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Revista Brasileira de Farmacognosia

versão impressa ISSN 0102-695X

Rev. bras. farmacogn. v.16 n.1 João Pessoa jan./mar. 2006

http://dx.doi.org/10.1590/S0102-695X2006000100011 

ARTIGO

 

Atividade antileishmania do extrato hidroalcoólico e de frações obtidas de folhas de Piper regnellii (Miq.) C. DC. var. pallescens (C. DC.) Yunck

 

Antileishmanial activity of hydroalcoholic extract and fractions obtained from leaves of Piper regnellii (Miq.) C. DC. var. pallescens (C. DC.)

 

 

Celso V. Nakamura; Adriana O. Santos; Michele C. Vendrametto; Patrícia S. Luize; Benedito P. Dias Filho; Diógenes A.G. Cortez; Tânia Ueda-Nakamura*

Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Universidade Estadual de Maringá, Av. Colombo, 5790, 87020-900, Maringá, PR, Brasil

 

 


RESUMO

A atividade biológica do extrato bruto e as várias frações obtidas de folhas de Piper regnellii (Miq.) C. DC. var. pallescens (C. DC.) Yunck foi avaliada em Leishmania amazonensis. Este estudo incluiu o processo de extração e o fracionamento biomonitorado pelo método de cromatografia de adsorção. Um aumento progressivo no efeito antileishmania foi observado durante o processo de purificação. O extrato hidroalcoólico solúvel em água (EBA) apresentou concentração inibitória 50% (IC50) igual a 167 µg/mL enquanto o extrato hidroalcoólico solúvel em acetato de etila (EBAcOEt) mostrou um IC50 de 30 mg/mL sobre o crescimento de formas promastigotas após 48 h de cultivo. A fração hexano (FHex) apresentou uma atividade antileishmania maior que o EBAcOEt com IC50 de 21,5 µg/mL. Análises de citotoxicidade indicaram que as concentrações tóxicas do EBA, EBAcOEt e das frações foram maiores para macrófagos J774G8 do que para os protozoários.

Unitermos: Piper regnellii, Leishmania amazonensis, pariparoba, atividade antileishmania, promastigota.


ABSTRACT

Biological activity of the crude extract and several fractions obtained from Piper regnellii var. pallescens was assessed on Leishmania amazonensis. This study included the extraction process and bioassay-guided fractionation by the adsorption chromatography method. A progressive increase in the antileishmanial effect was observed in the course of the purification process. The hydroalcoholic extract water soluble (EBA) had a 50% inhibitory concentration (IC50) at 167 µg/mL whereas the hydroalcoholic extract acetate soluble (EBAcOEt) showed an IC50 of 30 µg/mL against the growth of promastigote forms after 48 h of culturing. The hexan fraction (FHex) showed an antileishmanial activity greater than EBAcOEt with IC50 at 21.5 µg/mL. Analysis of cytotoxicity indicated that the toxic concentrations of the EBA, EBAcOEt, and fractions were higher for J774G8 macrophages than for the protozoans.

Keywords: Piper regnellii, Leishmania amazonensis, pariparoba, antileishmanial activity, promastigote.


 

 

INTRODUÇÃO

A leishmaniose é uma doença que afeta aproximadamente 12 milhões de pessoas no mundo. A cada ano dois milhões de novos casos são diagnosticados (WHO, 2002). Os agentes causadores dessa doença são parasitas unicelulares heteroxênicos do gênero Leishmania que apresentam duas formas morfológicas no seu ciclo de vida: promastigota e amastigota (Michalick, 2003). As formas promastigotas caracterizam-se por serem fusiformes e com longo flagelo; são extracelulares e vivem no trato digestório do inseto vetor. As formas amastigotas, por sua vez, são arredondadas e com curto flagelo que não se exterioriza; são intracelulares obrigatórias e parasitam principalmente macrófagos do hospedeiro vertebrado.

Essa zoonose compreende formas clínicas que podem ser divididas em dois grupos principais: a forma tegumentar e a forma visceral. A forma tegumentar apresenta variantes e pode ser subdivida em leishmaniose cutânea localizada, cutânea difusa e cutâneo-mucosa. Estas manifestações dependem da espécie de parasita, bem como da resposta imune do indivíduo infectado (Grevelink; Lerner, 1996; Herwaldt, 1999). O tratamento de doenças causadas por esses protozoários é difícil, pois, por serem também eucariotos compartilham muitas características com as células de mamíferos. Dessa forma, a atuação dos agentes antiparasitários ocorre em vias ou alvos comuns ao parasita e ao hospedeiro (Murray et al., 2000). Os compostos antimoniais indicados para o tratamento das leishmanioses são o Pentostan® e o Glucantime® (Croft; Coombs, 2003). Como drogas de segunda escolha podem ser utilizadas a Anfotericina B ou a Pentamidina (Grevelink e Lerner, 1996; Sereno et al., 2000). Contudo, vale lembrar que além do alto custo, essas drogas são tóxicas e apresentam muitos efeitos colaterais.

Assim, a medida profilática ideal seria o desenvolvimento de uma vacina. Embora haja muitos grupos trabalhando na tentativa de desenvolvê-la (Convit et al., 2004; Tewary et al., 2004) ainda há vários fatores que dificultam, tais como os mecanismos efetores da resposta imune no homem, além de obstáculos de ordem política e econômica (Handman, 1997). Devido a essas dificuldades, torna-se importante a busca por novos agentes quimioterápicos. Nesse contexto, uma alternativa bastante promissora é o uso de espécies vegetais, o que na verdade já vem sendo utilizado desde o início da civilização no processo de cura de inúmeras doenças (Calixto, 2000; Rocha et al., 2005). A isso tudo, acrescenta-se os avanços da medicina que possibilita a comprovação da capacidade de cura de determinadas plantas, o que garante segurança na utilização das mesmas como medicamento. Deve-se ressaltar que as drogas derivadas de plantas também podem ser prejudiciais para o organismo, uma vez que é constituída por centenas de compostos e alguns são muito tóxicos. Todavia os efeitos adversos dos agentes fitoterápicos são menores, quando comparado com o das drogas sintéticas (Calixto, 2000).

O gênero Piper (família Piperaceae) inclui um grande número de espécies conhecidas popularmente como Pariparoba muito utilizadas no tratamento de diversas doenças, cuja importância econômica e comercial se deve à produção de óleos essenciais de interesse na indústria farmacêutica e de inseticida (Corrêa, 1984; Maia et al., 1987; Silva; Machado, 1999; Santos et al., 2001; Mesquita et al., 2005). Cerca de 700 espécies pertencentes ao gênero Piper estão distribuídas nos dois hemisférios, tanto em regiões tropicais como em subtropicais (Parmar et al., 1997). Na Jamaica, de 11 espécies estudadas P. aduncun (L) e P. hispidum (SW) foram listadas como remédio para estômago e repelente de insetos. P. amalago (L.), nativa do México, é usada para aliviar dores no estômago e como antiinflamatório e P. marginatum nativa do Brasil mostrou atividade antiinflamatória (Falcão et al 2005). Raízes e frutos de P. chaba (Hunter) têm muitas aplicações na medicina, dentre elas no tratamento de asma, bronquite e dores abdominais (Parmar et al., 1997) mas, um estudo com P. nigrum dos Estados Unidos da América, não mostrou atividade antidiabética in vitro (Barbosa-Filho et al., 2005).

A Piper regnellii var. pallescens apresenta amplo espectro de atividade antimicrobiana (bactérias Gram-positivas, Gram-negativas e fungos leveduriformes) (Holetz et al., 2002; Pessini et al 2003a). Estudos fitoquímicos da raíz mostraram que esta espécie apresenta um acúmulo de vários fenilpropanóides e neolignanas dihidrobenzofuranicas incluindo o conocarpano como composto majoritário (Benevides et al., 1999; Pessini et al., 2005). Recentemente, Luize et al. (2005) demonstraram que extratos brutos de folhas de P. regnellii (Miq.) C. DC. var. regnellii apresentam atividade antileishmania e antitripanossoma.

No presente estudo foi avaliada a atividade antileishmania de extratos brutos e frações obtidas de folhas de P. regnellii var. pallescens em formas promastigota de L. amazonensis. A atividade citotóxica também foi verificada em macrófagos J774G8 através da técnica da Sulforodamina B.

 

MATERIAL E MÉTODOS

Obtenção do extrato bruto e frações

As folhas de P. regnellii var pallescens foram coletadas no Horto de plantas medicinais “Profª. Irenice Silva” do campus da Universidade Estadual de Maringá (UEM). A espécie vegetal foi identificada por MSc. Marília Borgo do Departamento de Botânica da Universidade Federal do Paraná (UFPR) e, uma exsicata foi depositada como documento taxonômico no Herbário da UEM, sob número de registro HUM 8392.

O material coletado foi seco em estufa de ar circulante (Quimis®, modelo Q-31) a temperatura de 40ºC, durante 72 h e moído em moinho de facas (Tecnal Marconi®, modelo TE 048), acondicionado e armazenado em local seco ao abrigo da luz.

As folhas secas e moídas foram extraídas com solução hidroalcoólica a 90% v/v, na proporção 1:10 (material vegetal:solvente). O extrato foi filtrado e concentrado sob pressão reduzida em evaporador rotatório. A parte solúvel em água recebeu a denominação de extrato bruto fase aquosa (EBA) e a parte insolúvel, solubilizada em acetato de etila, denominada de extrato bruto fase acetato (EBAcOEt). Os extratos foram armazenados em frascos fechados e mantidos a -20°C em freezer.

Os extratos brutos (fase aquosa e fase acetato 90%) foram submetidos aos ensaios biológicos. O EBAcOEt, que apresentou maior atividade antileishmania, foi submetido ao fracionamento por Cromatografia em Coluna (CC) de adsorção sob pressão reduzida, utilizando diferentes sistemas eluentes, sendo eles: hexano, clorofórmio, clorofórmio:acetato de etila 95:5, clorofórmio:acetato de etila 90:10, clorofórmio:acetato de etila 50:50, acetato de etila, acetona, metanol, metanol:água, cujas frações foram denominadas de FHex, FClo, FCA5, FCA10, FCA50, FAac, Face, FMet, FMea, respectivamente. Estas foram posteriormente submetidas aos ensaios biológicos.

Manutenção de Leishmania amazonensis

Formas promastigotas de Leishmania amazonensis (cepa WHOM/BR/75/JOSEFA) foram cultivadas em meio Warren (Warren, 1960) pH 7.2, suplementado com 10% de soro fetal bovino inativado (SFB – Cultilab, Campinas) a 28 ºC. As amostras foram mantidas através de passagens semanais no mesmo meio.

Atividade antipromastigota

Para avaliar o efeito dos extratos brutos e frações obtidas de folhas de P. regnelli var pallescens no crescimento das formas promastigotas de L. amazonensis, estes foram dissolvidos em dimetilsulfóxido (DMSO), obtendo-se uma solução estoque de 10.000 µg/mL. Em seguida foram realizadas diluições em meio de Warren para obter concentrações finais de 1000, 500, 100 e 10 µg/mL. Nestas foram adicionados os protozoários com 72 h de cultivo (inóculo inicial de 1x106 céls/mL). Os ensaios foram realizados em microplacas de 24 poços, incubadas a 28 ºC. Após 72 h, o crescimento foi avaliado através da contagem dos protozoários em câmara de Neubauer. Anfotericina B utilizado como controle positivo foi obtido de Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda, Itapira, São Paulo, Brasil.

Ensaio de citotoxicidade pelo método colorimétrico da sulforodamina B

Cem microlitros de uma suspensão de macrófagos J774G8 (5 x 105 céls/mL em RPMI 1640) foram semeados em placas de 96 poços incubados a 37°C com tensão de 5% de CO2. Após 24 h de incubação foram adicionadas 100 mL das várias concentrações das soluções do extrato bruto e frações das folhas de P. regnellii e incubadas por mais 48 h. O crescimento celular foi avaliado através do método colorimétrico de sulforodamina B previamente descrito (Skehan et al., 1990) com poucas modificações. As células foram fixadas com 50 µL de ácido tricloroacético a 10% em temperatura de 4ºC por 1 h, lavadas 5 vezes com água corrente e secas. Em seguida foram adicionados 50 µL de solução de sulforodamina B (0,4% p/v em de ácido acético aquoso 1%) em cada poço e a placa foi incubada por 30 min a 4ºC ao abrigo da luz. O corante foi removido lavando-se os poços 4 vezes com ácido acético 1%. Para avaliação do crescimento celular foram adicionados 150 µL de Tris base a 10 mM em cada poço, a placa foi agitada por 15 min e a leitura realizada em leitor de ELISA (Bio-Tek FL-600 Microplate Fluorescence Reader), em densidade óptica (DO) de 550 nm.

Análise estatística

Os dados foram analisados através da Análise de Variância (ANOVA) seguido pelo teste de Tukey. O nível de significância aceito foi de p <0,05.

 

RESULTADOS E DISCUSSÃO

No presente estudo foram avaliadas as atividades dos extratos brutos e suas frações, obtidas a partir de folhas de Piper regnellii var pallescens,sobre formas promastigota de L. amazonensis cultivada em meio de Warren a 28 °C durante 72 h.O efeito do extrato bruto hidroalcoólico fase aquosa e fase acetato de etila no crescimento de formas promastigotas de L. amazonensis está representado na Figura 1. O EBAcOEt apresentou maior atividade sobre L. amazonensis com uma Concentração Inibitória 50%(IC50) de 30 µg/mL, quando comparado com o EBA (IC50 de 167 µg/mL). Por apresentar um efeito antileishmania maior o EBAcOEt foi submetido ao processo de fracionamento utilizando-se uma coluna cromatográfica de adsorção sob pressão reduzida.

 

 

A Figura 2 mostra os resultados da atividade antileishmania das 9 frações (FHex, FClo, FCA5, FCA10, FCA50, FAac, Face, FMet, FMea) obtidas a partir do EBAcOEt. As frações FHex e FClo foram as que apresentaram melhor atividade com um IC50 de 21,5 e 32,0 µg/mL, respectivamente. Por outro lado as frações de polaridade crescente (FCA5, FCA10, FCA50, FAac, Face, FMet, FMea) apresentaram uma atividade inibitória inferior a do EBAcOEt com um IC50 de 176,5, 188,2, 133,3, 123,5, >1.000, >1.000 e >1.000 µg/mL, respectivamente. O DMSO na concentração máxima utilizada (1%) não interferiu no crescimento do parasita. Anfotericina B foi utilizada como controle positivo contra L. amazonensis e apresentou um IC50 de 0,060 µg/mL (dados não mostrados).

 

 

Em um estudo realizado com formas epimastigotas de Trypanonosoma cruzi (Chagas), Luize et al. (2002) verificaram que o extrato bruto fase acetato de etila, obtido a partir de folhas de Piper regnellii, apresenta IC50 de 54,0 µg/mL e a fase aquosa IC50 > 500 µg/mL. Similarmente aos resultados obtidos no presente trabalho, as frações menos polares do EBAcOEt apresentaram maior atividade tripanocida. As frações FHex e FClo, a uma concentração de 100 µg/mL, foram capazes de inibir o crescimento das formas epimastigotas em 92,2 e 86,9 %, respectivamente.

Diversos estudos têm demonstrado a atividade biológica das espécies de plantas pertencentes ao gênero Piper. Extrato de folhas de P. aduncum apresenta atividade antigonorréica (Cáceres et al., 1995), extrato de P. methysticum apresenta atividade antifúngica (Locher et al., 1995) e extrato clorofórmio de P. sarmentosum demonstra considerável efeito antimalárico (Rahman et al., 1999). Pessini et al. (2003b) relataram uma forte atividade de P. regnellii sobre Staphylococcus aureus e Bacillus subtilis, uma moderada atividade em Pseudomonas aeruginosa e uma fraca atividade em Escherichia coli.

Produtos naturais têm um grande potencial na pesquisa por novos e seletivos agentes para o tratamento de importantes doenças causadas por protozoários (Wright; Phillipson, 1990). Várias classes de substâncias já foram isoladas a partir de espécies do gênero Piper tais como alcalóides, lignanas, neolignanas, terpenos e ácido benzóico e têm se mostrado bioativas (Zacchino et al., 1997; Park et al., 2002; López et al., 2002; Martins et al., 2003).

Um importante critério na pesquisa de compostos ativos com potencial terapêutico contra L. amazonensis, é determinar a ausência de efeitos tóxicos nas células do hospedeiro. A citotoxicidade para macrófagos J774G8 e para protozoários foi comparada utilizando o índice de seletividade (IS), que consiste na razão entre a Concentração Citotóxica 50% (CC50) para células J774G8 e IC50 para protozoários. Os resultados de IS apresentados na Tabela 1 mostram que o EBAcOEt e a FHex são 9,1 e 6,4 vezes menos tóxicos para as células J774G8 do que para os protozoários. Resultado interessante também foi obtido com a fração FClo que apresentou atividade antileishmania semelhante ao do EBAcOEt, porém com um IS de aproximadamente 3,4 vezes maior.

Os resultados do presente trabalho demonstram que o extrato e frações obtidas de folhas de P. regnellii var pallescens apresentam atividade antileishmania. Estudos fitoquímicos e biológicos estão sendo realizados em nosso laboratório com a P. regnellii var pallescens para o isolamento e identificação de substâncias bioativas em L. amazonensis a partir das frações que apresentaram boa atividade.

 

AGRADECIMENTOS

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico – CNPq, Capacitação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – CAPES, Financiadoras de Estudos e Projetos – FINEP, PRONEX/Fundação Araucária e Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Estadual de Maringá pelo auxílio financeiro.

 

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Recebido em 30/05/05
Aceito em 23/01/06

 

 

* E-mail: tunakamura@uem.br, Tel. + 55-44-32614863, Fax + 55-44-32614860