Detecção de atividade lectínica e atividade hemolítica em extratos de esponjas (Porifera) nativas da costa atlântica do Brasil

Detection of lectinic activity and hemolytic activity in extracts of native sponges (Porifera) of atlantic coast of Brazil

ARTIGO

Detecção de atividade lectínica e atividade hemolítica em extratos de esponjas (Porifera) nativas da costa atlântica do Brasil

Detection of lectinic activity and hemolytic activity in extracts of native sponges (Porifera) of atlantic coast of Brazil

R.R. Dresch^I; A.S. Haeser^I; C. Lerner^II; B. Mothes^II; M.M. Vozári-Hampe^III,*; A.T. Henriques^IV

^IPrograma de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Av. Ipiranga 2752, 90610-000, Porto Alegre, RS, Brasil

^IIFundação Zoobotânica do Rio Grande do Sul, Museu de Ciências Naturais, Rua Dr. Salvador França 1427, Jardim Botânico, 90690-000, Porto Alegre, RS, Brasil

^IIILaboratório de Lectinas, Departamento de Bioquímica, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Rua Ramiro Barcelos 2600, 90035-003, Porto Alegre, RS, Brasil

^IVLaboratório de Farmacognosia, Departamento de Produção de Matéria-Prima, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Av. Ipiranga 2752, 90610-000, Porto Alegre, RS, Brasil

RESUMO

Extratos aquosos de vinte espécies de esponjas da costa Atlântica brasileira foram testados para verificação da presença de atividade lectínica e atividade hemolítica. Hemaglutinação para eritrócitos humanos e de distintos animais foi evidenciada em 12 dos 20 extratos testados. Os extratos das espécies Axinella corrugata, Chondrilla nucula, Chondrosia collectrix, Cinachyrella alloclada e Guitarra sp1. foram os que apresentaram maior atividade hemaglutinante. Dos doze extratos com atividade hemaglutinante dez tiveram a atividade inibida por um ou mais açúcares e/ou glicoproteínas. A lectina do extrato de Chondrilla nucula foi resistente à desnaturação térmica quando aquecida a 100 ºC por 60 minutos. Atividade hemolítica foi encontrada apenas nos extratos de Petromica citrina e Acervochalina sp. As espécies que apresentaram maior potencial para futuros estudos de suas lectinas foram Axinella corrugata, Chondrilla nucula e Chondrosia collectrix, em vista da maior atividade hemaglutinante apresentada por seus extratos, aliada à maior atividade específica.

Unitermos: Esponjas, lectinas, atividade hemaglutinante, atividade hemolítica.

ABSTRACT

Aqueous extracts of twenty species of sea sponges of the Brazilian Atlantic coast were tested with the aim of searching the presence of lectinic and hemolytic activity. Hemagglutinating activity for human erythrocytes and for distinct animals were found in 12 of the 20 tested extracts. The extracts of Axinella corrugata, Chondrilla nucula, Chondrosia collectrix, Cinachyrella alloclada and Guitarra sp1. were the ones that presented highest hemagglutinating activity. Ten of the 12 hemagglutinating extracts had the activity inhibited by one or more sugars or glycoproteins. The lectin from Chondrilla nucula was resistant to thermal denaturation when heated up to 100 ºC for 60 minutes. Hemolytic activity was only found in the extracts from Petromica citrina and Acervochalina sp. The species of sea sponges that showed major potential for futures studies of their lectins were Axinella corrugata, Chondrilla nucula and Chondrosia collectrix, due to the highest hemagglutinating activity presented by their extracts, allied to the highest specific activity.

Keywords: Sponges, lectins, hemagglutinating activity, hemolytic activity.

INTRODUÇÃO

A costa brasileira com 8000 Km apresenta uma importante fauna marinha praticamente inexplorada (Berlinck et al., 2004). Dentre os organismos presentes destacam-se as esponjas, um dos animais multicelulares mais simples. Devido à sua prevalência, distribuição e habilidade de sintetizar uma gama de compostos de diferentes classes estruturais, as esponjas tornaram-se uma das fontes mais promissoras de isolamento de novos metabólitos primários e secundários, dos quais vários com importantes atividades biológicas e fontes potenciais de fármacos para tratamento de diversas doenças humanas (Berlinck et al., 2004; Carté, 1996).

Foi o isolamento do C-nucleosídeo da esponja Cryptotheca crypta há quatro décadas que forneceu a base para a síntese de citarabina, o primeiro agente anticâncer derivado de fonte marinha a ser desenvolvido para uso clínico em casos de linfoma e leucemia (Cragg; Newman, 1999). O'Keefe et al. (1997) isolaram uma nova proteína a partir de extratos aquosos da esponja marinha Niphates erecta, com atividade contra o vírus da Imunodeficiência Humana e que denominaram nifatevirina. Uma proteína com atividade hemolítica, ATPasica e neurotóxica, denominada de suberitina, foi isolada de outra espécie, a Suberites domuncula (Cariello; Zanetti, 1979). Monks et al. (2002), trabalhando com extratos orgânicos e aquosos de 10 espécies de esponjas marinhas coletadas na costa do Estado de Santa Catarina, constataram atividade citotóxica em 4 extratos orgânicos, atividade antimicrobiana em 2 extratos aquosos e um orgânico e atividade antiquimiotáxica em 6 extratos aquosos.

Lectinas, um tipo especial de proteínas ou glicoproteínas capazes de reconhecer e ligar reversivelmente e com certa especificidade carboidratos livres ou complexados (Peumans, 2002), foram descritas em esponjas marinhas, pela primeira vez, por Doods, Maclennan e Hawkin (1968) apud Kilpatrick (2000) em extratos de Cliona celata e em espécies do gênero Axinella. Nestes organismos, as lectinas teriam o papel de tranportadoras de glicídios, de substâncias importantes para o crescimento e nutrição do animal, de receptores para agregação celular, de substâncias de defesa contra bactérias e parasitas, dentre outros (Buck et al., 1992; Kilpatrick, 2000; Micucci; Camps, 1987). O interesse pelas lectinas é devido às várias atividades biológicas que as mesmas apresentam, como hemaglutinante (Sepcic et al., 1997), mitogênica (Engel et al., 1992), citotóxica (Pajic et al., 2002), hemolítica (Hatakeyama; Nagatomo; Yamasaki, 1995), antibacteriana (Tunkijjanukij; Olafsen, 1998), dentre outras, as quais podem ensejar uma gama de aplicações biológicas, tecnológicas e inclusive terapêuticas.

No presente trabalho foram avaliadas a atividade lectínica e a hemolítica de extratos aquosos de 20 espécies de esponjas marinhas coletadas ao longo do litoral Atlântico brasileiro, o efeito da temperatura sobre ambas as atividades e determinados os inibidores da atividade hemaglutinante.

MATERIAL E MÉTODOS

Material animal e reagentes químicos

As esponjas foram coletadas no litoral do Estado de Santa Catarina (Axinella corrugata, Guitarra sp1., Guitarra sp2., Guitarra sepia, Haliclona tubifera, Mycale arcuiris, Petromica citrina, Polymastia janeirensis, Pseudaxinella reticulata, Raspailia sp., Tedania ignis) e no litoral dos Estados de Pernambuco (Chondrosia collectrix, Cinachyrella alloclada, Placospongia carinata) e Paraíba (Acervochalina sp., Agelas sp., Chondrilla nucula, Monanchora arbuscula, Niphates sp., Suberitidae). Amostra de cada espécie está depositada no Museu de Ciências Naturais (MCN) da Fundação Zoobotânica do Rio Grande do Sul. Sangue humano foi obtido junto ao Banco de Sangue do Hospital de Clínicas de Porto Alegre, de coelho junto ao Biotério da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS) e o dos demais animais na Faculdade de Veterinária da UFRGS. Açúcares e glicoproteínas usadas foram da Sigma Chemical Co. (St. Louis, USA). Todos os reagentes foram de grau analítico e as soluções preparadas em água purificada em sistema Milli-Q.

Preparação dos extratos brutos

Imediatamente após a coleta, as esponjas foram lavadas exaustivamente com água corrente e armazenadas a –18 ºC. Para a extração das proteínas, as esponjas congeladas foram trituradas e maceradas em graal com água destilada e deionizada e deixadas em repouso durante 30 minutos à temperatura ambiente de 20 ºC (± 2 ºC). A solução obtida foi filtrada através de papel de filtro e estocada a 0 ºC. O sedimento foi reextraído, nas mesmas condições experimentais, tantas vezes quantas necessárias, até o sobrenadante não apresentar mais atividade hemaglutinante. Os filtrados aquosos resultantes foram reunidos, liofilizados e armazenados a -18 ºC até o uso.

Preparação dos extratos aquosos para os ensaios

O material liofilizado foi pesado e solubilizado em tampão fosfato salino (PBS: Na₂HPO₄ 10 mM, KH₂PO₄ 3 mM e NaCl 136 mM, contendo NaN₃ 20 mg/L - pH 7,2), obtendo-se uma solução a 10% (m/v). Em seguida, a solução foi centrifugada a 11000 rpm por 10 minutos a 4 ºC em microcentrífuga Eppendorf. O sedimento foi desprezado e o sobrenadante (extrato aquoso) foi coletado e usado para os ensaios.

Avaliação das atividades hemaglutinante, hemolítica e determinação dos inibidores da hemaglutinação

A atividade hemaglutinante foi testada com suspensão, em PBS, de eritrócitos nativos a 2%, previamente lavados, pertencentes aos grupos sangüíneos A, B, O e AB humanos e de distintas espécies animais (coelho, cão, ovelha, cavalo e boi). Os ensaios foram realizados em triplicata pelo método da dupla diluição serial em placas de microtitulação com fundo em U, usando-se 25mL do extrato aquoso e 25mL da suspensão de eritrócitos. A observação da hemaglutinação foi feita a olho nu, após incubação das placas a 4 ºC durante 16 horas.

A atividade hemolítica para eritrócitos nativos a 2% em PBS, previamente lavados, pertencentes a distintas espécies animais, foi testada em placa de dupla diluição serial com 25mL de extrato aquoso de esponjas adicionados a 25mL da suspensão de eritrócitos. Paralelamente, um controle negativo constituído de suspensão de eritrócitos em PBS e um positivo de eritrócitos a 1% em água purificada foram submetidos às mesmas condições experimentais. A hemólise foi observada a olho nu após incubação das placas a 4 ºC, durante 2 horas e confirmada por análise em microscopia óptica (Mebs; Veiler; Heinke, 1985 modificado).

A atividade hemaglutinante e hemolítica foram expressas em unidades hemaglutinantes e unidades hemolíticas por mg de proteína (UH/mg e UHI/mg - atividade específica), respectivamente, considerando-se unidades hemaglutinantes e/ou hemolíticas o inverso da maior diluição de 25 mL de extrato capaz de produzir o efeito, extrapolado para 1mL, de acordo com Kilpatrick e Yeomann (1978). A atividade hemolítica específica do extrato aquoso de cada espécie de esponja foi considerada como 100%.

Inibição da hemaglutinação foi realizada incubando-se previamente o extrato aquoso durante 20 minutos a 20 ºC (± 2 ºC) com o açúcar na concentração final de 0,2M ou com a glicoproteína a 0,5%. Imediatamente após, foi adicionada a suspensão de eritrócitos nativos a 2% da espécie animal que havia apresentado maior suscetibilidade à hemaglutinação. A leitura da atividade hemaglutinante foi realizada após incubação durante 120 minutos da mistura à temperatura de 20 ºC (± 2 ºC). Foram utilizados os seguintes açúcares e glicoproteínas para os testes: D-manose, D-glicose, D-galactose, L-fucose, L-ramnose, ácido D-glicurônico, N-acetil-D-galactosamina, N-acetil-D-glicosamina, L-sorbose, D-lixose, D-xilose, L(+)-arabinose, b-lactose, sacarose, rafinose, a(D)-melibiose, quitobiose, quitotriose, quitotetraose, fetuína e asialofetuína.

Determinação de proteínas

O conteúdo de proteína dos extratos aquosos foi determinado pelo método de Bradford (1976), utilizando albumina bovina, fração V (Sigma) como padrão.

Efeito da temperatura sobre a atividade hemaglutinante e hemolítica

Amostras dos extratos aquosos que apresentaram atividade hemaglutinante ou hemolítica foram submetidas, em tubos de Eppendorf, a aquecimento em banho de água, por 10 e/ou por 30 ou por 60 minutos, a temperaturas de 30 ºC, 40 ºC, 50 ºC, 60 ºC, 70 ºC, 80 ºC, 90 ºC e 100 ºC, respectivamente. Imediatamente após, os tubos foram resfriados em banho de gelo. Quando necessário, os tubos foram centrifugados à temperatura ambiente, com fins de eliminar eventuais precipitados de proteínas formados durante o aquecimento. A atividade hemaglutinante ou a hemolítica foi analisada pelo método da dupla diluição serial em placa de microtitulação, usando-se a suspensão de eritrócitos a 2% da espécie animal mais sensível ao efeito hemaglutinante ou hemolítico da amostra analisada.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Extratos aquosos de 12 das 20 espécies de esponjas estudadas apresentaram atividade hemaglutinante para os eritrócitos testados, mas apenas 11 aglutinaram eritrócitos humanos, segundo se pode verificar na tabela 1. Os extratos aquosos de Axinella corrugata, Chondrilla nucula, Chondrosia collectrix, Cinachyrella alloclada e Guitarra sp1. foram os que apresentaram maior atividade lectínica específica. O extrato de Chondrilla nucula aglutinou todos os eritrócitos testados, mas apresentou maior atividade hemaglutinante para eritrócitos de cão e coelho. De modo semelhante, o extrato de Cinachyrella alloclada aglutinou todos os eritrócitos testados, com maior atividade específica para eritrócitos humanos do grupo B, de coelho e de cavalo. Contudo, o extrato aquoso de Axinella corrugata, com maior atividade lectínica para eritrócitos de coelho, não aglutinou eritrócitos de cavalo. Não foi detectada atividade lectínica em extratos de Haliclona tubifera, Monanchora arbustula, Mycale arcuiris, Niphates sp., Polymastia janeirensis, Suberitidae, Petromica citrina e Tedania ignis para os eritrócitos testados. Nenhum dos extratos hemaglutinantes mostrou especificidade absoluta para eritrócitos de um dos grupos sangüíneos humanos ou das diferentes espécies animais, o que faz com que estas aglutininas não possam ser utilizadas na tipificação de grupos sangüíneos humanos.

Em estudo de ocorrência de lectinas em esponjas, realizado por Bretting et al. (1981), os extratos brutos de Cacospongia scalaris apresentaram maior seletividade para eritrócitos humanos pertencentes ao grupo sangüíneo O. Os mesmos autores verificaram que os das espécies Dysidea fragilis, Reniera fulva, Acenthella acuta e de Chondrosia reniformis não mostraram atividade hemaglutinante para eritrócitos humanos, sendo que os das três primeiras espécies citadas aglutinaram apenas eritrócitos de coelho.

A lectina de Haliclona cratera aglutinou eritrócitos de humanos pertencentes aos grupos sangüíneos A, B, O e AB e de ovelhas nativos ou tratados por enzimas (papaína, tripsina e neuraminidase), com intensidade similar (Pajic et al., 2002). Extratos aquosos de Callispongia fallax mostraram atividade hemaglutinante somente após tratamento dos eritrócitos de coelho e de hamster com tripsina e com pronase, respectivamente. Além disso, a atividade hemaglutinante do extrato da esponja Aplysina cauliformis aumentou significativamente após tratamento dos eritrócitos de coelho e de hamster com enzimas proteolíticas (Miarons; Fresno, 2000). No presente trabalho não foi realizado tratamento dos eritrócitos usados com enzimas proteolíticas. O fato de não ter sido encontrada atividade lectínica em alguns dos extratos analisados no presente trabalho, não descarta a possibilidade da presença das mesmas nestas espécies, em vista da limitação dos tipos de eritrócitos utilizados e/ou por não terem sido usados eritrócitos tratados com enzimas.

A tabela 2 apresenta os resultados da inibição da atividade hemaglutinante dos extratos aquosos por açúcares e/ou por glicoproteínas. Como pode ser verificado, a aglutinabilidade dos extratos de Cinachyrella alloclada, Chondrilla nucula e Chondrosia collectrix foi inibida por um único açúcar ou por uma glicoproteína apenas. A inibição total da lectina dos extratos de Cinachyrella alloclada apenas por b-lactose confirmou os resultados descritos por Atta et al. (1989). Não foi possível obter inibição da atividade hemaglutinante dos extratos de Guitarra sp2. e de Acervochalina sp. com as glicoproteínas ou açúcares testados, sendo que os mesmos não são eritrócito específicos. Atta et al. (1992) analisando a lectina isolada de Anthosigmella varians não determinaram o inibidor da mesma com os açúcares testados. Supõe-se que, nestes casos, o açúcar inibidor tenha uma estrutura complexa, a exemplo do inibidor da lectina de Phaseolus vulgaris (PHA).

Por outro lado, um considerável número de lectinas de esponjas marinhas são inibidas por D-galactose e N-acetil-D-galactosamina (Bretting et al., 1981; Schröder et al., 1990). Os resultados descritos na tabela 2 mostram que apenas extratos aquosos de Axinella corrugata foram inibidos por D-galactose e N-acetil-D-galactosamina, além de N-acetil-D-glicosamina. Kawagishi et al.(1994) constataram que a lectina HOL-I de Halichondria okadai foi inibida por oses contendo grupamento N-acetil, como N-acetil-D-galactosamina e N-acetil-D-glicosamina. Este comportamento é indício de que a HOL-I reconhece e liga especificamente grupamentos N-acetil de açúcares. O fato da atividade hemaglutinante dos extratos pertencentes a distintas espécies de esponjas ter sido inibida por mais de um tipo de açúcar, pode indicar a presença de mais de uma lectina no extrato ou de isoformas ou de isolectinas, além da possibilidade de uma mesma lectina ser específica para porções similares da estrutura dos diferentes açúcares ou glicoproteínas.

Os extratos de esponjas pertencentes ao gênero Guitarra sp. apresentaram atividade hemaglutinante para diferentes tipos de eritrócitos e distintos inibidores, fornecendo indícios de tratar-se de duas espécies diferentes. Estes resultados poderiam ser aplicados na identificação e caracterização taxonômica destas esponjas.

A tabela 3 exibe o efeito da temperatura sobre atividade hemaglutinante dos extratos aquosos. Raspailia sp. e Cinachyrella alloclada perderam a atividade hemaglutinante após aquecimento a 100 ºC, durante 10 min. A lectina de Acervochalina sp. não perdeu a atividade por efeito de aquecimento a 100 ºC por 30 min, e a atividade lectínica de Chondrilla nucula foi resistente ao aquecimento a 100 ºC por 60 min. Este comportamento é bastante raro, porém presente em lectinas de baixo peso molecular, como a da alga marinha Bryothamnion triquetrum que apresentou, segundo Calvete et al. (2000), resistência à desnaturação térmica e cuja atividade hemaglutinante foi inibida somente por açúcares ou glicoproteínas complexas. Pajic et al. (2002) constataram que a atividade hemaglutinante da lectina de Haliclona cratera diminuiu após 15 min de aquecimento a 95 ºC e desapareceu completamente após 60 min.

Os testes de hemólise, realizados com os distintos eritrócitos nativos e lavados, mostraram que dentre os vinte extratos analisados, somente dois, os de Petromica citrina e Acervochalina sp., possuíam atividade hemolítica (tabela 4). O extrato de Acervochalina sp. apresentou tanto atividade hemolítica quanto hemaglutinante. O mesmo tipo de comportamento foi relatado por Mebs, Weiler E Heinke (1985) para frações de extratos aquosos de esponjas marinhas eluídas de coluna de Sephadex G-75, indicando, neste caso, componentes com peso molecular elevado como sendo os responsáveis por ambas as atividades.

Os extratos de Acervochalina sp. apresentaram redução de 50% de sua atividade hemolítica após aquecimento a 100 ºC, durante 10 min, o que poderia levar a supor que, ao menos parte dessa atividade, deve-se à ação de compostos suscetíveis à elevação de temperatura. De um modo geral, proteínas são compostos que perdem sua atividade biológica, por desnaturação, quando submetidas ao efeito de elevação de temperatura, geralmente acima de 50 ºC. Contudo, não foi verificado se o responsável pelo efeito hemolítico dos extratos analisados teria natureza protéica e se o mesmo seria a proteína hemaglutinante. Por outro lado, o extrato de Petromica citrina apresentou aumento de atividade hemolítica após ter sido submetido ao aquecimento em banho de água a 100 ºC por 10 min, o que poderia ser indicativo de que um fator lábil à temperatura poderia estar associado ao fator hemolítico diminuindo a sua ação a baixas temperaturas. Não foram encontrados na literatura estudos relacionando efeito da temperatura e atividade hemolítica em extratos de esponjas marinhas.

Segundo Miarons e Fresno (2000), extratos de espécies do gênero Agelas e Ircinia mostraram atividade hemolítica para eritrócitos de diferentes espécies animais. O extrato da esponja Iothrocota birotulata exibiu atividade hemolítica para praticamente todos os eritrócitos testados, enquanto que o de Callispongia fallax exibiu apenas para eritrócitos de coelho nativos, mas não para os tratados com tripsina. Também não foi encontrado na literatura referência de atividade hemolítica devido a lectinas em extratos de esponjas marinhas. No entanto, além da proteína tóxica suberitina, foram descritos como responsáveis pela atividade hemolítica em extratos de esponjas polímeros de alquilpiridinas e outros compostos não identificados (Berlinck et al., 1996; Bourget et al., 1988; Cariello; Zanetti, 1979; Mangel et al., 1992; Sepcic et al., 1997).

CONCLUSÃO

Neste trabalho, as espécies de esponjas marinhas que apresentaram maior potencial para futuros estudos de purificação, caracterização e determinação das propriedades biológicas de lectinas para fins de aplicação foram Axinella corrugata, Chondrilla nucula e Chondrosia collectrix, em vista da maior atividade hemaglutinante apresentada por seus extratos, aliada à maior atividade específica.

AGRADECIMENTOS

À farmacêutica Fabiane Moreira Farias, do Departamento de Farmacognosia da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, por ceder as esponjas utilizadas neste trabalho. Às estagiárias Michele P. Beier e Josiane W. Bortolloto por auxílio técnico na execução dos trabalhos. Este trabalho foi financiado pela CAPES/PPI e CNPq.

Recebido em 02/07/04

Aceito em 25/10/04

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  17 Jun 2008
• Data do Fascículo
  Mar 2005

Histórico

• Recebido
  02 Jul 2004
• Aceito
  25 Out 2004