Aplicação de cromatografia centrífuga de contra-corrente na purificação de ácido ursólico das folhas de Eugenia brasiliensis Lam.

Aplication of counter-current chromatography in the purification of ursolic acid from leavesof Eugenia brasiliensis Lam.

ARTIGO

Aplicação de cromatografia centrífuga de contra-corrente na purificação de ácido ursólico das folhas de Eugenia brasiliensis Lam.

Aplication of counter-current chromatography in the purification of ursolic acid from leavesof Eugenia brasiliensis Lam.

N. FrighettoI, ^*; R.M.Welendorf^I; A.M.P. Silva^II; M.J. Nakamura^II; A.C. Siani^II

^ICentro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas - CPQBA, Universidade Estadual de Campinas - UNICAMP, C.P. 6171, Betel, 13083-970, Campinas, SP, Brasil

^IIDepartamento de Química de Produtos Naturais, Instituto de Tecnologia em Fármacos, Fundação Oswaldo Cruz FIOCRUZ, R. Sizenando Nabuco, 100, 21041-250, Rio de Janeiro, RJ, Brasil

RESUMO

Os ácidos triterpênicos são metabólitos comuns na família Myrtaceae, especialmente no gênero Eugenia. O ácido ursólico foi descrito como um dos principais constituintes, nas folhas de Eugenia brasiliensis, coletada no Sudoeste do Brasil. Uma partição prévia, por solventes, do extrato etanólico ou do extrato clorofórmico de E. brasiliensis, seguida por uma purificação por cromatografia de contra-corrente de alta velocidade (CCCAV), conduziu ao isolamento do ácido ursólico com alto grau de pureza (> 97%). Esta substância, também foi isolada por cromatografia convencional de coluna aberta (rendimento de 0.22% a partir do extrato etanólico), e caracterizada por ¹³C-RMN, GC-EM e co-injeção com padrão comercial em CG-DIC, na forma do éster metílico. A técnica de CCCAV, usualmente usada para triterpenos glicosilados, foi aqui aplicada para a aglicona. As fases móvel e estacionária, no experimento de CCCAV, foram geradas pela mistura de n-hexano : acetato de etila : metanol : água, na proporção 10:5:2,5:1. A seleção do sistema de solventes (fases estacionária e móvel) foi determinada pela máxima distribuição eqüitativa do ácido ursólico em ambas as fases, medida por densitometria e monitorada por cromatografia em camada delgada, CCD, usando-se ácido ursólico comercial como referência.

Unitermos: Eugenia brasiliensis, Myrtaceae, acido ursólico, cromatografia de contra-corrente

ABSTRACT

Triterpene acids are common metabolites in the Myrtaceae family, especially in the genus Eugenia. Ursolic acid was found in Eugenia brasiliensis collected in Southeastern Brazil. A previous solvent partition of the ethanol or chloroform extracts of the leavesof E. brasiliensis, followed by rapid high-speed counter-current chromatography (HSCCC) afforded ursolic acid in high purity (> 97%). This compound was also purified apart by conventional column chromatography (yield of 0.22% from the ethanolic extract) and characterized by ¹³C-NMR, GC-MS and co-injection of its methyl ester with standards in GC-FID. The HSCCC technique, usually applied to triterpene glycosides, was here applied successfully to an aglycone, to which examples are rarely described. The mobile and stationary phase for the HSCCC experiment were derived from the two-phase solvent system composed by n-hexane : ethyl acetate : methanol : water in the proportion of 10:5:2.5:1. The choice of the developing solvent system for optimum HSCCC separation was determined by TLC coupled to densitometric measurements of ursolic acid in both stationary and mobile phase, generated by the upper and lower layer of the system above. Commercial ursolic acid was used as standard.

Keywords:Eugenia brasiliensis, Myrtaceae, ursolic acid, counter-current chromatography.

INTRODUÇÃO

Uma grande diversidade de vegetais, normalmente utilizados como alimentos ou com aplicação medicinal, apresenta ácidos triterpênicos em sua constituição química, tanto na forma livre, quanto na forma de agliconas de saponinas triterpenóides. Na família Myrtaceae, em especial em várias espécies do representativo gênero Eugenia, relata-se a presença de ácidos triterpênicos em várias espécies. De acordo com a espécie da qual foram isoladas, as estruturas destes metabólitos usualmente variam entre os esqueletos ursano, oleonano e lupano, contendo normalmente um ou dois grupos hidroxilas. Esta correlação pode ser visualizada na Tabela 1.

Os ácidos triterpênicos mono-hidroxilados (oleanólico, ursólico e betulínico) foram muito investigados no tocante ao seu amplo espectro de atividades biológicas, onde se destacam as atividades: antiinflamatória (Liu, 1995), antineoplásica (Tokuda et al., 1986; Pisha et al., 1995), antivirótica (Pavlova et al., 2003), antimicrobiana (Sattar et al., 1995), antiparasitária (Leite et al., 2001), hepatoprotetora (Saraswat et al., 1996), e outras. Estes ácidos apresentam uma baixa ou nenhuma toxicidade, sendo, inclusive, utilizados como aditivos em bebidas, alimentos e em cosméticos (Leung; Foster, 1996). A disponibilização de ácidos triterpênicos para a composição de medicamentos ou outras aplicações exige a purificação destas substâncias, a partir de fontes naturais, em processos que sejam industrialmente viáveis e, portanto, adaptados à escala de produção. Apesar do ácido betulínico estar presente em inúmeras espécies tropicais (Hayek et al., 1989); as fontes tradicionais dessa substância são espécies européias do gênero Betula, que produzem o álcool precursor, a betulina (Kim et al., 1997). Recentemente, a técnica de cromatografia de contra-corrrente de alta velocidade (CCCAV) foi descrita como uma alternativa para a purificação de ácido betulínico a partir de extratos brutos ou semipurificados de Eugenia florida (Frighetto et al., 2002).

O presente trabalho reporta o isolamento e a purificação por cromatografia de contra-corrente de alta velocidade (CCCAV), de um outro ácido triterpênico de aplicação medicinal, o ácido ursólico, a partir de extratos brutos e semi-purificados das folhas de Eugenia brasiliensis Lam., espécie de Myrtaceae descrita como anti-reumática conhecida popularmente como "grumixama" (Corrêa, 1984). Nesta técnica cromatográfica, a composição do sistema bifásico de solventes a ser utilizado como fase estacionária e como fase móvel foi, primeiramente, estabelecido através de cromatografia em camada delgada (CCD), buscando-se condições otimizadas para uma boa resolução do material a ser separado e purificado na coluna (bobina). Além disso, como um dos critérios de eficiência do sistema bifásico, as fases resultantes devem ser susceptíveis de uma imediata separação e recomposição, após agitação intensa (Conway, 1990). O processo requer ainda que a amostra a ser analisada apresente boa solubilidade no sistema bifásico de solventes e, fundamentalmente, alcance uma distribuição eqüitativa, o mais próximo possível da unidade (1:1) em ambas as fases (Hostettmann; Marston, 2001). Para atingir estes objetivos, as concentrações de ácido ursólico, em ambas as fases testadas, foram monitoradas por CCD, cuja placa de sílica gel foi avaliada mediante leitura ótica, por meio de densitômetro. Este procedimento parametrizou a seleção da composição do sistema quaternário-bifásico de solventes para gerar as fases estacionária e móvel a serem utilizadas no CCCAV. Vários parâmetros operacionais foram ensaiados, como a escolha da fase estacionária e da fase móvel, o sentido do fluxo do solvente dentro da coluna, se na direção "cabeça-cauda" ou "cauda-cabeça", a orientação de rotação da coluna, no sentido horário ou anti-horário, a velocidade de rotação desta, expressa em rpm; os volumes relativos das fases móvel e estacionária, e a concentração da amostra injetada.

MATERIAL E MÉTODOS

Material vegetal

As folhas de Eugenia brasiliensis Lam. foram coletadas nas cercanias do campus da Universidade Estadual de Campinas, em Agosto de 1996. A espécie foi identificada pela Dra. Graziela M. Barrozo (in memoriam), e uma exsicata foi preparada e depositada no Herbário do Jardim Botânico do Rio de Janeiro, sob código RB #326234.

Obtenção dos extratos

As folhas (1,412 Kg), após secagem à temperatura ambiente, foram trituradas em um moinho de facas e, em seguida, maceradas com etanol absoluto (10 L), durante 8 dias. A filtração e evaporação do solvente forneceram 134,2 g (9.50%) de extrato I. A re-extração do resíduo de folhas com uma segunda carga de etanol (10 L, 8 dias) resultou em 58,3 g (4.13%) de extrato II. As amostras I e II foram submetidas à cromatografia líquido-líquido, no CCCAV.

Isolamento do ácido ursólico

A 20.4 g do extrato I juntou-se CHCl₃ (2 x 500 mL) e a fração solúvel (2.35 g), após evaporação, foi purificada por tratamento com éter de petróleo (3 x 100 mL). A parte insolúvel (0.400 g) foi cromatografada em coluna de sílica gel G 60, utilizando-se, como eluente, uma mistura gradiente de MeOH em CHCl₃ (0, 1, 3, 5, 8, 10, 13, 15, 20 e 100% de metanol; 50 mL cada). Foram coletadas 50 frações de 10 mL, posteriormente reunidas segundo similaridade em CCD, utilizando-se como eluente CHCl₃:MeOH 9:1. As frações 24 a 27 foram agrupadas, evaporadas, re-dissolvidas em CH₂Cl₂ e purificadas com carvão ativado (agitação, 2h), fornecendo 45,3 mg de ácido ursólico.

Instrumentação e material cromatrográfico

O espectro de IV foi obtido em espectrofotômetro Nicolet 205. O espectro de ¹³C-RMN foi obtido em um espectrômetro Bruker AC 200-A (50,3 MHz), usando-se CDCl_3, como solvente. A análise por CG-EM foi realizada em um equipamento HP, Mod. 6890, acoplado a um detector de massas, HP Mod. 5971, dotado de biblioteca de espectros Wiley (software 59943B). Foi utilizada uma coluna capilar MS-HP-5 (30m x 0,32 mm x 0,25 mm de filme), gás carreador He (fluxo 0,5 ml/min), T-injetor 250 ºC, e taxa de split 1/20. As condições de operação foram: Ti 150 ºC, ti 0 min, Tf 280 ºC, taxa de aquecimento 10º/min, fluxo de He: 1 ml/min; injeção de 1 mL de uma solução de 4-6 mg de ácido ursólico em 1 mL de CH₂Cl₂.

Nas medidas de densitometria ótica, utilizou-se um densitômetro Pharmacia-Biotech, acoplado ao software apropriado. Os experimentos de CCCAV foram executados em um aparelho P. C. (Potomac, USA), equipado com coluna múltipla, para análises em diferentes escalas.

Identificação do ácido ursólico

Após metilação com diazometano, o ácido ursólico foi identificado por IV, ¹³C-RMN, CG-EM (fragmentação característica e co-injeção com padrão de ácido ursólico comercial metilado) (Budzikiewicz et al., 1963) e CCD (comparação com padrão em diferentes sistemas de solventes). O ácido ursólico livre forneceu um espectro de IV totalmente superponível ao do padrão comercial (C=O, h_max 1693 cm^-1). O padrão de fragmentação obtido para o ursolato de metila (tempo de retenção 26.32 min. nas condições utilizadas) foi comparado com os espectros de massas do banco de dados Wiley, demonstrando compatibilidade acima de 97% [m/z 470 (M⁺), 455, 410, 262 (100%), 203, 189]. Os sinais característicos em ¹³C-RMN, para o ursolato de metila, utilizados como diagnóstico da estrutura do triterpeno pentacíclico, foram (d, ppm): 79,7 (C3; COH), 126,3 (C-12), 138,9 (C-13) e 178,8 (C-28; C=O). As comparações do ácido ursólico isolado com o padrão comercial foram realizadas em CCD (sílica gel GF 60), utilizando-se como eluentes as misturas de CHCl₃:MeOH:Et₂O 90:5:5 e benzeno:acetona 75:2; sistemas onde o ácido ursólico possui R_f de 0,49 e 0,52, respectivamente. As placas foram reveladas com iodo ou solução de anisaldeído ou vanilina em H₂SO₄.

Seleção do sistema de solventes e doseamento do ácido ursólico via densitometria ótica

Diferentes composições de um sistema quaternário, constituído de uma mistura de n-hexano (12.5% a 25%), acetato de etila (12.5% a 25%), metanol (6.25% a 25%) e água (1.25% a 25%) foram ensaiados no experimento de CCD. As amostras foram preparadas, diluindo-se os extratos I e II (2 a 5 mg) na mistura de solventes em diferentes proporções (2 mL de cada fase), e aplicadas separadamente em placas de sílica gel GF 60 (200 mm x 100 mm x 0,2 mm), usando-se uma pipeta de 10 mL. Foram também aplicadas, na mesma placa, alíquotas entre 0.50 e 2.0 mg/mL de solução de ácido ursólico padrão (2 mg/mL), com o objetivo de se atingir diferentes concentrações nos spots. A placa foi então eluída em hexano:AcOEt (1:1). Após a eluição completa, os sinais pertinentes ao ácido ursólico foram revelados com anisaldeído/ácido acético/ácido sulfúrico em álcool etílico (Wagner; Bladt, 1996) e, então, submetidos às medidas de densitometria ótica. As medidas no densitômetro foram computadas pelo número de pixels e as quantidades de ácido ursólico, presentes em cada fase, calculadas por comparação com as respostas fornecidas pelos sinais do padrão, parametrizados numa curva: concentração vs. nº de pixels. Todos os experimentos foram efetuados em duplicatas e a média das medidas consideradas.

Condições experimentais nos ensaios CCCAV

A escala analítica (volume da coluna de 14,8 mL) do equipamento de CCCAV permitiu injeções de até 20 mg de amostra (extratos I e II). As análises semipreparativas (coluna de 80 mL) e preparativas (coluna de 230 mL) permitiram injeções de 100 mg até 500 mg de amostra, respectivamente, utilizando-se um sistema quaternário-bifásico de solventes, nas condições de otimização descritas anteriormente e uma velocidade roto-elicoidal fixa da coluna (960 rpm). Uma série de ensaios foi realizada com o objetivo de definir as melhores condições operacionais para os experimentos. Para tanto, oito ensaios foram realizados, alternando cada uma das fases, como fase estacionária ou fase móvel, objetivando maximizar a retenção da fase estacionária, no sentido de minimizar sua co-eluição com a fase móvel através da coluna; variando-se a combinação de diferentes parâmetros, como: (i) bombeamento do fluxo de solventes nos sentidos cabeça-cauda x cauda-cabeça; (ii) rotação da bobina no sentido normal (horário) e sentido reverso (anti-horário), conforme está explicitado no Esquema 1.

Com base na otimização dos ensaios anteriores, todos os experimentos foram realizados com fluxo de 1,0 mL/min, 4,0 mL/min e de 2,0 a 4,0 mL/min nas colunas analítica, semipreparativa e preparativa, respectivamente. Um ensaio foi realizado com uma coluna com capacidade de 325 mL, obtida pela interligação das três colunas, que suportou carga de 1000 mg de amostra para uma única análise. O volume de fase móvel utilizado foi sempre o dobro do volume da fase estacionária em cada experimento. Foram coletadas frações entre 3-4 mL, as quais foram monitoradas por CCD e reunidas posteriormente, conforme a similaridade na composição. Ao final de cada experimento, a fase estacionária foi exaurida completamente da coluna e concentrada em evaporador rotatório, assegurando-se, através de pesagem, a recuperação da totalidade de amostra introduzida na coluna.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os experimentos de CCD/densitometria definiram o melhor sistema de solventes como a mistura composta por n-hexano : acetato de etila : metanol : água, nas proporções 10:5:2.5:1, que resultou numa relação muito próxima à distribuição eqüitativa (1:1,15) das concentrações de ácido ursólico na fase superior e inferior, respectivamente. Conforme está evidenciado no Esquema 1, apenas duas, entre as oito possibilidades, foram adequadas, no sentido de manter a fase estacionária em um nível aceitável de perda por arraste da coluna (96,4% a 76,8%), segundo os caminhos A e D, respectivamente. A condição D foi eleita como a mais eficiente, uma vez que A, embora com menor volume de co-eluição, não conduziu a uma boa separação do ácido ursólico, provavelmente, devido à interferência de outros constituintes presentes nos extratos. Conforme mostrado no ensaio D, a fase superior do sistema de solventes foi utilizada como a fase móvel, levando à obtenção do ácido ursólico com alto grau de pureza, atestada pelo único sinal em CG, pelo espectro de ¹³C-RMN e por comparação cromatográfica com a substância isolada por cromatografia em coluna aberta. Os rendimentos de ácido ursólico variaram entre 87-96% para os experimentos realizados nas escalas preparativa, semi-preparativa e analítica, com os extratos I e II.

Estes resultados credenciam o uso da técnica de densitometria acoplada a CCD, como uma ferramenta útil para o sucesso dos experimentos de separação e purificação em CCCAV, de ácidos triterpênicos, a partir de extratos vegetais brutos ou semipurificados.

A técnica de CCCAV, usualmente aplicada para a purificação de muitas classes de substâncias é, freqüentemente, descrita para saponinas de esteróides e triterpenos, flavonóides, alcalóides e outros (Marston; Hostettmann, 1994). Contudo até o momento, foi encontrada apenas uma citação da aplicação desta técnica para ácidos triterpênicos (Ito, 1990), mesmo assim, utilizando misturas menos complexas de substâncias do que aquelas presentes nos extratos das folhas, como apresentado neste trabalho. Neste sentido, as espécies contidas na Tabela 1 poderiam ser exploradas para a obtenção desse grupo de metabólitos, utilizando-se inicialmente as condições aqui desenvolvidas. Além do extrato alcoólico, outros solventes de diferentes polaridades devem ser ainda testados, no intuito de extrair os ácidos triterpênicos a partir de folhas de diferentes mirtáceas. Solventes que reduzam a extração de clorofila nos extratos a serem purificados por CCCAV seriam preferíveis, mas esta seleção está condicionada à conformação do esqueleto, assim como o grau de hidroxilação dos ácidos triterpênicos presentes no vegetal.

Por outro lado, a técnica de CCCAV deveria ser mais bem aproveitada, tanto na separação, quanto na purificação de constituintes vegetais, visando à obtenção de substâncias de referência e de padrões, principalmente quando se almeja baixar custos operacionais, por intermédio da diminuição do tempo de análise e da utilização de solventes sem alto grau de pureza, como aqueles utilizados em CCCAV. Além disso, esta técnica permite a recuperação de todo o material vegetal sob análise, evitando perdas pela adsorção ou outros tipos de fatores, inerentes à cromatografia convencional.

Recebido em 19/01/05

Aceito em 17/10/05

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  05 Maio 2008
• Data do Fascículo
  Dez 2005

Histórico

• Recebido
  19 Jan 2005
• Aceito
  17 Out 2005