Biciclogermacreno, resveratrol e atividade antifúngica em extratos de folhas de Cissus verticillata (L.) Nicolson & Jarvis (Vitaceae)

Bicyclogermacrene, resveratrol and fungitoxic activity on leaves extracts of Cissus verticillata L. Nicolson & Jarvis (Vitaceae)

ARTIGO

Biciclogermacreno, resveratrol e atividade antifúngica em extratos de folhas de Cissus verticillata (L.) Nicolson & Jarvis (Vitaceae)

Bicyclogermacrene, resveratrol and fungitoxic activity on leaves extracts of Cissus verticillata L. Nicolson & Jarvis (Vitaceae)

Luciana da Silva^I; Glaucia H. Oniki^I; Débora G. Agripino^I; Paulo R. H. Moreno^III; Maria Claudia M. Young^I; Marco Aurélio S. Mayworm^II; Angela M. LadeiraI, ^*

^ISeção de Fisiologia e Bioquímica, Instituto de Botânica, Av. Miguel Stefano 3687, Água funda, Caixa Postal 3005, 01061-970, São Paulo, SP, Brasil

^IILaboratório de Fitoquímica, Faculdade de Biologia, UNISA, Rua Prof. Eneas de Siqueira Neto 340, Jardim das Embuias, 04829-300, São Paulo, SP, Brasil

^IIIInstituto de Química, Universidade de São Paulo, Av. Prof. Lineu Prestes, 748, Bl 11T, sala 1112, Cidade Universitária, 05508-000, São Paulo, SP, Brasil

RESUMO

Cissus verticillata L. (Vitaceae) tem sido empregada popularmente como anti-diabética. Nessa espécie foi também detectada atividade fungitóxica. O objetivo do presente trabalho foi realizar a identificação dos compostos fungitóxicos em extratos de folhas. O extrato etanólico foi submetido a fracionamento com solventes de diferentes polaridades (hexano, clorofórmio, acetato de etila e butanol) e seu efeito antifúngico foi analisado frente a Cladosporium sphaerospermum. Os extratos em clorofórmio e acetato de etila mostraram atividade, e foram fracionados por cromatografia em coluna e cromatografia preparativa em placas de sílica, respectivamente. Três terpenóides foram isolados do extrato em clorofórmio; um deles foi identificado, por análise em CG-EM, como um sesquiterpeno, o biciclogermacreno. O composto ativo do extrato em acetato de etila foi identificado, por análises em CLAE, como o estilbeno resveratrol.

Unitermos:Cissus verticillata, Vitaceae, atividade fungitóxica, sesquiterpeno, estilbeno.

ABSTRACT

Cissus verticillata L. (Vitaceae) is popularly employed as hypoglicemic and it shows fungitoxic activity. This work aims at identification of fungitoxic compounds on extracts of leaves. The ethanol extract was partitioned using solvents of different polarities (hexane, chloroform, ethyl acetate and butanol) and its fungitoxic activity was analysed upon Cladosporium sphaerospermum. The chloroform and ethyl acetate extracts showed activity and they were fractionated by column chromatography and preparative TLC, respectively. Three terpenoids were isolated from the chloroform extract, one of them identified by GLC-MS analysis as sesquiterpene bicyclogermacrene. The active compound of the ethyl acetate extract was identified by HPLC analyses as stilbene resveratrol.

Keywords:Cissus verticillata, Vitaceae, fungitoxic activity, sesquiterpene, stilbene.

INTRODUÇÃO

Nos últimos anos, a busca de compostos com atividades antifúngicas, antitumorais e antioxidantes tem sido intensificada por levar à identificação de novos fármacos que possam ser empregados no tratamento da AIDS e do câncer, e suas complicações (Grayer; Harborne, 1994; Gordon, 1996).

Cissus verticillata, pertencente à família Vitaceae, é nativa da região norte do Brasil, tem hábito herbáceo, escandente ou trepador, perene, com gavinhas opostas às folhas (Van den Berg, 1993). Popularmente é empregada no tratamento de diabetes, sendo conhecida como "insulina vegetal" e "parreira brava" (Agra et al., 2007), porém estudos farmacológicos ainda são contraditórios (Beltrame et al., 2002). Outros trabalhos têm comprovado atividades anti-convulsivantes (Elizabetsky, 1988) e antimicrobianas (Beltrame et al., 2002).

Estudos químicos realizados com Cissus verticillata mostraram a presença de alcalóides, flavonóides, saponinas, taninos e sais de magnésio, manganês, silício, cálcio, fósforo e potássio (Silva, 1996).

O presente trabalho teve como objetivos avaliar o potencial antifúngico, e isolar e identificar compostos fungitóxicos de folhas de Cissus verticillata.

MATERIAL E MÉTODOS

Cissus verticillata (L.) Nicolson & Jarvis J.S.Silva 273 (SP). O material foi identificado pela Dra. Lúcia Rossi, da Seção de Herbário do Instituto de Botânica. Local de coleta: Viveiro Manequinho Lopes, no Parque Ibirapuera, São Paulo.

Preparo do material

Folhas (115,9 g) foram lavadas e secas à 60 ºC por dez dias, em seguida pulverizadas, e submetidas à extração com etanol (93%) à temperatura ambiente, por três dias, trocando-se o solvente a cada 24 horas. O extrato etanólico obtido foi concentrado a 40 ºC, sob pressão reduzida, em rotaevaporador.

O extrato etanólico obtido (2,25 g) foi suspenso em etanol 50% e submetido à partição líquido-líquido, com solventes de diferentes polaridades (n-hexano, clorofórmio, acetato de etila e butanol), produzindo novos extratos, os quais foram submetidos aos bioensaios de atividade antifúngica, conforme descrito no esquema.

O extrato clorofórmico (454 mg), que apresentou atividade antifúngica, foi submetido à cromatografia em coluna de Sephadex LH-20, usando como eluentes clorofórmio : metanol (1:1) V/V. Cinco frações foram coletadas. Bioensaios de atividade antifúngica revelaram compostos inibidores nas frações 2 (198 mg) e 3 (40 mg). Essas duas frações foram submetidas novamente à cromatografia em coluna de Sephadex LH-20 usando na eluição um gradiente de clorofórmio : metanol (1:1; 4:6; 1:9 e 0:1)V/V.

Novas frações contendo compostos ativos obtidos da fração 2 (198 mg), do extrato clorofórmico, foram submetidas a cromatografia preparativa em camada delgada empregando como solventes clorofórmio e clorofórmio : metanol (3:7) V/V. As cromatoplacas foram observadas sob luz UV e submetidas ao bioensaio de atividade antifúngica. Os compostos ativos eluídos foram submetidos à análises em CLAE e aplicados em placas de sílica para caracterização de sua natureza química. Para isto as placas foram reveladas com reagentes para detecção de alcalóides (Draggendorf), compostos fenólicos (reagente de Godin), compostos terpênicos (solução de vanilina sulfúrica) e flavonóides (solução etanólica de cloreto de alumínio) (Harborne, 1988).As análises em CLAE foram realizadas em aparelho Varian ProStar com coluna C 18, Reselut de 5 C, 1890 A, (150 x 4,6 mm), e detector de luz UV em 254 nm. Foram injetados 20 µL das soluções metanólicas das amostras. O fluxo foi de 1 mL/min. A Tabela 1 apresenta o gradiente de solventes utilizado.

Os compostos da fração 3 (40 mg), do extrato clorofórmico, semi-purificados por cromatografia em camada delgada preparativa, foram analisados por cromatografia a gás, acoplada a espectrometria de massa, usando aparelho Agilent 6890, modelo CP 3800 com coluna HP-5 MS Agilent , diâmetro de 0,25 mm e filme de 0,25 µM, hélio como gás de arraste e fluxo de 1 mL/min. A temperatura foi programada mantendo 80 ºC por um minuto, seguida de aumento de 10 ºC por minuto até 290 ºC, temperatura mantida por mais um minuto. Foi injetado um volume de 1 µL de uma solução do composto (1 mg.mL^-1), que foi identificado através da comparação de seu espectro de massa com espectros existentes no banco de dados (Wiley 275) do equipamento.

O extrato acetato de etila (5 mg) foi submetido a cromatografia preparativa em camada delgada em sílica gel G com clorofórmio:metanol(1:1) V/V como eluente, e as cromatoplacas foram submetidas ao bioensaio de atividade antifúngica. O composto ativo eluído foi analisado em CLAE. Utilizou-se aparelho da Varian e coluna descritas acima, detector a 320 nm, fluxo 1 mL/min. e o eluente descrito na Tabela 2.

A amostra (1 mg/mL) do composto eluído foi diluída em metanol, e 20 µL dessa solução foram injetados, utilizando-se Resveratrol (1 mg/mL) como padrão.

Bioensaio de atividade antifúngica

A atividade antifúngica foi analisada através do método de bioautografia direta (Homans; Fuchs, 1970). O fungo filamentoso Cladosporium sphaerospermum foi empregado como detector dos compostos tóxicos. Extratos brutos (400 µg) e frações (100 µg) obtidas após cromatografia em coluna, ou cromatografias preparativas em camadas delgadas, foram analisadas em placas de sílica gel desenvolvidas em solventes adequados. Após completa evaporação dos solventes todas as placas foram borrifadas com uma suspensão de esporos (> 2 x 10⁶ esporos/mL) de C. sphaerospermum em solução de glucose e sal, e incubadas por 72 horas, no escuro, em câmara úmida a 25 ºC. Zonas de inibição claras são formadas contra um fundo escuro quando os compostos inibidores estão presentes. Define-se por atividade forte a inibição total do crescimento do fungo, moderada a inibição parcial do desenvolvimento deste, e fraca quando há pouca alteração no desenvolvimento. A quantificação da atividade fungitóxica foi feita a partir de comparação com padrão de Nistatina, cujo limite de detecção é de 1 µg.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os extratos em clorofórmio e acetato de etila mostraram atividade antifúngica moderada, enquanto os demais extratos não foram efetivos (Figuras 1 e 2).

O fracionamento por cromatografia em coluna da fração 2 do extrato clorofórmico produziu duas sub-frações ativas (7,3 mg e 6,1 mg), que após purificação por cromatografia preparativa em placa de sílica mostraram natureza terpenoídica, de acordo com a revelação com o reagente de vanilina. O perfil cromatográfico das análises dessas sub-frações mostrou compostos com tempos de retenção 32,821 e 36,946, porém não foi possível identificá-las devido a falta de padrões.

A partir da fração 3 do extrato clorofórmico obteve-se uma sub-fração (1,6 mg) identificada como biciclogermacreno (Figura 3), dado obtido por comparação dos espectros de massa do composto com o do padrão na análise em CG-EM.

O composto biciclogermacreno, um sesquiterpenóide, e outros terpenóides com atividade antifúngica têm sido identificados em extratos de outras espécies. O óleo essencial de Piper cernuum e P. regnellii cuja composição contém entre outros compostos, biciclogermacreno, mostrou atividade antimicrobiana (Constantin et al., 2001; Cysne et al., 2005). O óleo essencial de Calea clematidea, contendo o composto germacreno B também mostrou atividade fungitóxica (Fach et al., 2002).

O composto ativo (1 mg) do extrato em acetato de etila mostrou tempo de retenção 20,242 e foi identificado como resveratrol nas análises realizadas em cromatografia em CLAE (Figuras 4 e 5).

O resveratrol é um composto pertencente à classe dos estilbenos, isolado em 1974 pela primeira vez de uma leguminosa Peruviana, a Cassia quinquagulata. Os estilbenos são comuns em Gnetaceae, Dipterocarpaceae e Vitaceae (Khan et al., 1986). O resveratrol é encontrado em várias plantas (Hart, 1981), mas uvas e produtos relacionados são consideradas as fontes mais importantes, e nelas o teor desse composto depende da variedade e das condições ecológicas do cultivo (Kallithraka et al., 2001; Sun et al., 2006). São precursores das viniferinas, fitoalexinas produzidas em folhas de Vitis vinifera L.(Stecher et al., 2001).

Adrian et al. (2000) observaram que o resveratrol é um componente com atividade antifúngica em Vitis vinifera (Vitaceae), e segundo Langcake e Pryce (1976) e Domingo e Lopes-Brea (2003) funciona como fitoalexina, após uma infecção por patógenos como Botrytis cinerea e Plasmopara viticola. Chan, (2002) observou que o resveratrol tem atividade contra dermatófitos e bactérias da pele em humanos. Jung et al. (2005) sugeriram que o resveratrol poderia ser utilizado como agente terapêutico no combate a algumas infecções fúngicas.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem à FAPESP pelo auxílio concedido ao Biota Proc. Nº 05074/98, e ao MS Rodrigo S. Dourado pela edição das figuras.

Recebido em 13/08/06. Aceito em 27/04/07

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  11 Out 2007
• Data do Fascículo
  Set 2007

Histórico

• Recebido
  13 Ago 2006
• Aceito
  27 Abr 2007