Efeito leishmanicida in vitro de Stachytarpheta cayennensis (Rich.) Vahl (Verbenaceae)

In vitro leishmanicidal effect of Stachytarpheta cayennensis (Rich.) Vahl (Verbenaceae)

ARTIGO

Efeito leishmanicida in vitro de Stachytarpheta cayennensis (Rich.) Vahl (Verbenaceae)

In vitro leishmanicidal effect of Stachytarpheta cayennensis (Rich.) Vahl (Verbenaceae)

Rosilene C.R. Moreira^I; Graciomar C. Costa^II; Thaiana C. Lopes^II; Jeamile L. Bezerra^III; Rosane N.M. Guerra^II; José Manuel M. Rebêlo^IV; Maria Nilce S. Ribeiro^III; Flávia R.F. Nascimento^II; Jackson M.L. Costa^V,*

^ICentro Universitário do Maranhão - UNICEUMA, Rua Josué Montello, n°1, Renascença II, 65075-120, São Luís, MA, Brasil

^IILaboratório de Imunofisiologia, Departamento de Patologia, Universidade Federal do Maranhão, Campus do Bacanga, Av. dos Portugueses s/n, 65085-580, São Luís, MA, Brasil

^IIILaboratório de Farmacognosia, Departamento de Farmácia, Universidade Federal do Maranhão, Campus do Bacanga, Av. dos Portugueses s/n, , 65085-580, São Luís, MA, Brasil

^IVLaboratório de Entomologia e Vetores, Departamento de Biologia, Praça da Madre Deus, nº 2, 65025-580, São Luís, MA, Brasil

^VCentro de Pesquisas Gonçalo Moniz, Fiocruz-BA, Rua Waldemar Falcão, nº 121, Brotas, 40295-001, Salvador, BA, Brasil

RESUMO

A atividade anti-Leishmania do extrato hidroalcoólico de Stachytarpheta cayennensis, espécie utilizada popularmente no tratamento de lesões cutâneas causadas por Leishmania sp, foi testado em ensaios in vitro utilizando formas promastigotas de Leishmania braziliensis e L. amazonensis. O extrato hidroalcoólico foi preparado a partir das folhas secas e utilizado em culturas de L. amazonensis e L. braziliensis nas concentrações de 500 a 32,5 µg/mL. Após 24 horas as formas promastigotas foram quantificadas para o cálculo da CI₅₀. A citotoxicidade do extrato foi avaliada também em culturas de macrófagos peritoneais. O extrato apresentou efeito leishmanicida dose e espécie-dependente para promastigotas de Leishmania sendo mais eficaz para L. braziliensis. O extrato não apresentou efeito citotóxico quando utilizado nas culturas de macrófagos. Concluiu-se que o extrato hidroalcoólico de S. cayennensis inibe formas promastigotas de Leishmania in vitro o que poderia justificar, pelo menos parcialmente, o uso popular dessa espécie no tratamento de úlceras causadas por Leishmania.

Unitermos:Starchytarpheta cayennensis, Verbenaceae, Leishmania braziliensis, Leishmania amazonensis.

ABSTRACT

Leishmanicidal activity of the hydroalcoholic extract of Stachytarpheta cayennensis, species that is usually employed in ulcers caused by Leishmania, was evaluated in vitro using Leishmania braziliensis and L. amazonensis promastigotes forms. The hydroalcoholic extract was prepared from dried leaves and used in L. amazonensis and L. braziliensis promastigotes cultures at concentrations of 500 to 32.5 µg/mL. After 24 hours the promastigotes forms were quantified and the IC₅₀ was calculated. The cytotoxicity of the extract was evaluated using peritoneal macrophages. The extract presented a dose and specie-dependent leishmanicidal effect to Leishmania promastigotes, mainly to the L. braziliensis ones. The cytotoxic effect was not observed in macrophage cultures. In conclusion, the hydroalcoholic extract of S. cayennensis inhibits the growing of Leishmania promastigotes forms in vitro accounting for the folk use of this vegetal in skin ulcers caused by Leishmania.

Keywords:Starchytarpheta cayennensis, Verbenaceae, Leishmania braziliensis, Leishmania amazonensis.

INTRODUÇÃO

As leishmanioses são doenças endêmicas causadas por protozoários do gênero Leishmania ocorrendo em várias partes do mundo, ocasionando um elevado índice de morbidade e mortalidade. Seu tratamento é feito à base de antimoniais pentavalentes (Sb⁺⁵), anfotericina B e pentamidinas (isotionato e mesilato), quimioterápicos de alto custo, usados por via parenteral, requerendo um período de administração prolongado, causando efeitos adversos, como: alterações cardíacas, renais, pancreáticas e hepáticas (Olliaro; Bryceson, 1997; Croft; Yardley, 2002).

Pouco tem sido feito desde a introdução dos Sb⁺⁵ na pesquisa de novos quimioterápicos para o tratamento das leishmanioses. Entretanto, as dificuldades em relação à terapêutica atual têm conduzido a estudos com o objetivo de avaliar terapias alternativas, como a fitoterapia (Phillipson; Wright, 1991a,b). As plantas são importantes fontes para a investigação de produtos biologicamente ativos. Cerca de um quarto dos medicamentos do mercado farmacêutico possuem extratos em sua composição, alguns dos quais têm sido, inclusive, utilizados como matéria-prima de drogas semi-sintéticas (Bergmann et al., 1997).

O uso de plantas no tratamento da Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) é uma prática antiga entre as populações das áreas endêmicas (Fournet et al., 1992a; Moreira et al., 1998; 2002). Geralmente, as preparações vegetais são utilizadas por via oral ou tópica sobre as lesões cutâneas (Netto et al., 1985; Iwu et al., 1994; Akendengue et al., 1999). Porém, esses tratamentos são empíricos e pouco se sabe sobre sua real eficácia, uma vez que na LTA pode ocorrer a cura espontânea das lesões (Marsden et al., 1984; Costa et al., 1990; Rossel et al., 1992; Marsden, 1994).

Estudo realizado por nosso grupo no Município de Buriticupu (Amazônia do Maranhão), Brasil, área endêmica para LTA, demonstrou que dentre as preparações vegetais utilizadas pela população no tratamento das úlceras causadas por Leishmania sp, uma das mais citadas foi o extrato de folhas de Stachytarpheta cayennensis (Moreira et al., 2002).

Stachytarpheta cayennensis (Rich.) Vahl, conhecida popularmente como gervão, rinchão e vassourinha-de-botão pertence à família Verbenaceae (Pio Correa, 1984). Esta espécie é encontrada na América tropical e subtropical, do México até o Brasil (Lopes, 1977; Troncoso, 1979) e tem sido utilizada na medicina tradicional como anti-inflamatória, analgésica, antipirética, hepatoprotetora, laxante e no tratamento de distúrbios gástricos (Mathias; Emily, 1993; Mesia-Vela et al., 2004). A aplicação de folhas e raízes trituradas também é usada no tratamento de lesões de pele (Caribe; Campos, 1991) inclusive, em lesões ulceradas causadas por Leishmania sp (Moreira et al, 2002).

Alguns dos efeitos preconizados pela população já foram demonstrados experimentalmente, como a atividade anti-inflamatória, analgésica, gastroprotetora e antimicrobiana (Schapoval et al., 1998; Mesia-Vela et al., 2004; Duarte et al., 2004; Falcão et al., 2005). Em sua composição química apresenta, alcalóides, glicosídios (verbenalina e verbenina), taninos, saponinas, flavonóides, esteróides, quinonas, compostos fenólicos e ácido glicogênico, sendo que alguns destes constituintes químicos também estão contidos em várias espécies vegetais com efeitos leishmanicidas (Mathias; Emily, 1993).

Baseado no uso popular e nos constituintes químicos da S. cayennensis que indicam um potencial efeito anti-Leishmania, este estudo tem por objetivo testar o efeito do extrato hidroalcoólico das folhas de S. cayennensis sobre formas promastigotas de Leishmania braziliensis e L. amazonensis, principais agentes causadores da LTA.

MATERIAL E MÉTODOS

Material vegetal

As folhas de Stachytarpheta cayennensis (gervão) foram coletadas em fevereiro de 2001 no Município de Buriticupu (Amazônia), Maranhão, Brasil. A identificação foi realizada no laboratório de Botânica da Universidade Federal do Maranhão - UFMA. A exsicata encontra-se depositada no Herbário Ático Seabra da UFMA sob o Nº 01081.

Preparação do extrato hidroalcoólico

As folhas secas e trituradas de S. cayennensis (250 g) foram extraídas por maceração com etanol a 70%. A mistura permaneceu sob agitação durante seis dias, sendo em seguida submetida à filtração e concentração em rotoevaporador à pressão reduzida. Os resíduos obtidos foram então diluídos em solução tamponada de fosfato (PBS pH 7,2) a uma concentração de 5 mg/mL e foram estocados a -20 °C até o momento do uso.

Atividade leishmanicida in vitro

A atividade leishmanicida dos extratos foi avaliada pela inibição do crescimento de formas promastigotas de L. amazonensis (MHOM/BR/90/BA 125) e L. braziliensis (MHOM/BR/94/H–3227) gentilmente cedidas por Dra. Aldina Barral do Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz–CPqGM/FIOCRUZ-BA. As formas promastigotas foram cultivadas em meio Schneider (Sigma, Chemical Co, ST Louis, USA) suplementado com soro fetal bovino inativado (Sigma), urina humana estéril, L-glutamina 2 mM (Gibco BRL, Grand Island, NY) e antibióticos [100 U/mL penicilina, 100 µg/mL de streptomicina (Sigma)]. Antes de cada experimento observou-se ao microscópio a motilidade flagelar dos parasitos. As promastigotas foram lavadas em salina estéril, contadas em câmara de Neubauer e ajustadas para a concentração de 5 x 10⁶/mL.

Para os ensaios, o extrato previamente obtido foi diluído cinco vezes em meio Schneider completo, obtendo-se a concentração de 1 mg/mL. Deste, foram retirados 100 µL os quais foram diluídos seriadamente, em placas de 96 poços de fundo chato (Costar), na proporção de 1:2 em meio Schneider completo, resultando nas concentrações finais de 500, 250, 125, 62,5 e 31,25 µg/mL. Em cada poço, foram então adicionados 10µL de uma suspensão de formas promastigotas de L. amazonensis ou L. braziliensis contendo 5 x 10⁶ células/mL. As mesmas concentrações foram utilizadas com o Glucantime^® que foi utilizado como droga de referência. O controle negativo foi obtido a partir de cultura das formas promastigotas, em meio Schneider completo.

A atividade leishmanicida dos extratos foi avaliada pela inibição do crescimento de formas promastigotas após 24h de incubação a 26 ºC, pela contagem do número total de promastigotas vivas, levando-se em consideração a motilidade flagelar, utilizando-se câmara de Neubauer e microscópio ótico de luz comum. A contagem foi comparada com o controle do crescimento das formas promastigotas sem os extratos. Cada concentração dos extratos foi analisada em triplicata. Os resultados foram expressos como concentração inibitória do crescimento parasitário (CI₅₀), baseado em Schmeda-Hirschman et al. (1996) e Camacho et al. (2003).

Atividade citotóxica in vitro

Camundongos da linhagem Balb/c foram injetados com 1 mL de tioglicolato 3% e após 3 dias tiveram suas cavidades peritoneais lavadas com 5 mL de meio RPMI (Sigma) contendo heparina (10 U/mL) para obtenção das células peritoneais. Estas células continham mais que 95% de macrófagos. As células foram centrifugadas (1200 rpm, 4 °C), lavadas com salina a 0,85% e ajustadas para a concentração de 2 x 10⁶ macrófagos/mL de meio RPMI sem fenol vermelho acrescido de 5% soro fetal bovino, L-glutamina e antibióticos.

Para o ensaio de citotoxidade foi utilizado o método de MTT de acordo com o descrito por Mosmann (1983). Brevemente, 2 x 10⁵ macrófagos/100µL foram cultivados em placas de 96 poços, fundo chato, na presença do extrato de S. cayennensis nas concentrações de 500, 250, 125, 62,5 e 31,25 µg/mL. Em alguns poços os macrófagos foram cultivados apenas em meio RPMI completo, sem a presença do extrato, como controle. As culturas foram incubadas por 24 horas a 37 °C em atmosfera úmida contendo 5% de CO₂. Após esse período, o sobrenadante foi colhido e as placas lavadas cuidadosamente com PBS para retirar todo o extrato. Foram adicionados a cada poço 100 µL de meio RPMI completo e ainda 10 µL de MTT (Sigma). Após 3 horas de incubação a 37 °C em estufa úmida e ao abrigo da luz, foram adicionados em cada poço 100 µL de uma solução de SDS (Sigma) 10%/HCL. As placas foram incubadas em temperatura ambiente "overnight" e foram então lidas em leitor de microplacas utilizando filtro de 540 nm. A cictoxicidade foi calculada com base na seguinte fórmula: %c = 100 - (DO Mo + extrato x 100 / DO Mo + meio).

Análise estatística

Todos os ensaios foram realizados em triplicata e repetidos pelo menos uma vez, sendo expressos como concentração inibitória do crescimento parasitário (CI₅₀) calculado por regressão linear. Os dados foram comparados por teste t de Student, sendo o nível de significância de p < 0,05.

RESULTADOS

O efeito anti-Leishmania do extrato hidroalcoólico de Stachytarpheta cayennensis foi mais evidente para a espécie L. braziliensis que para L. amazonensis. A maior concentração testada (500 µg/mL) matou 100% das formas promastigotas de L. braziliensis, porém, apresentou apenas 63% de citotoxicidade contra L. amazonensis (Tabela 1). Esse efeito foi portanto, espécie-dependente e restrito para Leishmania pois houve apenas 23% de morte de macrófagos nessa mesma concentração.

Esta diferença se refletiu também na diferença da CI₅₀, uma vez que foi observado que a concentração do extrato necessária para matar 50% das formas promastigotas de L. braziliensis foi de 73,7 µg/mL, enquanto a requerida para matar L. amazonensis foi de 382,5 µg/mL (Tabela 2).

DISCUSSÃO

Recentes estudos demonstraram o uso de plantas medicinais no tratamento de lesões ulceradas da leishmaniose tegumentar e também em modelos in vitro (França et al., 1993; Fournet et al., 1992b; Akendengue et al., 1999; Moreira et al., 2002; Mesia-Vela et al., 2004; Paula-Junior et al., 2006; Bezerra et al., 2006).

Compostos químicos, isolados de extratos vegetais, demonstraram eficácia comprovada na atividade leishmanicida in vitro sobre formas promastigotas e/ou amastigotas de Leishmania. Dentre eles, podem ser citados os terpenóides (Yang; Liew, 1992; Camacho et al., 2000), aminoglicosteróides e aminosteróides (Kam et al., 1997), naftoquinonas (Fournet et al., 1992a; Kayser et al., 2000), chalconas (Chen et al., 1993), glicosídios iridóides (Mittal et al., 1998); flavonóides (Araújo et al., 1998), neolignanas (Barata et al., 2000) e os alcalóides (Mahiou et al., 1994; Fournet et al., 1994; 1996; Queiroz et al., 1996; Akendengue et al., 1999).

Apesar dos estudos nesta área, ainda existem muitas espécies vegetais com potencial atividade leishmanicida a serem avaliadas. Uma dessas espécies é S. cayennensis cujas folhas têm sido usadas no tratamento da lesão ulcerada da leishmaniose tegumentar (Moreira et al., 2002), possuindo dentre os seus constituintes químicos alcalóides, glicosídios (verbenalina e verbenina) e flavonóides, substâncias com efeito leishmanicida comprovado (Mathias; Emily, 1993).

Neste estudo nós demonstramos que a utilização de extrato hidroalcoólico de folhas secas de S. cayennensis induziu a morte das formas promastigotas in vitro. Este efeito foi espécie-dependente, sendo mais evidente na espécie L. braziliensis do que em L. amazonensis e não foi decorrente de um efeito citotóxico inespecífico, uma vez que o extrato não alterou signficativamente a viabilidade dos macrófagos. Pode-se supor que este efeito diferencial esteja relacionado ao fato de que as formas promastigotas de L. braziliensis sejam mais susceptíveis em cultura que L. amazonensis, isto explicaria inclusive o fato do Glucantime^® também ter tido maior eficácia em L. braziliensis do que em L. amazonensis. Vale ressaltar, que não houve diferenças no suporte nutricional do meio de cultura utilizado nas duas espécies, sendo o efeito diferencial associado com o próprio metabolismo da L. braziliensis.

Em concentrações acima de 1000 µg/mL o extrato inibiu o crescimento das formas promastigotas em menos de 7 horas (dados não mostrados), porém esse efeito foi relacionado provavelmente a uma atividade citotóxica inespecífica, uma vez que nessas mesmas concentrações também houve morte de 100% dos macrófagos.

Estes resultados nos permitem concluir que o extrato hidroalcoólico de folhas de S. cayennensis possui atividade inibitória tanto para L. amazonensis quanto para L. braziliensis e sugere futuros estudos com compostos isolados deste extrato, bem como a avaliação do seu efeito em modelos de infecção in vitro e in vivo.

AGRADECIMENTOS

Ao CNPq pelo auxílio financeiro (Proc. nº 620081/2004-0 ACT), pelas bolsas PIBIC para G.C.Costa, I.C.D.S.Carvalho e pela bolsa de Pós-doc de R.N.M.Guerra. À FAPEMA pela bolsa de mestrado de J.L. Bezerra. À Dra. Aldina Barral do Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz- CPqGM-FIOCRUZ/BA, por fornecer as formas promastigotas de L. amazonensis e L. braziliensis utilizadas neste estudo. A Dra. Maria Jânia Teixeira do CPqGM-FIOCRUZ/BA, por colaborar na execução dos testes laboratoriais.

Recebido em 16/01/06. Aceito em 18/10/06

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  22 Maio 2007
• Data do Fascículo
  Mar 2007

Histórico

• Aceito
  18 Out 2006
• Recebido
  16 Jan 2006