Impacto do ácido hialurônico na viabilidade das células mesenquimais derivadas do tecido adiposo cultivadas em membrana de colágeno tipo I/III

Resumo

Objetivo

Avaliar in vitro a viabilidade das células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo (AD-CTMs) em diferentes soluções comerciais de ácido hialurônico (AH) antes e após serem semeadas em membrana de colágeno I/III.

Métodos

Na primeira etapa, analisou-se a interação entre AD-CTMs com sete diferentes produtos comerciais de AH, salina tamponada com fosfato (PBS, na sigla em inglês) e soro fetal bovino (SFB), realizada pela contagem das células vivas e mortas após 24, 48 e 72 horas. Foram selecionados cinco produtos com maior número de células vivas e avaliou-se a interação entre o AH com AD-CTMs e a membrana de colágeno tipo I/III pela contagem de células vivas e mortas no mesmo intervalo de tempo (24, 48 e 72 horas).

Resultados

Em ambas as situações analisadas (AH + AD-CTM e AH + AD-CTM + membrana), o SFB apresentou a maior porcentagem de células vivas após 24, 48 e 72 horas, resultado superior ao do AH.

Conclusão

A associação do AH com as AD-CTMs, com ou sem a membrana, não demonstrou superioridade na viabilidade celular quando comparado com SFB.

Palavras-chave
cartilagem articular; células-tronco mesenquimais; transplante de células-tronco mesenquimais; ácido hialurônico

Abstract

Objective

To evaluate in vitro the viability of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue (AD-MSCs) in different commercial solutions of hyaluronic acid (HA) before and after being sowed in collagen I/III membrane.

Methods

In the first stage, the interaction between AD-MSCs was analyzed with seven different commercial products of HA, phosphate buffered saline (PBS), and bovine fetal serum (BFS), performed by counting living and dead cells after 24, 48 and 72 hours. Five products with a higher number of living cells were selected and the interaction between HA with AD-MSCs and type I/III collagen membrane was evaluated by counting living and dead cells in the same time interval (24, 48 and 72 hours).

Results

In both situations analyzed (HA + AD-MSCs and HA + AD-MSCs + membrane), BFS presented the highest percentage of living cells after 24, 48 and 72 hours, a result higher than that of HA.

Conclusion

The association of HA with AD-MSCs, with or without membrane, showed no superiority in cell viability when compared with BFS.

Keywords
cartilage; articular; mesenchymal stem cells; mesenchymal stem cell transplantation; hyaluronic acid

Introdução

O manejo dos defeitos da cartilagem é desafiador devido à capacidade limitada de reparação tecidual. Diversas modalidades de tratamento têm sido realizadas para melhorar a cicatrização e promover regeneração. As aplicações biológicas têm ganhado notoriedade nas últimas décadas,¹ desde a primeira descrição do tratamento com implante autólogo de condrócitos² na década de 1990. Anos depois, a técnica de implantação celular foi aprimorada com o uso de estruturas tridimensionais (scaffolds), aperfeiçoando os resultados clínicos relatados com até uma década de seguimento.³

As células-tronco mesenquimais (CTMs) foram recentemente propostas como opção potencial para restauração da cartilagem. As CTMs são conhecidas por apresentarem características biológicas únicas, incluindo propriedades imunomoduladoras, anti-inflamatórias e de liberação de citocinas prorregenerativas.⁴⁵⁶ Elas podem ser isoladas de vários tecidos do corpo humano,⁷⁸⁹ incluindo tecido adiposo (AD-CTMs), músculo, osso, sinóvia, polpa dentária e cordão umbilical.¹⁰ As AD-CTMs são obtidas facilmente, além de apresentarem um perfil proliferativo e uma capacidade in vitro de diferenciação semelhantes às CTMs da medula óssea.¹¹ As AD-CTMs são consideradas uma fonte celular ideal pela disponibilidade, propriedade não imunogênica, ação anti-inflamatória, e por não apresentarem relação de efeito entre a idade do doador e a capacidade de proliferação e diferenciação.¹² A fim de aprimorar o reparo da cartilagem, as células podem ser cultivadas in vitro em meios com estímulos exógenos (ácido hialurônico [HA] e fatores de crescimento) e, uma vez que atinjam a concentração desejada, podem ser implantadas em matrizes tridimensionais, como membranas de colágeno.

O protocolo ideal do cultivo de AD-CTMs para aplicação clínica ainda está por ser determinado. O AH tem sido considerado um excelente veículo para a administração de CTMs na reparação tecidual.¹³ Trata-se de um biopolímero formado pelo ácido glucurônico e N-acetilglicosamina. Há, entretanto, diversos produtos de AH disponíveis comercialmente, os quais diferem em fatores como origem (animal ou sintética) e propriedades físico-químicas (concentração, pesos moleculares, viscosidade e elasticidade).

Com o intuito de aprimorar a interação entre os scaffolds e as células e, assim, melhorar o processo de reparo da cartilagem, o presente estudo analisou a interação entre AD-CTMs, AH e membrana de colágeno. Há um lapso de informações sobre a resposta das AD-CTMs quando expostas ao AH, assim como se produtos comerciais com características diferentes influenciam na atividade celular. Há poucos relatos da interferência do AH como substrato para as AD-CTMs in vitro prévia ou posteriormente à colocação na membrana biossintética de colágeno tipo I/III.

O presente estudo tem como principais objetivos:

1. Avaliar in vitro a viabilidade das AD-CTMs humanas quando em contato com diferentes formulações comerciais de ácidos hialurônicos;

2. Analisar o uso de ácido hialurônico como veículo das AD-CTMs em membrana de colágeno tipo I/III.

Materiais e Métodos

Para a realização do presente estudo in vitro, foram obtidas cinco amostras de tecido adiposo humano para isolamento de AD-CTMs, após assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE) pelo doador, aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CAAE 60075616.5.0000.0071). Os procedimentos relacionados à transferência do material biológico, ao isolamento e à manipulação das células in vitro foram realizados em parceria com a empresa StemCorp Serviços Biomédicos Ltda., licenciada pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) como Centro de Processamento Celular segundo os critérios da Resolução da Diretoria Colegiada n° 214.

A coleta de entre 10 e 20 mL de tecido adiposo da região subcutânea abdominal foi realizada pelo cirurgião plástico, no centro cirúrgico, durante procedimento de lipoaspiração. Após a coleta, as amostras foram transferidas para um frasco estéril contendo 10 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS, na sigla em inglês) 1X pH 7,4, 200U/mL de penicilina, 200ug/mL de estreptomicina, 0,5ug/mL de anfotericina e 50ug/mL de gentamicina (Gibco). As amostras foram transferidas para uma caixa térmica com monitoramento de temperatura (4 a 8°C) e transportadas até o laboratório para isolamento celular.

As AD-CTMs foram isoladas utilizando os métodos previamente descritos por Vieira et al.¹⁴¹⁵ Para o cultivo das células in vitro, foi utilizado o meio de proliferação Dulbecco's Modified Eagle Medium low glucose (DMEM-LG, na sigla em inglês) (Gibco) suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB), penicilina 100U/mL, estreptomicina 100ug/mL e anfotericina 0,25ug/mL (Gibco). As trocas de meio foram realizadas a cada 3 dias. Cada linhagem foi mantida incubada a 37°C em uma atmosfera úmida contendo 5% CO₂ até atingirem confluência de 80%. Neste ponto, as células foram passadas para novos frascos de cultivo, na proporção de área 1:3, utilizando o reagente TrypLE (Gibco). Este procedimento foi repetido até atingir quantidades de células suficientes para a realização dos experimentos descritos abaixo.

Para o procedimento de criopreservação, as células foram descoladas dos frascos de cultivo utilizando TrypLE (Gibco), centrifugadas e suspensas em meio de congelamento StemPro (Gibco) contendo 10% DMSO. O congelamento das células foi realizado gradualmente, em criotubos, e elas foram transferidas posteriormente para um tanque de nitrogênio líquido.

Caracterização das Células Isoladas

Foram estabelecidos os três critérios da Sociedade Internacional de Terapia Celular para a caracterização de CTMs: 1–aderência a superfície plástica; 2–capacidade de diferenciação in vitro em adipócitos, condrócitos e osteócitos; 3–expressão de marcadores de superfície específicos (imunofenotipagem).¹⁶

Imunofenotipagem

Para o teste de imunofenotipagem, as células foram cultivadas até a passagem oito, descoladas dos frascos de cultivo e centrifugadas a 200 g por 5 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, o sobrenadante foi descartado e as células foram homogeneizadas e suspensas em PBS. As células foram, então, marcadas com anticorpos monoclonais: CD29-PerCP-Cy5, CD31-PE, CD45-FITC, CD73-PE, CD90-PE, CD105-PE, HLA-ABC-FITC, HLA-DR-PE (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, EUA), incubadas em temperatura ambiente e protegidas da luz por 30 minutos. Após este período, as células foram lavadas com PBS, centrifugadas a 500 g por 5 minutos, ressuspensas em solução tampão e colocadas em um citômetro de fluxo BD FACS Canto II (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, EUA). Os dados obtidos foram analisados no software FLOWJO (TreeStar, Ashland, OR, EUA).

Ensaio de diferenciação

A análise do potencial de diferenciação das AD-CTMs foi realizada com meios para diferenciação de adipócitos, condrócitos e osteoblastos. Cada grupo celular foi cultivado na presença do meio específico durante 14 dias. Após este período, as células foram coradas com Oil Red O (adipogênica), Azul de Alcian (condrogênica) ou Alizarina Red S (osteogênica). A capacidade de diferenciação foi avaliada pela coloração.

Ensaio de Viabilidade

Interação Célula/Ácido Hialurônico

Linhagens de AD-CTMs, na passagem seis, foram descoladas dos frascos de cultivo utilizando solução de TrypLE (Gibco) e centrifugadas a 300 g por 5 minutos. Ao final do processo, as células foram contadas na câmara de Neubauer e 3 × 10⁵ células foram separadas e adicionadas em microtubos de 1,5 mL, centrifugadas novamente a 300 g por 5 minutos e suspensas em 20 µl de cada solução. Foram analisados 9 grupos: 7 produtos de AH (►Tabela 1), PBS 1X pH 7,4 (controle negativo) e meio de proliferação (SFB). As células foram incubadas com as respectivas soluções por 24, 48 e 72 horas em temperatura ambiente.

Tabela 1
Propriedades físico-químicas dos diferentes ácidos hialurônicos analisados

Número	Produto	Molécula	Concentração	Peso molecular (MDa)	Elasticidade (Pa 2.5 Hz)	Viscosidade (Pa 2.5 Hz)	Fonte	Molécula crosslink
1	Opus Joint	Hialuronato sódio	1,5%	5,4	145	100	Bacteriana	Não
2	SupraHyal Duo	Hialuronato sódio	1%	0,75	1,2		Bacteriana	Não
3	Fermathron	Hialuronato sódio	1%	1,19–2,03	0,84		Bacteriana	Não
4	Orthovisc	Hialuronato sódio	1,5%	1–2,9	60	46	Bacteriana	Não
5	Synolis VA	Hialuronato sódio + sorbitol	2 + 4%	2	329	143	Bacteriana	Não
6	Synvisc	Hilano GF-20	0,8%	6	111	25	Aviária	Sim
7	Osteonil	Hialuronato sódio	1%	1–2	−	210	Bacteriana	Não

• Característica do líquido sinovial:
• Elasticidade = 117 Pa 2.5 Hz; Viscosidade = 45 Pa 2.5 Hz; Peso Molecular = 3–4 MDa.¹
• Fonte: bulas dos produtos

A viabilidade celular foi estimada pelo número de células vivas pelo kit LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Assay Kit (Thermo) e o equipamento Countess II FL (Thermo). As imagens das células marcadas, obtidas no Countess, foram contadas com auxílio do software Image J versão 1.8.0_172 (National Institutes of Health, Bethesda, MD, EUA). Toda a parte experimental foi realizada em teste cego e cada produto de AH recebeu uma numeração. Ao final das análises, os nomes comerciais foram revelados para fins comparativos.

Interação Célula/Ácido Hialurônico/Membrana de Colágeno Tipo I/III

Para a análise da interação entre AD-CTMs, AH e membrana de colágeno tipo I/III, foram selecionados os cinco ácidos hialurônicos que apresentaram a melhor taxa de viabilidade no experimento anterior.

Linhagens de AD-CTMs, na passagem sete, foram descoladas dos frascos de cultivo utilizando solução de TrypLE (Gibco) e centrifugadas a 300 g por 5 minutos. Ao final do processo, as células foram contadas na câmara de Neubauer e 2 × 10⁵ células foram adicionadas em microtubos de 1,5 mL, centrifugadas novamente a 300 g por 5 minutos e suspensas em 40 µl de produto de AH (números 1, 2, 4, 5 e 7; ►Tabela 1), PBS 1X pH 7,4 e SFB. A mistura célula mais solução (AH, PBS, SFB) foi então adicionada na superfície de membrana de colágeno tipo I/III (Chondro-Gide, Geistlich) e acondicionadas em placas de 48 poços. As células foram incubadas por 1 hora em atmosfera de 5% CO₂ a 37°C, o tempo de adesão das células na membrana, quando, então, foram adicionados 400uL de meio de proliferação. As células foram mantidas na mesma atmosfera por 24, 48 e 72 horas, com análise de viabilidade nestes períodos, utilizando a metodologia descrita com o kit LIVE/DEAD (Thermo).

Resultados

Isolamento das AD-CTMs do Tecido Adiposo

Das cinco amostras de tecido adiposo, houve 100% de sucesso na obtenção de células aderentes para a realização do estudo in vitro. A quantidade coletada para o isolamento das células de cada paciente foram: A1 (11,27 g); A2 (18,57 g); A3 (12,16 g); A4 (20,99 g); A5 (18,88 g). As amostras foram obtidas de pacientes do sexo feminino com uma média de idade de 30,2 anos. Todas as linhagens apresentaram morfologia compatível às células mesenquimais (longas e fusiformes, semelhantes a fibroblastos), com taxa de proliferação esperada até as passagens avaliadas.

Caracterização das Células Isoladas

Imunofenotipagem

As cinco linhagens apresentaram características específicas de células-tronco mesenquimais. Observamos porcentual positivo (> 80%) para os marcadores relacionados à aderência CD29 e CD90; relacionados à caracterização de células mesenquimais CD73 e CD105; e marcador de MHC classe I HLA-ABC. Observamos porcentual negativo (< 1%) para o marcador hematopoiético CD45; o marcador endotelial CD31; e o marcador de MHC classe II HLA-DR (►Figura 1).

Fig. 1
Imunofenotipagem das células aderentes obtidas do tecido adiposo. Os histogramas em cinza representam a população de células não marcadas com anticorpos (controle negativo). Os histogramas em vermelho representam a população de células marcadas com os respectivos anticorpos descritos em cada linha. Os gráficos mostram o número de células versus intensidade de fluorescência nos cinco casos.

Ensaios de Viabilidade

Interação Célula com Ácido Hialurônico

Observamos que o PBS apresentou a melhor taxa de viabilidade nos tempos analisados, sendo, então, considerado a solução de referência para comparações com as demais soluções (►Tabela 2). No momento 24 horas, o ácido 5 apresentou um valor médio de porcentagens de células vivas (96,2% ± 1,7) semelhante à taxa observada com o PBS. Não observamos evidências de diferenças entre o PBS e o ácido 1 (p= 0,075), o ácido 2 (p= 0,169), o ácido 3 (p= 0,090), o ácido 5 (p= 0,704) e o ácido 6 (p= 0,084). No momento 48 horas, o tratamento com ácido 5 também apresentou taxas semelhantes às do PBS (95,8% ± 2,8). Porém, não observamos evidências de diferenças entre o PBS e o ácido 1 (p= 0,097), o ácido 4 (p= 0,059) e o ácido 5 (p= 0,089). No momento 72 horas, todos os tratamentos apresentaram taxas menores de células vivas em relação ao PBS.

Tabela 2
Valores médios estimados e comparações para as médias e desvios-padrão de porcentagens de células vivas

Momento	Tratamento	Média de % de células vivas		DP de % de células vivas
		Média (IC95%)	valor-p	Média (IC95%)	valor-p
24h	AH 1	93,7 (90,3–97,3)	0,075	2,7 (1,4–5,3)	0,956
	AH 2	94,4 (91,5–97,5)	0,169	2,9 (1,4–6,0)	0,839
	AH 3	93,4 (91,4–95,4)	0,090	2,1 (1,0–4,2)	0,707
	AH 4	92,9 (88,4–97,6)	< 0,001	3,7 (2,1–6,5)	0,470
	AH 5	96,2 (93,3–99,3)	0,704	1,7 (0,8–3,5)	0,669
	AH 6	95,3 (91,0–99,8)	0,084	2,2 (1,0–5,1)	0,854
	AH 7	94,7 (92,2–97,4)	0,041	2,5 (1,1–5,6)	0,908
	Meio	88,2 (84,1–92,5)	< 0,001	3,8 (2,2–6,5)	0,276
	PBS	97,3 (93,2–100,0)	Referência	2,6 (0,6–11,4)	Referência
48h	AH 1	95,7 (91,7–99,9)	0,097	2,4 (0,7–7,5)	0,095
	AH 2	94,5 (91,2–97,8)	0,001	1,2 (0,8–1,9)	0,865
	AH 3	94,1 (91,6–96,6)	< 0,001	2,6 (1,7–4,0)	0,272
	AH 4	95,0 (90,6–99,7)	0,059	3,0 (1,6–5,5)	< 0,001
	AH 5	95,8 (93,4–98,3)	0,089	2,8 (1,5–5,3)	< 0,001
	AH 6	93,5 (88,7–98,5)	0,003	3,4 (1,7–6,7)	< 0,001
	AH 7	92,7 (87,1–98,6)	0,011	2,3 (1,8–2,9)	0,173
	Meio	86,1 (81,9–90,4)	< 0,001	5,7 (2,8–11,5)	0,002
	PBS	98,1 (96,2–100,0)	Referência	1,3 (0,4–4,6)	Referência
72h	AH 1	93,9 (88,5–99,8)	0,049	3,2 (1,3–8,2)	0,105
	AH 2	94,3 (91,8–96,8)	< 0,001	3,7 (2,4–5,8)	0,308
	AH 3	93,6 (91,7–95,4)	< 0,001	5,6 (2,6–12,4)	0,123
	AH 4	91,6 (86,7–96,8)	0,002	3,1 (1,5–6,3)	0,299
	AH 5	88,5 (80,3–97,5)	0,007	7,3 (3,4–15,6)	0,025
	AH 6	93,3 (89,4–97,3)	0,002	4,6 (2,5–8,4)	0,059
	AH 7	92,7 (90,0–95,4)	< 0,001	2,9 (2,3–3,7)	0,534
	Meio	82,6 (70,3–97,2)	0,009	4,4 (2,7–7,2)	0,091
	PBS	98,6 (97,2–100,0)	Referência	2,1 (0,6–7,4)	Referência

Abreviações: AH, Ácido Hialurônico; DP, desvio padrão; IC, intervalo de confiança; PBS, salina tamponada com fosfato.

Interação Célula/Ácido Hialurônico/Membrana de Colágeno (I/III)

Após a avaliação dos resultados da primeira etapa (interação AD-CTMs + AH), foram selecionados cinco AHs com melhor taxa de viabilidade, além do meio (SFB) e o PBS, e observamos uma variabilidade no número de células vivas em relação aos diferentes tratamentos e tempos analisados. O tratamento com SFB apresentou melhor estabilidade entre os tempos analisados, com excelentes taxas de células vivas, > 95%. No tempo zero, observamos uma variação na porcentagem de células vivas entre 87 e 99,96%. Após 24 horas, observamos uma variação entre 41 e 100%, sendo que os ácidos 5, 2 e 1 apresentaram maior índice de variabilidade (►Figura 2A). Em 48 horas, a porcentagem de células vivas variou entre 65,8 e 100% e a maior variabilidade ocorreu com os ácidos 4, 5 e 7 (►Figura 2B). Em 72 horas, a variação de células vivas foi de 60 a 100%, sendo as maiores variabilidades com os ácidos 1 e 5 (►Figura 2C).

Fig. 2
Porcentagem de células vivas por tratamento em (A) 24 horas, (B) 48 horas e (C) 72 horas.

Na análise das médias estimadas de células vivas, o tratamento com SFB apresentou a melhor taxa de células vivas em 24, 48 e 72 horas, sendo significativo em 24 horas (95,8%) em comparação com o PBS (►Tabela 3). Em 48 horas, o tratamento com os ácidos 1 e 5 mostraram-se inferiores, com significância estatística (►Tabela 3). Após 72 horas, porém, não observamos diferenças em comparação com o PBS. Ao compararmos todos os tratamentos, nos 3 tempos, observamos que os ácidos 1 e 5 apresentaram inferioridade em relação ao SBF, com relevância estatística (►Tabela 4).

Tabela 3
Porcentagens de células vivas estimadas em 24, 48 e 72 horas

Momento	Tratamento	Média estimada (IC95%)	valor-p
24h	SFB	95,8 (93,4–97,4)	< 0,001
	Ácido 7	86,3 (77,7–91,5)	0,826
	Ácido 5	81,3 (72,3–87,3)	0,350
	Ácido 4	86,6 (81,8–90,2)	0,801
	Ácido 2	81,2 (61,8–90,7)	0,429
	Ácido1	83,7 (74,4–89,6)	0,555
	PBS	87,8 (74,5–94,1)	Referência
	SBF	95,0 (93,3–96,3)	0,395
	Ácido 7	93,0 (88,9–95,5)	0,755
	Ácido 5	86,9 (79,3–91,8)	0,017
48h	Ácido 4	88,6 (78,6–93,9)	0,222
	Ácido 2	92,9 (89,8–95,0)	0,699
	Ácido 1	89,5 (86,7–91,7)	0,033
	PBS	93,8 (90,9–95,7)	Referência
	SFB	95,6 (93,3–97,0)	0,063
	Ácido 7	89,7 (84,8–93,0)	0,765
	Ácido 5	86,1 (78,2–91,1)	0,749
72h	Ácido 4	90,8 (81,7–95,4)	0,674
	Ácido 2	92,5 (87,7–95,4)	0,298
	Ácido1	85,5 (79,7–89,6)	0,671
	PBS	88,4 (75,9–94,4)	Referência

Abreviações: IC, intervalo de confiança; PBS, salina tamponada com fosfato; SFB, soro fetal bovino.

Tabela 4
Comparações múltiplas entre tratamentos em 24, 48 e 72 horas

Momento	Comparação			Valor-p corrigido
	SFB	x	Ácido 7	0,105
	SFB	x	Ácido 5	0,003
	SFB	x	Ácido 4	< 0,001
	SFB	x	Ácido 2	0,497
	SFB	x	Ácido1	0,028
	Ácido 7	x	Ácido 5	0,497
24h	Ácido 7	x	Ácido 4	> 0,99
	Ácido 7	x	Ácido 2	> 0,99
	Ácido 7	x	Ácido1	> 0,99
	Ácido 5	x	Ácido 4	0,497
	Ácido 5	x	Ácido 2	> 0,99
	Ácido 5	x	Ácido1	> 0,99
	Ácido 4	x	Ácido 2	> 0,99
	Ácido 4	x	Ácido1	> 0,99
	Ácido 2	x	Ácido1	> 0,99
48h	SFB	x	Ácido 7	> 0,99
	SFB	x	Ácido 5	0,017
	SFB	x	Ácido 4	> 0,99
	SFB	x	Ácido 2	> 0,99
	SFB	x	Ácido 1	0,033
	Ácido 7	x	Ácido 5	0,197
	Ácido 7	x	Ácido 4	> 0,99
	Ácido 7	x	Ácido 2	> 0,99
	Ácido 7	x	Ácido 1	> 0,99
	Ácido 5	x	Ácido 4	> 0,99
	Ácido 5	x	Ácido 2	> 0,99
	Ácido 5	x	Ácido 1	> 0,99
	Ácido 4	x	Ácido 2	> 0,99
	Ácido 4	x	Ácido 1	> 0,99
	Ácido 2	x	Ácido 1	0,204
	SFB	x	Ácido 7	0,002
72h	SFB	x	Ácido 5	0,012
	SFB	x	Ácido 4	> 0,99
	SFB	x	Ácido 2	> 0,99
	SFB	x	Ácido1	< 0,001
	Ácido 7	x	Ácido 5	> 0,99
	Ácido 7	x	Ácido 4	> 0,99
	Ácido 7	x	Ácido 2	> 0,99
	Ácido 7	x	Ácido1	> 0,99
	Ácido 5	x	Ácido 4	> 0,99
	Ácido 5	x	Ácido 2	> 0,99
	Ácido 5	x	Ácido1	> 0,99
	Ácido 4	x	Ácido 2	> 0,99
	Ácido 4	x	Ácido1	> 0,99
	Ácido 2	x	Ácido1	0,213

Abreviação: SFB, soro fetal bovino.

Discussão

O presente estudo demonstrou que o ácido hialurônico é um produto biocompatível com as células mesenquimais provenientes do tecido adiposo. Não foi possível estabelecer uma relação entre a viabilidade e o tipo de preparação comercial do produto. A manipulação celular também sofreu interferência de acordo com a viscosidade da formulação. O meio com SFB resultou em uma melhor taxa de viabilidade em todos os tempos analisados (24, 48 e 72 horas), ∼ 95%, superior aos produtos testados. Houve diferença estatística apenas em 24h (SBF versus PBS) e, neste tempo, os produtos de AH apresentaram desempenho semelhante ao do PBS. Nos demais tempos, considerando o PBS como referência, não houve diferença.

O AH tem sido amplamente utilizado como biomaterial por suas características de biocompatibilidade e biodegradabilidade. Entretanto, na literatura, há poucos dados quanto ao seu efeito in vitro sobre as CTMs.¹³¹⁷¹⁸ Ding et al.¹⁷ avaliaram o efeito do AH sobre AD-CTMs provenientes da gordura de Hoffa, concluindo que uma concentração de entre 25 e 75% de AH não afeta a proliferação celular. Os autores concluíram que a presença de AH não é tóxica, não alterou a expressão do marcador CD44 (receptor de AH), e tampouco apresentou indução da diferenciação condrogênica das células no curto intervalo de 7 dias, caracterizando o AH como veículo apropriado para injeção das AD-CTMs.¹⁷

Succar et al.¹⁹ avaliaram o efeito de diferentes concentrações de AH de alto peso molecular (0,5 a 5,0 mg/mL) nas CTMs, mensurando a aderência e a proliferação em superfície plástica e em ensaios de adesão da cartilagem. Uma das hipóteses é que a alta viscosidade influenciaria negativamente a ligação com as células, o que se confirmou ao ser verificado que quanto maior a concentração, menor a aderência, e que o AH tem efeito dose-dependente na cinética do crescimento celular nas concentrações > 1 mg/mL.¹⁹ Durante o nosso estudo, percebemos a interferência negativa da viscosidade elevada na manipulação celular; entretanto, não conseguimos estabelecer relação com a concentração dos produtos. Uma limitação é que, nas análises de interação célula + AH + membrana, não avaliamos os produtos com a menor concentração devido ao resultado insatisfatório observado na viabilidade celular.

Assim, acredita-se que o peso molecular e a viscosidade possam ser os responsáveis pelas diferenças encontradas. Dentre as marcas pesquisadas, o Suprahyal (Meiji Seika, Pharma, Tóquio, Japão) apresentou a maior quantidade de AD-CTMs viáveis no término do período analisado, sendo o produto com o menor peso molecular testado (0,75 MDa). Este resultado pode estar relacionado com a evidência de que AH de alto peso molecular age como inibidor da angiogênese e da proliferação celular, além de ter efeito anti-inflamatório e imunossupressor.⁶ Portanto, pode-se sugerir que a viabilidade celular pode estar diretamente relacionada à concentração e ao peso molecular do AH utilizado e que isto pode ser um fator determinante no sucesso do tratamento da lesão condral.²⁰ Deve-se mencionar que os resultados são pertinentes à influência do AH nas AD-CTMs no contexto da engenharia tecidual, e não à sua utilização como viscossuplementação no tratamento da osteoartrite.

O presente estudo não está isento de limitações. Trata-se de um estudo laboratorial com resultados experimentais que não devem ser extrapolados para a rotina clínica, embora possam nortear pesquisas futuras. Um número reduzido de amostras foi analisado, apesar do alcance estatístico da amostra.

Conclusões

O SFB apresentou melhor desempenho para a manutenção da viabilidade das AD-CTMs em comparação com produtos comerciais de AH, sem e com membrana de colágeno. Além disso, o AH pode ser um meio para a associação de células-tronco mesenquimais do tecido adiposo.

Agradecimentos

Nosso agradecimento a Mariane Secco (StemCorp) pela assistência no desenvolvimento do presente trabalho.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  13 Jan 2023
• Data do Fascículo
  Nov-Dec 2022

Histórico

• Recebido
  24 Abr 2021
• Aceito
  08 Jul 2021