Modelo experimental de tratamento de sepse por Klebsiella pneumoniae produtora de betalactamase de amplo espectro

Resumos

RACIONAL:

Modelos animais são importantes para avaliar a eficácia de antimicrobianos e a validação do sítio de infecção e a carga bacteriana.

OBJETIVO:

Definir a concentração do inóculo bacteriano, a dose e o tempo de administração de antimicrobianos a fim de validar um modelo experimental para o tratamento de Klebsiella pneumoniae produtora de betalactamase de amplo espectro em sepse letal.

MÉTODO:

Inóculos de Klebsiella pneumoniae produtora de betalactamase de espectro estendido de 1,5x10⁹ unidades formadoras de colônias por mililitro (UFC/ml) a 2,0x10¹⁰ UFC/ml foram administrados via injeção peritoneal em ratos Wistar adultos. Sobrevida e dados microbiológicos de hemoculturas e culturas quantitativas de fluido peritoneal foram avaliados inicialmente em animais não tratados. Animais inoculados com 2,0x10¹⁰ UFC/ml foram tratados dose única de meropenem (30mg/kg) e animais inoculados com 1,0x10¹⁰ UFC/ml foram tratados imediatamente com meropenem (50 mg/kg) por 24 horas e os desfechos foram avaliados após 24 horas da inoculação.

RESULTADOS:

Soluções com 1,5 x10⁹ e 6,0x10⁹ UFC/ml não foram letais. Inóculos de 1,0x10¹⁰ UFC/ml e de 2,0x10¹⁰UFC/ml foram letais em 80% e 100% dos animais respectivamente. Sepse letal (1.0x10¹⁰CFU/mL) com tratamento imediato e por 24 horas apresentou 40% de mortalidade, comparada com 80% nos controles (p=0.033). Culturas quantitativas de fluido peritoneal apresentaram ≤10⁴ UFC/ml enquanto que controles sem tratamento apresentaram >10⁵ UFC/ml (p=0.001).

CONCLUSÃO:

Modelo experimental com inóculo de 1,0x10¹⁰UFC/ml submetido ao tratamento imediato e por 24 horas foi capaz de avaliar resposta microbiológica e de sobrevida podendo ser modelo de embasamento e de controle para tratamento de sepse letal por Klebsiella pneumoniae produtora de carbapenemase.

Klebsiella pneumoniae; Sepse; Modelos animais

BACKGROUND:

Animal models are useful to evaluate the efficacy of antimicrobials in experimental sepsis.

AIM:

To elucidate the steps of producing an experimental model for the treatment of extended-spectrum beta-lactamase (ESBL)-producing Klebsiella pneumoniae sepsis

METHODS:

Several ESBL inoculums ranging from 1.5x10⁹ colony-forming units per milliliter (CFU/mL) to 2.0x10¹⁰ CFU/mL were administered by peritoneal injection in adults Wistar rats. Outcomes and microbiological data of quantitative peritoneal and blood cultures were observed in untreated animals. Animals which received 2.0x10¹⁰ CFU/mL inoculums were treated with single meropenem dose (30mg/kg) after one hour and those which received 1.0x10¹⁰ CFU/mL inoculums were treated immediately with three doses of meropenem 50 mg/kg. Outcomes were observed for 24 hours after inoculation.

RESULTS:

Solutions with 1.5 x10⁹ and 6.0x10⁹ CFU/mL were not lethal within 24 hours. Inoculums of 1.0x10¹⁰ CFU/mL were lethal in 80% and solutions with 2.0x10¹⁰ CFU/mL were lethal in 100% of animals. ESBL lethal sepsis (1.0x10¹⁰CFU/mL) was treated immediately with 50 mg/kg of meropenem every eight hours for 24 hours and presented 40% mortality compared with 80% mortality of the control group (p=0.033). Quantitative cultures of peritoneal fluid presented 10⁴ CFU/mL or less for treated animals compared to more than 10⁵ for untreated animals (p=0.001).

CONCLUSION:

Inoculums of 1.0x10¹⁰CFU/mL achieved the best results to study a model of lethal sepsis and this model of treatment of carbapenem-susceptible Enterobacteriaceae can serve as control to further evaluation of treatment of carbapenemase-producing Enterobacteriaceae models.

Klebsiella pneumoniae; Sepsis; Models, animal

INTRODUÇÃO

A incidência de enterobactérias produtoras de carbapenemases aumentou consideravelmente em nosso meio e o tratamento ideal para estes microrganismos não está estabelecido. Alguns estudos retrospectivos sugerem que a associação de antimicrobianos pode ser benéfica^{10 , 11 , 12}. A resposta de diferentes antibióticos no tratamento de microrganismos específicos pode ser avaliada através de mortalidade global, tempo de sobrevida e taxa de cura microbiológica. Tais desfechos podem sofrer influência de outros fatores clínicos e desta forma, modelos experimentais são úteis na avaliação da combinação de antimicrobianos para o tratamento de enterobactérias produtoras de carbapenemases até que ensaios clínicos avaliem esta hipótese. Um modelo experimental de tratamento de enterobactérias produtora de betalactamase de espectro estendido (ESBL), sensível a carbapenêmicos seria útil para controlar modelos de tratamento de enterobactérias produtoras de carbapenemases.

Modelos animais de tratamento de enterobactérias em peritonite, pneumonia e de infecção de partes moles após imunossupressão foram revisados e nenhum foi encontrado definindo o inóculo bacteriano e o tempo de terapia para ESBL. Modelos de peritonite em ratos utilizaram inóculos de 10⁵ a 10¹⁰ unidades formadoras de colônias por mililitro (UFC/ml) de E. coli. Sepse letal para ratos foi estudada com inóculo de 10⁹ a 10¹⁰ UFC/ml^{2 , 3 , 5} e não letal com inóculos de 10⁵ a 10⁸ UFC/ml^{1 , 13}. Os modelos que estudaram Klebsiella pneumoniae foram de peritonite em camundongos neutropênicos (3x10⁵ UFC/ml)⁴ , infecção de partes moles em ratos neutropênicos (10⁶ /10⁸ UFC/ml)^{6 , 8} e modelos de pneumonia em ratos (10⁶/10¹⁰ UFC/ml)⁷. Inóculos de 10¹⁰ UFC/ml de Enterobacter spp também foram avaliados em modelos de pneumonia em ratos⁹.

É necessária a padronização de concentrações de inóculo de Klebsiella pneumoniae a fim de determinar um modelo de sepse letal capaz de ser reprodutível e válido para avaliar a eficácia da terapia antimicrobiana na redução da mortalidade e no tempo de sobrevida de animais tratados com terapia padrão. O número de doses de antimicrobiano e o tempo de tratamento também devem ser padronizados. Uma vez validado, o modelo poderia servir de controle para o tratamento de Klebsiella pneumoniae produtora de carbapenemase.

Desta forma, o presente estudo visa validar um modelo experimental de sepse letal e tratável de peritonite por K. pneumoniae ESBL em ratos não neutropênicos, através da definição da concentração ideal de inóculo, bem como da posologia a ser empregada de meropenem.

MÉTODO

Animais

O experimento foi realizado com ratos Wistar adultos (20-24 semanas) de ambos os sexos com peso médio de 200-340 g. Foram mantidos sob temperatura (22-24^o C) e umidade adequadas, em ciclo dia-noite artificial, recebendo dieta-padrão e água ad libitum. A comissão de ética para o uso de animais da Universidade Estadual de Ponta Grossa aprovou o estudo. Foram incluídos 50 animais nas diferentes fases deste experimento.

Cepas bacterianas, produção do inóculo e indução da sepse

Uma cepa-padrão de K. pneumoniae ESBL (ATCC 700603) foi inoculada em meio Mueller-Hinton e incubada a 37° C por 24 horas. As colônias foram diluídas e homogeneizadas em solução salina isotônica estéril para formar inóculos.

As soluções eram centrifugadas a 2500 rotações por minuto por cinco minutos e as concentrações eram aferidas. Inicialmente, utilizou-se densímetro (Densimat Biomerieux(r)) capaz de medir densidades de 0,5 a 7,5 McFarland para aferir a concentração do inóculo. Concentrações de 1.5x10⁹ UFC/ml eram obtidas em 5 McFarland. A fim de obter medidas mais acuradas de inóculos, utilizou-se espectrofotômetro (Lambda 25 UV/Vis Spectrophotometer Perkin Elmer(r)) com densidade óptica de 625 nm. Inóculos com 1,5x10¹⁰ e 2,0x10¹⁰ UFC/ml correspondiam às soluções de cloreto de bário e ácido sulfúrico de 50 (5% de H₂SO₄ e 5% de BaCl₂) e 67 (3,3% de H₂SO₄ e 6,7% de BaCl₂) McFarland e as absorbâncias destas soluções eram de 2.343 e 2.764 respectivamente. De acordo com a lei de Beer-Lambert, absorbâncias acima de 0.890 não são acuradas para medir contagem de microorganismos; assim, após diluição de 1:20, os inóculos de 1,5x10¹⁰ e 2,0x10¹⁰ UFC/ml apresentaram absorbâncias de 0.543 e 0.633. Os de 6,0x10⁹ UFC/ml e 1,0x10¹⁰ UFC/ml foram obtidos diluindo 0,4 ml e 0.6 ml da solução de 1,5x10¹⁰ UFC/ml.

Todos os inóculos produzidos para injeção intraperitoneal eram semeados em Mueller-Hinton e incubados por oito horas para confirmar contagem de colônias antes da indução da sepse.

Sepse foi induzida através de injeção intraperitoneal dos inóculos descritos com agulha de 26 gauge no quadrante inferior direito do abdome. Todos os procedimentos foram realizados sob condições assépticas.

A letalidade do inóculo foi definida através da observação após injeção de solução com 1,5x10⁹ UFC/ml em seis animais, 6,0x10⁹ UFC/ml em outros seis, 1,0x10¹⁰ UFC/ml em dez animais e 2,0x10¹⁰ UFC/ml em outros dez.

Terapia antimicrobiana

Dois grupos com sepse letal por K. pneumoniae ESBL foram tratados com meropenem (Astra-Zeneca(r)). Doze ratos receberam inóculos de 2,0x10¹⁰ UFC/ml, sendo seis tratados com dose única de meropenem 30 mg/kg administrada uma hora após a indução da sepse. Vinte animais receberam inóculos de 1,0x10¹⁰ UFC/ml e 10 foram imediatamente tratados com 50 mg/kg de meropenem a cada oito horas por 24 horas (três doses). Os animais foram distribuídos homogeneamente em termos de peso e sexo entre os grupos controle e de tratamento.

Avaliação do desfecho

A resposta ao inóculo e ao tratamento foram avaliados através da taxa de letalidade, tempo de sobrevida, positividade de hemoculturas e de culturas quantitativas de líquido peritoneal. Os animais que não apresentaram sepse letal após 24 h, sofreram eutanásia com doses letais de xilazina e quetamina.

Hemoculturas (0,5-1 ml) foram coletadas através de punção intracardíaca após o óbito e incubadas em meio "brain heart infusion". O líquido peritoneal foi obtido após laparotomia e injeção de 5 ml de solução salina isotônica, homogeneização e aspiração. Um microlitro deste aspirado foi semeado em agar McConkey para culturas quantitativas. Além disso, culturas quantitativas foram realizadas após diluição de 1:100 do aspirado e semeadura de 1μL em ágar McConkey.

Análise estatística

Variáveis contínuas foram descritas como média e desvio-padrão e frequências como porcentagens. Variáveis categóricas foram comparadas através do teste de Mann-Whitney. Teste de Kruskal-Wallis foi utilizado para avaliar a sobrevida dos grupos sem tratamento. Foi utilizado o nível de significância de 0,05. Os dados foram computados em Excel (Microsoft, New York, USA) e a análise estatística foi realizada usando o programa SPSS 16.0 (SPSS, Chicago, USA). Gráficos e análise estatística pelo teste de Mann-Whitney foram realizados pelo programa GraphPad Prism 5.0 (GraphPad, La Jolla, USA).

RESULTADOS

Soluções de K. pneumoniae ESBL com concentrações de 1,5x10⁹ a 2,0x10¹⁰ UFC/ml foram avaliadas em termos de promoção de letalidade em ratos Wistar adultos e observou-se que inóculos com 1,5x10⁹ UFC/ml e 6,0x10⁹ UFC/ml não eram letais em seis (100%) e quatro (80%) dos animais respectivamente submetidos à estas concentrações de microorganismos. Inóculos de 1,0 x10¹⁰ UFC/ml foram letais em oito (80%) dos animais. Soluções de 2,0x10¹⁰ UFC/ml foram letais em 10 (100%) ratos (Figura 1).

Figura 1
tempo de sobrevida, em horas, dos animais não tratados de acordo com a concentração do inóculo administrado (UFC/ml).

Seis dos 12 que receberam inóculos de 2,0x10¹⁰UFC/ml foram tratados com dose única de 30 mg/kg após uma hora da indução da sepse e a mortalidade foi de 83,3% (cinco de seis ratos) no grupo que recebeu tratamento e de 100% no controle sem tratamento. No grupo de 20 animais inoculados com 1,0x10¹⁰UFC/ml, 10 foram tratados imediatamente com 50 mg/kg de meropenem a cada oito horas por 24 horas e observou-se que quatro (40%) dos tratados e oito (80%) dos controles evoluíram para óbito (p=0.042, Figura 2).

Figura 2
Tempo de sobrevida (horas) após a injeção de solução de 1.0x1010UFC/ml em animais sem tratamento (controles) e nos tratados imediatamente com 50mg/kg de meropenem.

Culturas quantitativas de fluido peritoneal realizadas no grupo de ratos inoculados com 1,0x10¹⁰UFC/ml apresentaram 10⁴ UFC/ml ou menos para nos animais tratados e acima de 10⁵ UFC/ml nos controles (p=0.001). Enquanto que no grupo de ratos inoculados com 2,0x10¹⁰UFC/ml, as culturas quantitativas de fluido peritoneal apresentavam contagens de colônias acima de 10⁵ UFC/ml independente do tratamento (Figura 3).

Figura 3
Culturas quantitativas de fluido peritoneal em UFC/ml nos animais não tratados e tratados que receberam respectivamente soluções com 2,0x1010UFC/ml e tratamento com 30mg/kg de meropenem em dose única e soluções de 1,0x1010UFC/ml e tratamento com 50mg/kg de meropenem em 3 doses.

DISCUSSÃO

Estudos prévios descreveram modelos experimentais de inóculos para sepse peritoneal de enterobactérias não K.pneumoniae ^{2 , 5 , 13}. Modelos de infecção de partes moles em ratos neutropênicos foram realizados com inóculos pouco concentrados para avaliar dados microbiológicos e não a mortalidade relacionada ao tratamento antimicrobiano⁸. Este estudo descreve a padronização para atingir um modelo de sepse letal por K. pneumoniae ESBL, passível de tratamento para avaliar a resposta ao antimicrobianos em ratos imunocompetentes.

Inóculos com concentrações de 10⁸ e 10⁹ UFC/ml promovem sepse não letal em ratos imunocompetentes. Sepse induzida por soluções nestas concentrações, pode ser útil para estratificar dose de antimicrobianos e comparar a eficácia antimicrobiana através de resultados microbiológicos, mas não permite avaliar o desfecho em termos de sobrevida. Inóculos concentrados excessivamente promovem sepse letal, porém não permitem avaliar diferenças de mortalidade e de culturas quantitativas entre animais tratados e controles. No presente estudo, observou-se que a concentração de 2,0x10¹⁰UFC/ml nos inóculos foi excessiva em termos de observar diferenças de sobrevida e culturas quantitativas.

Inóculos de 1.0x10¹⁰ UFC/ml, aferidos acuradamente por espectrofotometria produziram sepse letal passível de ser tratada imediatamente após a indução da sepse, com antibioticoterapia por 24 horas. Tal modelo permitiu comparar sobrevida e dados microbiológicos de animais tratados e controles. Indaga-se se a administração imediata de antimicrobianos poderia reduzir a carga bacteriana do inoculo; porém, observou-se a positividade de culturas apesar desta técnica e além disso, a mesma baseou-se em outros modelos prévios^{2 , 5}.

Este estudo valida um modelo experimental de sepse induzindo peritonite letal entre seis e 24 horas. O modelo possibilita a avaliação da eficácia antimicrobiana através de hemoculturas, culturas quantitativas e sobrevida dos animais.

CONCLUSÃO

O modelo experimental com inóculo de 1,0x10¹⁰UFC/ml submetido ao tratamento imediato e por 24 horas foi capaz de avaliar resposta microbiológica e de sobrevida podendo ser modelo de embasamento e de controle para tratamento de sepse letal por Klebsiella pneumoniae produtora de carbapenemase.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem às técnicas Maria da Luz Pereira e Marilene Terezinha Barbosa e ao professor Daniel Fernandes do biotério da UEPG. Agradecem também aos professores Carmen Sanches Ito e Carlos Alberto Lima Utrabo, do Departamento de Medicina da UEPG respectivamente pelo auxílio com os cálculos nas diluições e padronização das culturas quantitativas e pela disponibilização do laboratório de técnica operatória para a execução do modelo experimental. Finalmente agradecem a bioquímica Lavinia Arend do Labratório Central do Estado do Paraná pelo auxílio com a cepa padrão de ATCC e pelas opiniões na validação do inóculo.

Correspondência: Paula Toledo Email: [e-mail]

Conflito de interesses: não há

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• Fonte de financiamento: A pesquisadora Paula Virginia Michelon Toledo recebeu bolsa de doutorado pela CAPES.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  Jul-Sep 2014

Histórico

• Recebido
  30 Jan 2014
• Aceito
  13 Maio 2014