Estudo preliminar da atividade antibacteriana das cascas de Erythrina velutina Willd., Fabaceae (Leguminosae)

Preliminary study of the antibacterial activity of Erythrina velutina Willd. Fabaceae (Leguminosae) bark

ARTIGO

Estudo preliminar da atividade antibacteriana das cascas de Erythrina velutina Willd., Fabaceae (Leguminosae)

Preliminary study of the antibacterial activity of Erythrina velutina Willd. Fabaceae (Leguminosae) bark

S. Virtuoso; A. Davet; J.FG. Dias; M.M. Cunico; M.D. Miguel; A.B. Oliveira; O.G. Miguel^*

Departamento de Farmácia, Laboratório de Fitoquímica, Universidade Federal do Paraná, Av. Prefeito Lothário Meissner 3400, 80210-170, Jardim Botânico, Curitiba, PR, Brasil

RESUMO

A Erythrina velutina é popularmente conhecida como suinã, mulungu, corticeira, mulungu-da-catinga dentre outros. Das várias espécies distribuídas pelo mundo cerca de doze estão no Brasil. A casca é utilizada, principalmente no nordeste brasileiro, pelas propriedades sudorífica, calmante, emoliente, peitoral, anestésica local e outras. Considerando-se que não existem estudos sobre o potencial microbiológico das cascas de Erythrina velutina este trabalho teve por objetivo avaliá-lo preliminarmente contra oito bactérias patogênicas. Foram utilizados os métodos de difusão em disco e concentração inibitória mínima para o extrato etanólico bruto e difusão em disco para a fração hexano. A atividade contra o Staphylococcus aureus e Streptococcus pyogenes foi evidenciada para ambas as amostras. A viabilidade de futuras pesquisas com outras frações e substâncias isoladas na busca de novas alternativas, visando uma terapêutica racional a partir de fontes naturais foi apontada pelos resultados.

Unitermos: Erythrina velutina, Fabaceae, atividade antibacteriana.

ABSTRACT

Erythrina velutina is popularly known as suinã, mulungu, corticeira, mulungu-da-catinga among others. Of the several species spread around the world about twelve are found in Brazil. Mainly in the Brazilian northeast the bark is used due to its sudorific, sedative, emollient, pectoral and topical anesthetic properties. Considering that there are no studies about the antibacterial potential of Erythrina velutina, this research aimed at evaluating, at least preliminarily, bark activity against eight pathogenic bacteria. The crude ethanol extract was tested by the disk diffusion method and minimal inhibitory concentration (MIC) and the hexane fraction by the disk diffusion method. Both samples demonstrated activity against Staphylococcus aureus and Streptococcus pyogenes. The results pointed to the viability of future research on other fractions and substances isolated from Erythrina velutina in search for new rational therapeutic alternatives based on natural sources.

Keywords:Erythrina velutina, Fabaceae, antibacterial activity.

INTRODUÇÃO

A partir do século XIX a humanidade se deparou perplexa diante do diverso e inesgotável arsenal terapêutico presente nas plantas medicinais devido a descoberta de substâncias ativas, que em estado natural ou após sofrerem processos de transformação química, possuem atividade biológica, muitas vezes já confirmadas pelo uso popular e comprovadas cientificamente (Miguel; Miguel, 2004).

O gênero Erythrina (família Fabaceae) ocorre nas regiões tropicais e sub-tropicais do mundo. Possui cerca de 110 espécies, das quais 70 são nativas da América (EPAMIG, 1993; Vasconcelos et al., 2003). O nome Erythrina, do grego "erythros", significa "vermelho" em alusão à cor de suas flores. São empregadas como ornamentais e sombreadoras das lavouras de café e cacau (EPAMIG, 1993).

Erythrina velutina Willd. (Fabaceae) é popularmente conhecida como suinã, mulungu, canivete, corticeira, mulungu-da-catinga, pau-de-coral, sanaduí, sananduva, dentre outros (Lorenzi, 1992; EPAMIG, 1993). É uma espécie nativa da flora brasileira que tem sido utilizada na medicina popular em algumas regiões do nordeste brasileiro.

São atribuídas às preparações da casca propriedades sudorífica, calmante, emoliente, peitoral e do seu fruto seco ação anestésica local que é usado na forma de cigarro como odontálgico, embora a eficácia e segurança de seu uso ainda não tenham sido confirmadas cientificamente (Lorenzi; Matos, 2002). Este fato torna imperioso o investimento na pesquisa fitoquímica e biológica a fim de se comprovar seu potencial terapêutico. Por meio de estudos farmacológicos empregando-se o extrato da E. velutina foram demonstrados os seus efeitos periféricos e sobre o sistema nervoso central. Dantas et al. (2004) evidenciaram que o extrato aquoso das folhas de E. velutina em baixas doses interferiu em processos mnemônicos e em doses maiores agiu como sedativo e bloqueador neuromuscular periférico.

As plantas do gênero Erythrina são conhecidas por produzirem alcalóides, flavonóides e isoflavonóides. Estas plantas representam a principal fonte de alcalóides tetracíclicos, sendo que estes possuem atividade semelhante ao curare causando paralisia muscular (Amer et al., 1991; Decker et al., 1995).

Por meio do fracionamento em coluna cromatográfica da fração acetato de etila obtida das cascas de E. velutina foram isolados a erivelutinona (2',4'-dihidroxi-6-prenil-7-metoxiisoflavanona) de aspecto viscoso e coloração marrom-amarelado e a 3'-O-metilsigmoidina (Da Cunha et al., 1996), também a faseolidina e homohesperetina, sendo que a última ainda não havia sido isolada de uma planta da família Fabaceae (Rabelo et al., 2001).

Além disto, este gênero tem provado ser uma fonte farta de espécies contendo agentes antimicrobianos que pertencem a várias classes estruturais de flavonóides, como por exemplo, a E. variegata cuja atividade do extrato bruto das raízes foi demonstrada para Staphyloccus aureus e Mycobacterium smegmatis (Telikepalli et al., 1990).

Atividades com interesse farmacêutico foram apresentadas também por outros representantes do gênero como a E. speciosa que no Brasil é utilizada como analgésica, anti-inflamatória e bactericida (Dias Filho et al., 2002).

Considerando-se que não há estudos sobre o potencial microbiológico da E. velutina e que as pesquisas sobre a atividade antimicrobiana de plantas representam um grande desafio para a descoberta e identificação de fármacos (Cunico et al., 2003), este trabalho teve por objetivo avaliar preliminarmente o potencial de atividade antibacteriana do extrato etanólico bruto e fração hexano das cascas da espécie.

MATERIAL E MÉTODOS

Material

Os solventes utilizados para todos os procedimentos apresentavam grau de pureza analítico (Merck^®). As suspensões bacterianas foram diluídas em salina estéril e padronizadas pela turbidez conforme o tubo 0,5 da escala de MacFarland (0,5 mL de BaCl₂.2H₂O 0,048M - 1,75% peso/volume em 99,5 mL de H₂SO₄ 0,36 N – 1% volume/volume). As culturas puras das bactérias (ATCC - American Type Culture Collection) e os discos de antibióticos usados como controle, cloranfenicol e cefalotina, foram adquiridos comercialmente (Newprov^®). Os meios de cultura utilizados foram ágar Muller-Hinton para difusão em disco e caldo caseína de soja (CASOY) para o teste de concentração inibitória mínima - CIM. O etanol utilizado nos testes antibacterianos foi o mesmo da extração.

Material vegetal

As cascas de E. velutina Willd., (Fabaceae) foram coletadas na cidade de Petrolina, Pernambuco em janeiro de 2003 e em seguida, foram secas e estabilizadas pela EMBRAPA Semi-Árido e a exsicata de identificação está registrada sob número 2298 no Museu Botânico da mesma instituição.

Preparo do extrato bruto

As cascas secas, estabilizadas e moídas em total de 2,960 kg, foram submetidas a extração com etanol 96º GL em soxhlet até esgotamento. O material obtido foi concentrado em evaporador rotatório sob pressão reduzida (50 ºC) para aproximadamente 1/5 do seu volume. Este volume foi conservado em freezer por 24 horas, em frasco âmbar, visando a precipitação de substâncias com aparência de goma e os pigmentos. Após esse período o extrato foi filtrado a vácuo em funil de Büchner e obteve-se 200 mL (aproximadamente 71,2 g) de extrato etanólico bruto (EB). O resíduo seco do EB foi determinado conforme preconizado pela Farmacopéia Brasileira IV edição (1988) pesando-se 1,0 mL (medida volumétrica) do material em triplicata, e submetendo as amostras a 105 ºC até peso constante após resfriamento em dessecador, obteve-se 312,75 mg/mL o que corresponde a 3,67 % (peso/peso) em relação a massa inicial das cascas.

Preparo da frações

Uma amostra do EB foi submetida a fracionamento líquido-líquido em aparelho de soxhlet modificado (Carvalho, 2001) com solventes de polaridade crescente: hexano, diclorometano e acetato de etila gerando as frações hexano (FHEX), fração diclorometano (FDMT), fração acetato de etila (FATE) e o restante foi denominado fração hidroalcóolica remanescente (FHAR).

Para este estudo foi utilizada somente a fração hexano padronizada a 200 mg/mL.

Cromatografia gasosa da fração hexano

Uma amostra da FHEX solubilizada em metanol foi analisada por cromatografia gasosa conforme método de Padronização Interna de Carvalho (2001) com a finalidade de caracterizar e quantificar os analítos voláteis por Retenção Relativa em relação ao acetato de tocoferol. Utilizou-se cromatográfo gasoso equipado com colunas megabore DB-1 (100% dimetilpolisiloxano, polaridade 5) e DB-17 (50% fenil e 50% dimetilpolisiloxano, polaridade 24) de 0,53 mm de diâmetro interno por 30 m de comprimento. Utilizou-se como gás de arraste hidrogênio a 6 mL por minuto, split a 6 mL por minuto (razão 1:1), purga do septo 3 mL por minuto, make up nitrogênio 25 mL por minuto e oxigênio a 100 mL por minuto. O gradiente de temperatura utilizado foi: temperatura inicial 100°C com patamar de 1 minuto e rampa de aquecimento a 7 °C por minuto até 260 °C com patamar de 66 minutos. A temperatura do injetor foi de 260 °C e do detector foi de 280 °C. O volume de injeção foi de 2 mL.

Avaliação da atividade antibacteriana

Para a realização do ensaio foram utilizados dois métodos: difusão em ágar adaptado por Romeiro (2001) para o extrato etanólico bruto e fração hexano, e Concentração Inibitória Mínima (CIM), segundo Konemann et al. (1993) para o extrato bruto. Foram utilizadas as seguintes bactérias em ambos os testes: Staphylococcus aureus (ATCC 6538); Streptococcus pyogenes (ATCC 19615); Staphylococcus epidermidis (ATCC 12228); Proteus mirabilis (ATCC 43071); Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27283); Klebsiella pneumoniae (ATCC 13883); Escherichia coli (ATCC 11229); Salmonella typhimurium (ATCC 14028).

Teste de difusão em ágar

Discos estéreis de papel de 6 mm de diâmetro foram impregnados com 10 mL do EB e da FHEX nas concentrações de 100%, 50%, 25% e 12,5% conforme mostra a Tabela 1. As diluições foram feitas em etanol 96º GL e os testes realizados em triplicata.

Como padrões de inibição de crescimento foram utilizados dois discos de antibióticos comerciais, o cloranfenicol 30 mg e cefalotina 30 mg.

Os discos contendo a amostra em estudo foram secos a 40 ºC e distribuídos nas placas de Petri contendo meio ágar Mueller-Hinton, onde foram inoculadas as bactérias em solução padronizada segundo o tubo 0,5 da escala de MacFarland. Em cada placa de teste foram colocados um disco de cada diluição, um disco com etanol 96º GL (controle) e um com o padrão de cloranfenicol, totalizando seis discos por placa. Foram feitas placas-controle com os dois padrões de antibióticos e o controle com etanol 96º GL para cada microrganismo. As placas foram incubadas em estufa a 35 °C e os resultados foram lidos após 24 horas.

Concentração inibitória mínima (CIM)

Este teste foi realizado com o EB. As bactérias em suspensão na concentração padronizada pelo tubo 0,5 da escala de MacFarland foram diluídas em solução estéril de Tween 80 a 0,2% em proporção de 2:100 e inoculadas em caldo tríptico caseína de soja – CASOY. As concentrações decrescentes de extrato utilizadas para o teste, partindo-se de 312,75 mg/mL foram 1:1 (156,37 mg/mL), 1:2 (78,19 mg/mL), 1:4 (39,10 mg/mL), 1:8 (19,55 mg/mL), 1:16 (9,77 mg/mL), 1:32 (4,89 mg/mL) e 1:64 (2,44 mg/mL). O teste foi realizado em triplicata.

Como controle positivo foi preparado tubo com 1,0 mL de suspensão de bactérias e 1,0 mL de caldo nutritivo a fim de se confirmar o crescimento viável dos microrganismo durante o teste; o controle negativo foi o extrato diluído em caldo nutritivo na concentração 1:1, sem o inóculo de microrganismos visando evitar erros de leitura associados a turbidez do extrato no meio.

RESULTADOS

A análise do cromatograma da amostra FHEX obtido no cromatógrafo a gás (CG) foi efetuada por comparação com o cromatograma padrão de referências analisadas em CG por padronização interna segundo Carvalho (2001). Através desta foi evidenciada a presença de ácido fênico, ácido cinâmico, a-amirina, estigmasterol, b-amirina, b-sitosterol e lupeol, conforme figura 1 e tabela 2. A comparação baseia-se na Retenção Relativa (RR) das substâncias no cromatógrafo, com margem de 1 por cento (1%) entre os valores. Estas substâncias ainda não haviam sido relatadas na espécie em estudo.

Os resultados, expressos em média, para os controles e amostras nos testes de difusão e concentração inibitória mínima estão dispostos na Tabela 3.

DISCUSSÃO

Segundo Lenette et al. (1987) os microrganismos são suscetíveis aos antibióticos controle conforme os halos de inibição desenvolvidos, mas a P. areuginosa e E. coli demonstraram resistência à cefalotina. A não inibição de crescimento com o controle mostra que o etanol não exerceu influência sobre os resultados da atividade do extrato. O resultado da CIM para o EB indica que os mesmos microrganismos no teste de difusão foram afetados pelo extrato bruto.

Nos resultados desta avaliação preliminar foi demonstrado que ocorreu atividade antibacteriana dos produtos vegetais sobre Streptococcus pyogenes e Staphylococcus aureus. Nenhuma atividade foi observada sobre as outras bactérias testadas por difusão em ágar e foi registrada atividade moderada contra todos os microrganismos no teste de concentração inibitória mínima – CIM para o extrato bruto e fração hexano das cascas de E. velutina.

Considerando a quantidade utilizada, foi indicado pelos resultados maior atividade proporcional para a fração hexano. Os esteróides e triterpenos presentes nas plantas estão concentrados geralmente na fração mais apolar, neste caso a fração hexano, e são conhecidos por diversas atividades de interesse biológico, dentre as quais a atividade antimicrobiana. Para substâncias como o b-sitosterol, a a-amirina e lupeol foi demonstrada atividade contra as bactérias E. coli e S. aureus, a a-amirina (0,29%) demonstrou a maior atividade entre os triterpenos presentes na Arnebia hispidissima (Lehm.) DC. contra a E. coli (Singh; Singh, 2003; Jain et al., 2003).

Há de se considerar que o tamanho da zona de inibição de crescimento no teste de difusão é bastante influenciada pela velocidade de difusão das substâncias no ágar (Lenette et al, 1987), sendo assim, é possível que a baixa polaridade dos compostos da fração hexano diminua a velocidade de difusão destes no ágar, gerando um halo de inibição proporcionalmente menor em relação aos antibióticos controle que são polares e ao extrato bruto. Esses resultados colaboram na elucidação preliminar de que os compostos presentes na FHEX estão envolvidos na atividade biológica testada, podendo futuramente direcionar os estudos realizados.

Considerando os resultados dos testes nota-se que existe potencial antibacteriano e por este motivo novos ensaios estão sendo efetuados visando a melhor exploração desta atividade na fração hexano, nas frações não avaliadas e substâncias isoladas da E. velutina, na busca de novas alternativas terapêuticas que possam servir de subsídio para uma terapêutica racional a partir de fontes naturais brasileiras.

AGRADECIMENTOS

Ao Dr. Viseldo Ribeiro de Oliveira, Ph.D, da EMBRAPA Semi-Árido, pela obtenção e viabilização da identificação da espécie vegetal e As Ervas Curam Indústria Farmacêutica pelo apoio financeiro.

Recebido em 31/01/05

Aceito em 06/05/05

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  26 Maio 2008
• Data do Fascículo
  Jun 2005

Histórico

• Aceito
  06 Maio 2005
• Recebido
  31 Jan 2005