Atribuição dos deslocamentos químicos dos átomos de ¹H e 13C do acetato de acantoaustralida

1H and 13C NMR assignments of acanthoaustralide-1-O-Acetate

Resumos

Do extrato hidroetanólico das partes aéreas de Acanthospermum australe (Asteraceae) foram identificados uma lactona diterpênica, o acetato de acantoaustralida (1) e dois flavonoides: quercetina (2) e crisosplenol D (3). As estruturas foram identificadas através de técnicas espectroscópicas de RMN de ¹H e 13C, gHSQC, gHMBC, TOCSY, gNOESY, EM e pela comparação com dados da literatura.

Acanthospermum australe; Asteraceae; lactona diterpênica; flavonóides

From the hydroethanolic extract of the aerial parts of Acanthospermum australe (Asteraceae) a diterpene lactone, acanthoaustralide-1-O-Acetate (1) and two flavonoids: quercetin (2) and chrysosplenol D (3) were identified. The structures were determined though the use of spectroscopic techniques such as NMR (¹H, 13C{¹H}, gHSQC, gHMBC, TOCSY, gNOESY), MS and compared with the literature data.

Acanthospermum australe; Asteraceae; diterpene lactone; flavonoids

ARTIGO

Atribuição dos deslocamentos químicos dos átomos de ¹H e ¹³C do acetato de acantoaustralida

¹H and ¹³C NMR assignments of acanthoaustralide-1-O-Acetate

Lúcia R. Rocha Martins^I; Lúcia E. Ranieri Cortez^II; Benedito P. Dias-Filho^III; Celso V. Nakamura^III; Antônio G. Ferreira^IV; Diógenes A. Garcia Cortez^V,*

^IDepartamento de Farmácia e Farmacologia, Universidade Estadual de Maringá, 87020-900, Maringá, PR, Brasil

^IICentro Universitário de Maringá, Avenida Guedner 1610, Jd. Aclimação, 87050-390, Maringá, PR, Brasil

^IIIDepartamento de Análises Clínicas, Universidade Estadual de Maringá, 87020-900, Maringá, PR, Brasil

^IVDepartamento de Química, Universidade Federal de São Carlos, Caixa Postal 676, 13565-955, São Carlos, SP, Brasil

^VDepartamento de Farmácia e Farmacologia, Universidade Estadual de Maringá, 87020-900, Maringá, PR, Brasil

RESUMO

Do extrato hidroetanólico das partes aéreas de Acanthospermum australe (Asteraceae) foram identificados uma lactona diterpênica, o acetato de acantoaustralida (1) e dois flavonoides: quercetina (2) e crisosplenol D (3). As estruturas foram identificadas através de técnicas espectroscópicas de RMN de ¹H e ¹³C, gHSQC, gHMBC, TOCSY, gNOESY, EM e pela comparação com dados da literatura.

Unitermos: Acanthospermum australe, Asteraceae, lactona diterpênica, flavonóides.

ABSTRACT

From the hydroethanolic extract of the aerial parts of Acanthospermum australe (Asteraceae) a diterpene lactone, acanthoaustralide-1-O-Acetate (1) and two flavonoids: quercetin (2) and chrysosplenol D (3) were identified. The structures were determined though the use of spectroscopic techniques such as NMR (¹H, ¹³C{¹H}, gHSQC, gHMBC, TOCSY, gNOESY), MS and compared with the literature data.

Keywords: Acanthospermum australe, Asteraceae, diterpene lactone, flavonoids.

INTRODUÇÃO

A família Asteraceae é cosmopolita, contando com aproximadamente 1.100 gêneros e 25.000 espécies amplamente distribuídas em todo o mundo e, no Brasil, relata-se a ocorrência de cerca de 180 gêneros. O gênero Acanthospermum compreende 4 espécies: A. australe, A. hispidum, A. humile e A. xanthioides. A espécie Acanthospermum hispidum tem sido muito utilizada em pesquisas de atividades biológicas, baseadas na utilização popular dessa espécie no Brasil e em várias partes do mundo (Morais et al., 2005; Tôrres et al., 2005; Noumi; Dibakto, 2000). Uma forte atividade antiviral in vitro e baixa citotoxicidade de Acanthospermum hispidum tem sido relatada em pesquisas, utilizando alfa herpes virus (Summerfield et al., 1997) e HIV-1-RT (Ali et al., 2002) em cultura de células. Em 2003, foram pesquisadas as atividades antimicrobiana (Fleischer et al., 2003) e antiplasmodial (Sanon et al., 2003) do extrato de Acanthospermum hispidum , obtendo-se diferentes níveis de atividade antimicrobiana sobre bactérias Gram positivas, além de relevante atividade sobre o agente etiológico da malária (Carvalho; Krettli, 1991; Carvalho et al., 1991; Brandão et al., 1992).

A espécie Acanthospermum australe é um vegetal herbáceo, nativa da América tropical e amplamente dispersa no Brasil, onde cresce com grande vigor em solos agrícolas de campos e em cerrados de textura arenosa, pastagens e terrenos baldios. Popularmente, é conhecida como carrapichinho ou carrapicho-de-carneiro e seus ramos são amplamente empregados na forma de chás por infusão ou decocção, sendo considerada tônica, diaforética, eupéptica, vermífuga, antidiarréica, antimalárica, antiblenorrágica, febrífuga e antianêmica (Lorenzi; Matos, 2002). Em 1987, Shimizu et al. (1987) relataram o uso de A. australe no tratamento de estagnações sangüíneas, reumatismos e artrites por via oral, além do uso externo em inchaços e hemorragias. Nesse trabalho, o extrato etanólico bruto de A. australe foi analisado quanto à atividade inibitória sobre a enzima aldose redutase em ratos.

Foi constatado por Carvalho et al. (1991) e por Krettli et al. (2001), que o extrato bruto de Acanthospermum australe foi parcialmente ativo contra Plasmodium falciparum em ratos infectados. Em 1997, Macedo et al.(1997) pesquisaram a atividade larvicida do extrato de Acanthospermum australe , sobre larvas de Aedes fluviatilis. Mendes et al.(1999) pesquisaram a atividade moluscicida do extrato etanólico de A. australe. Portillo et al. (2001) pesquisaram a atividade anti-fúngica sobre fungos leveduriformes e dermatófitos do extrato de A. australe.

Bohlmann et al. (1981) constataram a presença de muitas lactonas sesquiterpênicas e diterpênicas, obtidas a partir das partes aéreas de Acanthospermum australe. Do extrato etanólico bruto das partes aéreas de Acanthospermum australe foram isolados os flavonóides: trifolina, hiperina, rutina, penduletina, axilarina, crisosplenol D e 5,7,4’-trihidroxi-3,6-dimetoxiflavona, quercetina, bem como o ácido cafeico (Debenedetti et al.1987; Shimizu et al. 1987) e 6-metoxi flavonóides (Debenedettis et al., 1987). Em 1996, Matsunaga et al.(1996) isolaram um germacranolídeo, denominado acantostral, que apresentou atividade inibitória sobre tumores cancerosos.

Recentemente Martins et al. (2006) realizaram uma descrição morfoanatômica do caule, da folha e do pó de Acanthospermum australe , contribuindo com dados para análise de seu perfil farmacognóstico.

Este artigo descreve o estudo químico das partes aéreas (caule, folhas, flores e frutos) de Acanthospermum australe , coletado em Campo Grande, Mato Grosso do Sul. A análise do extrato hidroetanólico (90:10 v/v) permitiu a identificação da lactona diterpênica conhecida como acetato de acantoaustralida (1) além dos flavonóides: quercetina (2) e crisosplenol D (3). A determinação estrutural através da análise de dados espectrométricos de RMN ¹H e ¹³C (1D e 2D) permitiu caracterizar a lactona diterpênica 1 e estabelecer a completa atribuição dos deslocamentos químicos dos átomos de hidrogênio e carbono. A determinação estrutural do flavonóide 3 permitiu eliminar o equívoco de atribuição feita pelo autor que isolou esta substância pela primeira vez (Wang et al. 1989).

MATERIAL E MÉTODOS

Procedimentos experimentais gerais

Os espectros de RMN de ¹H (400 MHz) e de ¹³C (100 MHz) foram registrados em equipamento BRUKER AVANCE, utilizando-se o sinal do TMS como referencial interno. O CDCl₃ e DMSO-d₆ foi usado como solvente e referência secundária. Os espectros de massa por eletrospray, nos modos positivo e negativo, foram obtidos em espectrômetro de Micromass Quattro LC com interface API. Os espectros de UV foram obtidos no espectrômetro VARIAN Cary 1E e para os espectros na região do infravermelho foi utilizado o aparelho Nicolet Protégé .

As separações cromatográficas em coluna por adsorção foram realizadas utilizando-se a técnica de cromatografia em coluna com sílica gel 60 (70-230 mesh) e também no modo flash com sílica gel 60 (230-400 mesh ASTM, Merck). Foram também utilizadas CC em gel de SEPHADEX^® LH-20 para a purificação de substâncias. Para as cromatografias em camada delgada analítica utilizou-se sílica-gel GF₂₅₄ Merck, e as placas foram reveladas sob luz ultravioleta nos comprimentos de onda de 254 a 366 nm e pela utilização do revelador de Godin.

Revelador de Godin. Solução A: vanilina 1% (m/v) em etanol; Solução B: ácido perclórico 3% (v/v) em água. No momento do uso, misturar as soluções A e B (1:1 v/v). Borrifar sobre a placa de CCD e aquecer a 100ºC.

Material vegetal

As partes aéreas foram coletadas em abril de 2003, na periferia da cidade de Campo Grande/MS, identificadas pela Prof. Dra. Ubirazilda Maria Resende (Universidade Federal de Mato Grosso do Sul – Departamento de Botânica) e uma exsicata foi depositada no herbário do Departamento de Botânica da Universidade Estadual de Maringá (HUM 10.508).

Obtenção dos extratos

O material vegetal (caule, folhas, flores e frutos), depois de seco em temperatura ambiente por uma semana, foi triturado em moinho de facas, obtendo-se 679 g de pó. O pó foi extraído pelo processo de remaceração com etanol:água (9:1 v/v) até o esgotamento total dos princípios ativos. O extrato hidroalcoólico foi evaporado em rotaevaporador a vácuo em temperatura de 40 °C até a eliminação total do solvente orgânico e liofilizado, obtendo-se 96,9 g do extrato bruto (EB), sendo armazenado em freezer.

Isolamento dos constituintes

O EB (90 g) foi cromatografado em coluna empacotada com sílica gel à vácuo, utilizando-se como fase móvel solventes orgânicos de polaridade crescente: hexano; hexano:diclorometano (1:1 v/v); diclorometano; diclorometano:acetato de etila (1:1 v/v); acetato de etila; metanol e metanol:água (9:1 v/v). Foram obtidas 7 frações após a evaporação do solvente orgânico: (F1 = 4,92 g), (F2 = 5,29 g), (F3 = 2,74 g), (F4 = 7,96g), (F5 = 2,34 g), (F6 = 48,69 g), (F7 = 1,68 g).

Da fração F3 (1,16 g) foi cromatografada em coluna de sílica gel, utilizando-se como eluentes: hexano, hexano:diclorometano (98:2, 95:5, 90:10, 80:20, 50:50 v/v), diclorometano, diclorometano:acetato de etila (98:2, 95:5, 90:10, 80:20, 50:50 v/v), acetato de etila, acetato de etila:acetona (50:50 v/v), metanol e metanol:água (90:10 v/v), sendo obtidas 13 frações (D1-D13). A fração D9 (241 mg) foi recromatografada em coluna de sílica pelo método flash, em gradiente de polaridade: hexano; hexano:diclorometano (1:1 v/v); diclorometano; diclorometano:acetato de etila (96:4 e 90:10 v/v) e metanol, sendo obtidas 9 frações (D9A-D9I). A subfração D9C (5,6 mg) foi identificada como uma lactona diterpênica, o acetato de acantoaustralida (1).

Da fração F4 (2,12 g) foi fracionada em coluna cromatográfica de SEPHADEX LH-20, eluída clorofórmio:metanol (50:50 v/v). Frações de 20 mL foram coletadas e reunidas com base na análise com CCD em 9 frações (F4.1 a F4.9). A fração F4.5 (43 mg) foi recromatografada em coluna de SEPHADEX LH-20, em sistema isocrático, utilizando etanol:água (90:10 v/v) e forneceu a substância 2 pura (3 mg). A fração F4.8 (73 mg) foi recromatografada em coluna no método flash, utilizando-se como eluentes: clorofórmio, clorofórmio:acetato de etila (98:2, 95:5, 90:10, 80:20 e 50:50 v/v), acetato de etila e metanol, e forneceu a substância 3 pura (5 mg).

Dados físicos das substâncias isoladas

Acetato de acantoaustralida (1): Óleo amarelo-escuro, UV (CHCl₃) l_max/nm (log e): 284 (1,26), 324 (1,08), 432 (1,69), 452 (1,88), 484 (1,51). IV: nmáx.^NaCl cm^-1: 3446, 2930, 1736, 1449, 1379, 1238, 1078, 1022. RMN de ¹H (Tabela 1). RMN de ¹³C (Tabela 1). ESI-MS: m/z (int. rel.): 379 [M+H]⁺, 418 (13) [M+k]⁺, 402 (100) [M+Na]⁺, 342 (86) [M-HOAc]⁺.

Quercetina (2): Sólido amarelo, UV (CH₃OH) l_max/nm (log e): 255 (1,57), 298 (0,77), 370 (1,23). RMN de ¹H (Tabela 2). RMN de ¹³C{¹H} (Tabela 2). ESI-MS: m/z (int. rel.): 301 (100) [M-H]^-.

Crisosplenol D (3): Cristais amarelos, UV (CH₃OH) l_max/nm (log e): 260 (1,63), 355 (1,63). RMN de ¹H (Tabela 3). RMN de ¹³C{¹H} (Tabela 3). ESI-MS: m/z (int. rel.): 359 (61) [M-H]^-, 344 (100) [M-CH₃], 329 (60) [344-CH₃].

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A substância 1 apresentou o pico do íon quasi molecular [M+H]⁺em m/z 379, no espectro de massas que, aliado aos dados obtidos de RMN ¹³C {¹H} (Tabela 2), permitiu sugerir a fórmula molecular C₂₂H₃₄O₅ e uma massa molecular de 378 u.m.a. As absorções na região do infravermelho em 3446 cm^-1 correspondentes a uma hidroxila e em 1736 cm^-1 e uma carbonila conjugada, sugerem ser a substância uma lactona diterpênica encontrada em substância já isolada no Acanthospermum australe (Bohlmann et al., 1981). O espectro de RMN ¹H desta substância apresentou um singleto em d_H 2,06, correspondente a presença de uma metila de acetila, três grupos metil olefínicos em d_H 1,67 (CH₃-16), 1,59 (CH₃-17) e 1,76 (CH₃-20), além de um grupo metílico alifático em d_H 1,34 (H-19). A presença de hidrogênios olefínicos pode ser observada em d_H 6,29 (t, J 9,4 Hz, H-10), em d_H 5,09 (t, J 12 Hz, H-14) e em 5,38 (t, J 14,9 Hz, H-2), os dois últimos correspondentes a duas unidades isopentenila. A presença de um hidrogênio carbinólido pode ser observada em d_H 3,49 (dd; J 12,0 e 1,7 Hz, H-6). O espectro de RMN ¹H de 1 mostrou sinais de hidrogênios metilênicos os quais são observados em H-1 [d_H-1A 4,52 (dd, J 8,3 e 2,6 Hz); d_H-1B 4,63 (t, J 14,2 Hz)], H-4 [d_H-4A 2,29 (m); d_H-4B 2,36 (m)], H-5 [d_H-5A 1,70 (m); d_H-5B 1,46 (m)], H-8 [d_H-8A 1,89 (m); d_H-8B 2,13 (m)], H-9 [d_H-9A 2,51 (m); d_H-9B 2,44 (m)], H-12 [d_H-12A 2,24 (m); d_H-12B 2,52 (m)] e H-13 [d_H-13A 2,10 (m); d_H-13B 2,15 (m)]. Correlações heteronucleares de carbono e hidrogênio observados nos espectros gHSQC (¹J_CH) e gHMBC (^2,3J_CH) permitiram identificar os sinais dos carbonos hidrogenados e quaternários da lactona diterpênica. A posição do acetato no carbono C-1 e uma metila em C-7 foi confirmada através das interações heteronucleares de átomos dos hidrogênios metilênicos [d_H-1A 4,52 (dd; J 8,3; 2,6 Hz); d_H-1B 4,63 (t; J 14,2) com o carbono da carbonila do acetato em d_C 171,2 e dos átomos de hidrogênio metílicos d_H-19 1,34 (s) com o carbono C-7 (d_C 84,7) respectivamente, observados nos espectros gHSQC (¹J_CH) gHMBC (^2,3J_CH). A confirmação do grupo carbonila da lactona baseou-se também nos espectros de RMN ¹³C {¹H}_. A posição da hidroxila pode ser estabelecida pelo correlacionamento interação spin-spin entre os sinais de C-6 (d_C 76,7) e H-4 [d_H-4A 2,29 (m); d_H-4B 2,36 (m)], H-8 [d_H-8A 1,89 (m); d_H-8B 2,13 (m)], H-19 [d_H 1,34 (s)]. A configuração dos carbonos C-7 e C-8 não puderam ser estabelecidas, mas a posição cis da metila em C-7 em relação aos átomos de hidrogênio H-6 [d_H-6 3,49 (dd; J 12;1,7)], podem ser observados no espectro de gNOESY (Figura 1). Os deslocamentos químicos dos hidrogênios da substância 1 são similares aos encontrados na literatura para o acetato de acantoaustralida (Summerfield et al., 1997) (Tabela 1). Os experimentos de RMN 1D e 2D (gHSQC, gHMBC, TOCSY, gNOESY) permitiram atribuir os deslocamentos químicos de 1H e ¹³C que estão sendo relatados pela primeira vez para o acetato de acantoaustralida (Fig. 1 e 2). Esta atribuição é sem ambigüidades, permtindo inclusive fazer correções feitas pelo autor que isolou a substância 1 pela primeira vez.

Os flavonóides quercetina (2) e crisosplenol D (3), foram caracterizados principalmente com base nos espectros de RMN ¹H e ¹³C {¹H} (Tabela 1) e por comparação com dados da literatura (Lallemand; Duteil, 1977; Semple et al., 1999). O espectro de RMN ¹H da substância 3 mostrou os sinais dos átomos de hidrogênio do anel A em d_H 3,90 (s, MeO-7), 3,71 (s, MeO-6) 6,88 (s, H-8), do anel B em d_H 7,58 (d; J 2,4 Hz, H-2’), 6,88 (d; J 8,4 Hz, H-5’) e 7,48 (dd; J 2,4 e 8,4 Hz, H-6’) e do anel C em d_H 3,78 (s, MeO-3). As informações fornecidas pelos espectros de RMN ¹³C {¹H}, DEPT 135 e 2D de correlação heteronuclear (gHSQC e gHMBC) confirmam estas deduções e permitem a atribuição inequívoca dos deslocamentos químicos dos átomos de carbono C-2 e C-9 do crisosplenol D descrito por Wang et al. (1989) (M) (Tabela 2). Esta atribuição inequívoca dos deslocamentos químicos dos átomos de hidrogênio e carbono de 3 baseou-se também nas correlações a longa distância entre carbono e hidrogênio (²J_CH e ³J_CH) observadas no espectro de gHMBC (Tabela 1).

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem ao CNPq e CAPES pelas bolsas e apoio financeiro.

Recebido em 06/01/06. Aceito em 22/08/06

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  17 Maio 2007
• Data do Fascículo
  Dez 2006

Histórico

• Recebido
  06 Jan 2006
• Aceito
  22 Ago 2006