Avaliação da atividade leishmanicida in vitro de plantas medicinais

Evaluation of the in vitro leishmanicidal activity of medicinal plants

ARTIGO

Avaliação da atividade leishmanicida in vitro de plantas medicinais

Evaluation of the in vitro leishmanicidal activity of medicinal plants

Jeamile L. Bezerra^I; Graciomar C. Costa^II; Thaiana C. Lopes^II; Izabelle C.D.S. Carvalho1^I; Fernando J. Patrício^II; Sanara M. Sousa^II; Flávia M.M. Amaral^II; José Manuel M. Rebelo^III; Rosane N.M. Guerra^II; Maria Nilce S. Ribeiro^I; Flávia R.F. NascimentoII, ^*

^ILaboratório de Farmacognosia, Departamento de Farmácia, Universidade Federal do Maranhão, Campus do Bacanga, Av. dos Portugueses s/n, 65085-580, São Luís, Maranhão, Brasil

^IILaboratório de Imunofisiologia, Departamento de Patologia, Universidade Federal do Maranhão, Campus do Bacanga, Av. dos Portugueses s/n, 65085-580, São Luís, Maranhão, Brasil

^IIILaboratório de Entomologia e Vetores, Departamento de Biologia, Praça da Madre Deus, 2, 65025-580, São Luís, Maranhão, Brasil

RESUMO

Na busca de novos agentes leishmanicidas, avaliamos em culturas de promastigotas de Leishmania amazonensis o efeito dos extratos hidroalcoólicos das folhas de Tephrosia cinerea (L.) Pers. (Fabaceae), Dichorisandra sp (Commelinaceae), Syzygium jambolanum DC. (Myrtaceae), Julocroton triqueter (Lam.) Didr. var. triqueter (Euphorbiaceae), Passiflora edulis Sims(Passifloraceae), Cecropia sp (Cecropiaceae), Chenopodium ambrosioides L.(Chenopodiaceae), Pedilanhus tithymaloides (L.) Poit (Euphorbiaceae), Peristrophe angustifolia Nees(Acanthaceae) e o extrato aquoso do mesocarpo de Orbignya phalerata Mart. (Arecaceae). As promastigotas de Leishmania amazonensis foram cultivadas em presença de 31,3; 63,5; 125,0; 250,0 e 500,0 µg/mL dos extratos por 24 horas. Ao final desse período foi calculada a concentração inibitória do crescimento (CI₅₀) em relação às culturas não tratadas com os extratos. Os extratos das espécies J. triqueter, Dichorisandra sp e T. cinerea apresentaram maior eficácia em induzir a morte das promastigotas, com CI₅₀ de 29,5; 32,9 e 43,6 µg/mL, respectivamente. P. edulis, C. ambrosioides e S. jambolanum apresentaram eficácia moderada com CI₅₀ de 150,1; 151,9 e 166,6 µg/mL, respectivamente. P. tithymaloides e O. phalerata apresentaram baixo efeito leishmanicida com CI₅₀ >500 µg/mL, enquanto Peristrophe angustifolia e Cecropia spnão apresentaram efeito. Dessa forma, dos dez extratos testados, três apresentaram uma expressiva atividade leishmanicida in vitro.

Unitermos: Leishmania amazonensis, atividade leishmanicida, plantas medicinais.

ABSTRACT

Searching for new leishmanicidal agents, promastigotes forms of L. amazonensis were cultured with the hydroalcoholic extracts obtained from the Tephrosia cinerea (L.) Pers. (Fabaceae), Dichorisandra sp (Commelinaceae), Syzygium jambolanum DC. (Myrtaceae), Julocroton triqueter (Lam.) Didr. var. triqueter (Euphorbiaceae), Passiflora edulis Sims(Passifloraceae), Cecropia sp (Cecropiaceae), Chenopodium ambrosioides L.(Chenopodiaceae), Pedilanhus tithymaloides (L.) Poit (Euphorbiaceae), Peristrophe angustifolia Nees(Acanthaceae) leaves and the aqueous extract obtained from the Orbignya phalerata Mart. (Arecaceae) mesocarp flour. The in vitro assay was performed with promastigotes incubated during 24 hours with 31.3, 62.5, 125.0, 250.0 and 500.0 µg/mL of each extract. Then the inhibitory concentration of the parasite growth (IC₅₀) was determined. The effectiveness of J. triqueter, Dichorisandra sp and T. cinerea hydroalcoholic extracts to induce promastigotes death was intense since the IC₅₀ were 29.5; 32.9 and 43.6 µg/mL, respectively. P. edulis, C. ambrosioides and S. jambolanum extracts had moderated effectiveness since the IC₅₀ were 150.1; 151.9 and 166.6 µg/mL, respectively. P. tithymaloides and O. phalerata extracts showed a low efficacy in comparison with IC₅₀ >500 µg/mL. Peristrophe angustifolia and Cecropia sp extracts had no leishmanicidal effect. Thus, three of the ten extracts that were tested showed a significant in vitro leishmanicidal activity.

Keywords: Leishmania amazonensis, leishmanicidal activity, medicinal plants.

INTRODUÇÃO

A leishmaniose é uma doença infecciosa, não contagiosa, causada por protozoários do gênero Leishmania, endêmica ao redor do mundo, que afetamais de 12 milhões de pessoas mundialmente e apresenta alta endemicidade, morbidade e mortalidade em populações da África, Ásia e América Latina (WHO, 2002, Dujardin, 2006).

No Brasil ocorre em todo o território, tanto a Leishmaniose visceral (LV) como a Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA), as quais são endêmicas nas regiões Norte e Nordeste, devido principalmente às características econômicas e culturais dessas populações, predominando principalmente nos estados da Bahia, Ceará, Piauí e Maranhão (Ministério da Saúde, 2000; Rath et al., 2003).

O Estado Maranhão apresenta grande incidência de leishmanioses em 88% de seus municípios, sendo o município de Buriticupu, situado na região pré-amazônica do Estado, o que apresenta os mais altos coeficientes de detecção da LTA (Silva et al., 1979; Costa et al., 1998; Rebêlo et al., 2001a,b; Rebêlo et al., 2000 a,b; Martins, 2002; Caldas et al., 2002).

O tratamento das leishmanioses é feito à base de antimoniais pentavalentes, anfotericina B e pentamidinas, as quais são tóxicas, de custo elevado, difícil administração e podem causar resistência ao parasito (Rath et al., 2003; Croft; Coombs 2003). Novas drogas como miltefosine, um hexadecil-fosfocolina, têm demonstrado ser efetivo para o tratamento de LV, muito embora apresentem também alta toxicidade (Sindermann et al., 2004). A internação prolongada e os efeitos adversos como alterações cardíacas, renais, pancreáticas e hepáticas dificultam a adesão ao tratamento. Considerando as dificuldades de tratamento e a ausência de vacinas, há urgência na busca de novas drogas terapêuticas dentre as quais se incluem os fitoterápicos (Carvalho; Ferreira, 2001; Paula et al., 2003; Nakamura et al., 2006).

De acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS), as espécies vegetais são a melhor e maior fonte de fármacos para humanidade. Estudos etnobotânicos têm demonstrado o uso popular de plantas no tratamento das leishmanioses tanto por via oral, como na aplicação tópica sobre as lesões cutâneas (França et al., 1993; 1996; Mathias; Emily, 1993; Silva et al., 1995; Moreira et al., 2002). Muitos vegetais apresentam em sua composição substâncias das classes dos alcalóides, terpenos, lignanas, chalconas, flavonóides e lactonas sesquiterpênicas, compostos descritos na literatura como eficazes na atividade leishmanicida e/ou anti-Leishmania (Iwu et al., 1994; Queiroz et al., 1996; Torres-Santos, 1999; Kam et al., 1999; Rocha et al., 2005).

Este trabalho avaliou o efeito leishmanicida in vitro dos extratos hidroalcoólicos de folhas das espécies Tephrosia cinerea (L.) Pers., Dichorisandra sp, Syzygium jambolanum D.C., Julocroton triqueter (Lam.) Didr. var. triqueter, Passiflora edulis Sims, Chenopodium ambrosioides L., Pedilanthus tithymaloides (L.) Poit., Peristrophe angustifolia Nees, Cecropia sp e do extrato aquoso do mesocarpo de Orbignya phalerata Mart., em formas promastigotas de Leishmania amazonensis.

MATERIAL E MÉTODOS

Material vegetal

Folhas de Tephrosia cinerea (L.) Pers. (Fabaceae), Dichorisandra sp (Commelinaceae), Syzygium jambolanum DC. (Myrtaceae), Julocroton triqueter (Lam.) Didr. var. triqueter (Euphorbiaceae), Passiflora edulis Sims(Passifloraceae), Chenopodium ambrosioides L.(Chenopodiaceae), Pedilanthus tithymaloides (L.) Poit.(Euphorbiaceae), Peristrophe angustifolia Nees(Acanthaceae) e Cecropia sp(Cecropiaceae) foram coletadas no Campus da Universidade Federal do Maranhão (Bacanga/São Luís, MA/Brasil) no período de julho a setembro de 2004.

O pó do mesocarpo de Orbignya phalerata Mart. (Arecaceae) foi obtido comercialmente da empresa HENSA FARMA, São Luís, MA, Brasil. Este produto comercial foi previamente submetido a análise de autenticidade, integridade e pureza por testes físico-químicos. O pó comercial apresentou similaridade em todos os aspectos botânicos e fitoquímicos testados quando comparado com o pó de mesocarpo obtido no próprio laboratório (Batista; Ribeiro, 2003). Para identificação botânica os frutos de O. phalerata foramcoletadosemPedreiras-MA, Brasil.

As identificações botânicas foram realizadas pela Dra. Terezinha de Jesus Almeida Rêgo, no Herbário Ático Seabra, da Universidade Federal do Maranhão (UFMA), onde as exsicatas estão depositadas conforme numeração descrita na Tabela 1.

Preparação dos extratos

O pó do mesocarpo de O. phalerata (20g), foi macerado em água, filtrado, obtendo-se o extrato aquoso. Os demais extratos foram preparados a partir das folhas. As folhas foram secas em temperatura ambiente e trituradas em moinho. O pó das folhas das espécies Dichorisandra sp (39,2g), T. cinerea (480g), S. jambolanum (200g), J. triqueter (398,6g), P. edulis (100g), C. ambrosioides (200g), Cecropia sp (200g), P. tithymaloides (74,8g), P. angustifolia (127g) foram então extraídas, exaustivamente, por maceração com etanol a 70%. As soluções extrativas foram submetidas à filtração e, em seguida, concentradas em rotoevaporador à pressão reduzida. Os resíduos secos foram diluídos em solução tamponada de fosfato (PBS pH 7,2) a uma concentração final de 1mg/mL.

Atividade leishmanicida in vitro

As formas promastigotas de Leishmania amazonensis (MHOM/Br/90/BA125) foram cedidas pela Dra Aldina Barral do Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz (CPQGM), da Fundação Osvaldo Cruz (FIOCRUZ), Salvador-BA.

As culturas de promastigotas foram mantidas a 26 ºC em meio NNN enriquecido com RPMI 1640, suplementado com soro fetal bovino inativado a 10% (SIGMA), L-glutamina 2mM (GIBCO) e os antibióticos penicilina (100 U/mL) e estreptomicina (100 mg/mL) (SIGMA). Antes de cada experimento observou-se ao microscópio a motilidade flagelar dos parasitos.

Para os ensaios, o extrato previamente obtido foi diluído cinco vezes em meio Schneider completo, obtendo-se a concentração de 1 mg/mL. Deste, foram retirados 100 µL os quais foram diluídos seriadamente, em placas de 96 poços de fundo chato (Costar), na proporção de 1:2 em meio RPMI completo, resultando nas concentrações finais de 500, 250, 125, 62,5 e 31,25 µg/mL.

Em cada poço foram, então, adicionados 10 µL da suspensão contendo 5 x 10⁶ formas promastigotas de L. amazonensis por mL. Glucantime®, droga de referência no tratamento das leishmanioses, foi utilizado nas mesmas concentrações dos extratos. Como controle foram utilizadas as formas promastigotas cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado.

A atividade leishmanicida dos extratos foi avaliada pela inibição do crescimento de formas promastigotas após 24 h de incubação a 26 ºC, pela contagem do número total de promastigotas vivas, levando-se em consideração a motilidade flagelar, utilizando-se câmara de Neubauer e microscópio ótico de luz comum. A contagem foi comparada com o controle do crescimento das formas promastigotas sem os extratos. Cada concentração dos extratos foi analisada em triplicata. Os resultados foram expressos como concentração inibitória do crescimento parasitário (CI₅₀), baseado em Schmeda-Hirschman et al., (1996) e Camacho et al., (2003).

Análise estatística

Todos os ensaios foram realizados em triplicata e repetidos pelo menos uma vez. Os resultados foram expressos como concentração inibitória do crescimento parasitário (CI₅₀), calculados por regressão linear.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Diversos compostos químicos, isolados de extratos vegetais, têm comprovada atividade leishmanicida sobre formas promastigotas e/ou amastigotas de Leishmania em ensaios in vitro. Já foi relatada a atividade leishmanicida de terpenóides (Sauvain et al., 1996; Camacho et al., 2000), aminoglicosteróides e aminosteróides (Kam et al., 1997), naftoquinonas (Fournet et al., 1992; Kayser et al., 2000), chalconas (Chen et al., 1993; Boeck et al., 2006), glicosídios iridóides (Mittal et al., 1998), flavonóides (Araújo et al., 1998), lignanas (Barata et al., 2000; Royo et al., 2003) e de alcalóides (Mahiou et al., 1994; Fournet et al, 1996; Queiroz, et al., 1996). Apesar dos vários estudos nesta área, ainda existem muitas espécies vegetais com potencial atividade leishmanicida a serem avaliadas.

Neste trabalho foi avaliado o efeito leishmanicida de dez extratos de plantas de diferentes famílias. A escolha das espécies nesse estudo foi baseada na quimiossistemática dos gêneros, no uso popular no tratamento de úlceras e na disponibilidade local.

A avaliação dos extratos das espécies mostrou que seis deles apresentaram atividade leishmanicida significativa, sendo que três espécies, J. triqueter, Dichorisandra sp e T. cinerea apresentaram maior eficácia, com base na CI₅₀ (29,5; 32,9 e 43,6 µg/mL, respectivamente) como mostra a Tabela 2. Os extratos de T. cinerea e J. triqueter var. triqueter apresentaram 100% de atividade leishmanicida nas concentrações de 500 e 250 µg/mL, e Dichorisandra sp. apresentou 100% de atividade na maior concentração testada.

Julocroton triqueter var. triqueter, a espécie mais efetiva, é conhecida popularmente como velame, sendo encontrada desde a região norte até a região sudeste do Brasil. O pó das suas folhas é usado no tratamento de úlceras, sífilis e como depurativo (Pio Corrêa, 1984), porém, há poucos estudos farmacológicos e/ou químicos sobre essa espécie, muito embora já tenham sido identificados alcalóides no gênero Julocroton (Suarez et al., 2004).

Dichorisandra sp, a segunda espécie mais eficaz, épopularmente conhecida como penicilina sendo indicada popularmente para tratar infecções. Martinez et al. (1993) relataram a presença de glicosídeos de apigenina, luteolina, quercetina, 6-hidroxiluteolina e tricina em três espécies do gênero Dichorisandra. Mittra et al. (2000) demonstraram efeito inibitório in vitro dos flavonóides luteolina e quercetina sobre o crescimento de formas promastigotas e amastigotas de Leishmania donovani, uma das espécies responsáveis pela leishmaniose visceral. Esses autores também demonstraram que o tratamento in vivo, por via oral, com essas substâncias, causou uma significativa redução da carga parasitária em baços de hamsteres infectados com L. donovani.

As folhas de Tephrosia cinerea (L.) Pers., conhecida como anil bravo, são utilizadas pela população para tratar infecções, inflamações, úlceras, afecções nervosas e diarréias (Pio Corrêa, 1994). Sharma et al. (2003) demonstraram a ação anti-leishmanial do extrato metanólico das folhas de T. purpurea, uma espécie medicinal indiana, frenteà espécie Leishmania donovani.

Os extratos de Passiflora edulis, Chenopodium ambrosioides e Syzygium jambolanum apresentaram atividade leishmanicida menor que os outros três extratos citados anteriormente, com CI₅₀ de 150,1; 151,9 e 166,6 µg/mL, respectivamente (Tabela 2). O extrato de P. edulis apesar de ocasionar 100% de inibição no crescimento das formas promastigotas de Leishmania amazonensis na maior dose testada, apresentou CI₅₀ similar à detectada nos extratos de C. ambrosioides e S. jambolanum, que apresentaram respectivamente 63,6% e 88% de inibição da Leishmania amazonensis na maior dose testada.

Chenopodium ambrosioides conhecido vulgarmente como mastruz, tem sido usado no nordeste brasileiro no tratamento de helmintíases, bronquite, tuberculose, contusões, fraturas e feridas (França et al., 1996; Rêgo, 1995; Matos, 2000; Pereira et al., 2004; Morais et al., 2005; Tôrres et al., 2005). A ação anti-helmíntica da planta foi associada ao alto teor de ascaridol, presente no óleo essencial das folhas (Sousa et al., 1991). Moreira et al. (1998), ao estudarem o conhecimento e usos de terapias alternativas para Leishmaniose Tegumentar Americana, em populações no município de Buriticupu, Maranhão, constataram ser comum o uso de plantas sobre as feridas leishmanióticas, dentre as quais se incluem as folhas de mastruz. O dado obtido aqui pode justificar o uso popular deste vegetal no tratamento das úlceras leishmanióticas.

Passiflora edulis conhecida como maracujá, é tradicionalmente utilizada como calmante, pela população de todos os paises ocidentais. É uma espécie cultivada no nordeste brasileiro para aproveitamento industrial do fruto (Matos, 2000). O efeito leishmanicida apresentado por esta espécie pode estar relacionado com a presença dos compostos flavonoídicos e/ou terpenóides evidenciados nas folhas desses vegetais (Dhawan et al, 2004).

Syzygium jambolanum, conhecido vulgarmente como jambolão, apresenta intensa atividade antibacteriana (Loguercio et al., 2005; Michelin et al., 2005). O extrato das folhas apresentou efeito leishmanicida moderado, o que poderia ser justificado pela presença de saponinas e taninos condensados e hidrolisáveis nas folhas (Alberton et al., 2001).

O extrato de Pedilanthus tithymaloides, cuja CI₅₀ foi >500 µg/mL, não apresentou atividade leishmanicida tão intensa quanto o extrato de J. triqueter, apesar da espécie pertencer à família Euphorbiaceae. Da mesma forma, o extrato de O. phalerata apresentou atividade leishmanicidamuito baixa (CI₅₀ >500), mantendo-se na faixa de 20% de morte das promastigotas em todas as concentrações testadas.

Os extratos de Peristrophe angustifolia e de Cecropia sp não inibiram o crescimento das formas promastigotas, em nenhuma das concentrações testadas, havendo ainda um aumento do número de promastigotas viáveis, no caso do extrato de Cecropia sp, caracterizando assim um possível efeito pró-Leishmania desse extrato.

De acordo com o nosso conhecimento, este é o primeiro relato na literatura no qual os extratos das espécies aqui avaliadas sãosubmetidosa ensaios de atividade leishmanicida. As plantas testadas são comuns no Brasil, algumas nativas, outras introduzidas e já bem aclimatadas, outras cultivadas, portanto, fáceis de serem encontradas, o que nos estimula a continuidade de estudos químicos biomonitorados na busca dos princípios ativos associados à atividade leishmanicida detectada. Esses dados sugerem que tratamentos alternativos podem ser eficientes no controle das leishmanioses.

CONCLUSÃO

Em nossa investigação para atividade leishmanicida com dez plantas encontradas na flora maranhense, três apresentaram uma expressiva atividade in vitro para L. amazonensis. Esses resultados indicam a necessidade de estudos futuros para a avaliação do caráter citotóxico dos extratos, da atividade em infecções, in vivo, bem como o fracionamento na busca das substâncias responsáveis pela ação leishmanicidaencontrada.

AGRADECIMENTOS

Ao CNPq pelo auxílio financeiro (Proc n° CNPq nº 550433/2001-5 e Proc. nº 620081/2004-0 ACT), pelas bolsas PIBIC para G.C.Costa, I.C.D.S.Carvalho, F.J.Patrício, S.M. Sousa e pela bolsa de Pós-doc de R.N.M.Guerra. À Capes pela bolsa de doutorado de F.M.M Amaral. À FAPEMA pela bolsa de mestrado de J.L. Bezerra. À Dra. Aldina Barral do Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz-FIOCRUZ/BA, por fornecer as formas promastigotas de L. amazonensis utilizadas neste estudo. À Profa. Bárbara T. Silva do Departamento de Ciências Fisiológicas/UFMA pela concessão do extrato da espécie Passiflora edulis.

Recebido em 14/04/06

Aceito em 19/08/06

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  24 Mar 2008
• Data do Fascículo
  Dez 2006

Histórico

• Aceito
  19 Ago 2006
• Recebido
  14 Abr 2006