodologia foi adotada: em primeiro lugar foi calculada a área total da imagem com a objetiva de 20×; a seguir as áreas vazias de cada corte, que correspondem ao trabeculado ocupado por medula óssea, foram mensuradas e somadas para ser posteriormente subtraídas da área total (fig. 2). O resultado final corresponde à área ocupada pela matriz orgânica. Todos os cálculos foram feitos no programa Excel (Microsoft Corporation). Foi obtida a área média em µm² de cada animal para a comparação estatística.

Figura 2 -
Diferença entre o peso corporal inicial e final de ratas controle, ovariectomizadas (OVX) e ovariectomizadas tratadas com 1 mg/kg (OVX 1 mg) ou 2 mg/kg (OVX 2 mg) de alendronato de sódio. Resultados são expressos como média ± DP. P < 0,05 quando comparados * com **.

Análise estatística

Foi feita com o programa GraphPad Prism R 3.1. Os dados obtidos foram representados como média ± desvio padrão. O teste de análise de variância usado foi o Anova. O teste de Tukey foi usado como pós-teste para comparação entre as médias. O nível de significância adotado foi 5%.

Resultados

O peso (g) inicial e final dos animais está representado na figura 2. A figura 3apresenta os resultados da análise da área (µm²) ocupada pela matriz óssea orgânica.

Figura 3 -
Área (µm2) ocupada por matriz óssea orgânica de ratas controle, ovariectomizadas (OVX) e ovariectomizadas tratadas com 1 mg/kg (OVX 1 mg) ou 2 mg/kg (OVX 2 mg) de alendronato de sódio. Resultados são expressos como média ± DP. P < 0,05 quando comparados * com **.

Discussão

A ovariectomia experimental é um modelo de estudo que permite avaliar, em animais, as consequências da perda de massa óssea em diversas situações.¹⁵ O mais frequente é o estudo da eficácia de medicamentos disponíveis no mercado para o tratamento da osteoporose.^{4 , 8 , 10 and 16} Nesse modelo um período de três meses após a remoção dos ovários é suficiente para que ocorra uma significante perda de massa óssea no fêmur de ratas ovariectomizadas.¹⁷

A ovariectomia leva a um progressivo e importante aumento no peso corporal.¹⁸ Neste estudo ratas ovariectomizadas foram tratadas por 90 dias com duas concentrações diferentes de ALN. Houve um aumento no peso corporal nas ratas ovariectomizadas não tratadas e naquelas que receberam 1 mg/kg de alendronato de sódio. Os animais que receberam 2 mg/kg não tiveram alteração no peso corporal quando comparados com o grupo controle. Esses resultados demonstram que a dose de 2 mg/kg foi mais eficiente na prevenção do ganho de massa corporal.

A deficiência de estrogênio pode estar relacionada à diminuição de receptores de leptina no hipotálamo e provoca diminuição da saciedade,¹⁹ maior ingesta alimentar e consequente ganho de massa corpórea. Por outro lado, há também possibilidade de diminuição do gasto energético em fêmeas com deficiência de estrogênio, fato que facilitaria o ganho de massa corpórea.²⁰

As ratas ovariectomizadas receberam tratamento com 1 ou 2 mg/kg de ALN duas vezes por semana. É importante ressaltar que o início do tratamento aconteceu um dia após a ovariectomia e, portanto, as fêmeas não apresentavam um quadro de perda óssea instalado. Por meio da análise histomorfométrica da matriz orgânica constatou-se que o tratamento com 2 mg/kg de ALN teve um efeito preventivo sobre a perda de massa óssea. Os animais que receberam 1 mg/kg apresentaram diminuição da matriz óssea semelhante àquela dos animais ovariectomizados.

Os bisfosfonatos diminuem o grau de crescimento ósseo sem, porém, interferir na qualidade de resistência mecânica do osso,²¹ou seja, há uma prevenção da reabsorção pelo ALN, mas o osso mantém suas características estruturais e mecânicas normais.²² Os bifosfonatos tornam o turn over ósseo mais lento e proporcionam mais tempo para a organização estrutural óssea, sem prejudicar ou alterar as propriedades mecânicas do tecido. ²³

Em humanos, a posologia recomendada de ALN é de 1 mg/kg de peso corporal, uma vez por semana. Entretanto, os ratos têm um metabolismo duas vezes mais rápido do que os humanos e por essa razão a administração do fármaco foi feita duas vezes por semana. A dose de 1 mg/kg foi escolhida por se assemelhar àquela aplicada aos humanos e, por outro lado, a dose de 2 mg/kg foi escolhida para ser a dose testada.

Não há consenso entre os autores a respeito da dose de ALN que deve ser administrada aos animais. Ito et al.¹⁶ constataram, em seu trabalho em ratas ovariectomizadas, que a administração diária de 0,2 mg e 1 mg/kg, por 12 semanas, provocou um aumento significativo na quantidade de matriz orgânica, em comparação com os animais ovarictomizados não tratados; a densidade mineral óssea (DMO) do grupo ovariectomizado foi 24,2% menor do que a do grupo controle. Allen²⁴ avaliou as concentraçoes de 0,1, 0,2 e 1 mg/kg/dia de ALN durante o tratamento de um ano. Constatou que os melhores resultados foram obtidos com maiores concentrações do medicamento.

Diversos outros autores testaram diferentes concentrações de ALN, em tempos diferentes, com associação ou não com outras substâncias, como vitamina K,²⁵ vitamina D3,¹⁶ cálcio²⁶ e estradiol.⁴ Os resultados desses estudos demonstram, de maneira geral, que o ALN apresenta um efeito anabólico sobre a perda de massa óssea em animais ovariectomizados.

Nossos resultados mostraram que a dose de 1 mg/kg duas vezes semana não foi suficiente para estimular um efeito anabólico. Entretanto, Masaya et al.¹⁶ e Allen²⁴ demonstraram nessa mesma concentração, com o tratamento diário, um aumento na densidade mineral óssea em ratas ovariectomizadas, após 12 semanas e um ano, respectivamente.

Conclusão

Ao menos três parâmetros devem ser levados em consideração quando se usa o ALN em modelos animais: a dose, o tempo de tratamento e a posologia. Assim, para as menores concentrações do medicamento, as doses devem ser mais frequentes e o tratamento deve ser por um período maior, para que se alcançem resultados desejáveis, e para as concentrações maiores a frequência de administração pode ser menor.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  Jan-Feb 2015

Histórico

• Recebido
  30 Dez 2013
• Aceito
  06 Fev 2014