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Contribuição ao estudo fitoquímico de Dorstenia multiformis Miquel (Moraceae) com abordagem em atividade antioxidante

Contribution to the phytochemical study of Dorstenia multiformis Miquel (Moraceae) with approach in antioxidant activity

Resumos

Conhecida como carapiá, a espécie Dorstenia multiformis Miquel, Moraceae, é largamente empregada na medicina popular contra doenças de pele. Neste trabalho determinou-se a atividade antioxidante de substâncias isoladas, do extrato etanólico, e frações hexano, clorofórmio e acetato de etila. Todas as amostras testadas apresentaram atividade antioxidante, sendo que a fração clorofórmio foi a que apresentou maior atividade antioxidante.

Dorstenia multiformis; fitoquímica; atividade antioxidante; carapiá


The species Dorstenia multiformis Miquel, Moraceae, known as "carapiá", is largely employed in folk medicine against skin diseases. In this paper the antioxidant activity of isolated substances, from the ethanol extract, and hexane, chloroform and ethyl acetate fractions has been determined. All of the tested samples showed antioxidant activity, and the chloroform fraction was the one that presented the largest antioxidant activity.

Dorstenia multiformis; phytochemistry; antioxidant activity; carapiá


ARTIGO

Contribuição ao estudo fitoquímico de Dorstenia multiformis Miquel (Moraceae) com abordagem em atividade antioxidante

Contribution to the phytochemical study of Dorstenia multiformis Miquel (Moraceae) with approach in antioxidant activity

Luciana BalestrinI; Josiane F. Gaspari DiasII; Obdúlio Gomes Miguel* * E-mail: obdulio@ufpr.br, Tel +55-41-33604066 , II; Daniela S. G. Dall'StellaI; Marilis Dallarmi MiguelI

IDepartamento de Farmácia, Laboratório de Farmacotécnica, Universidade Federal do Paraná, Av. Prefeito Lothário Meissner 3400, 80210-170 Curitiba-PR, Brasil

IIDepartamento de Farmácia, Laboratório de Fitoquímica, Universidade Federal do Paraná, Av. Prefeito Lothário Meissner 3400, 80210-170 Curitiba-PR, Brasil

RESUMO

Conhecida como carapiá, a espécie Dorstenia multiformis Miquel, Moraceae, é largamente empregada na medicina popular contra doenças de pele. Neste trabalho determinou-se a atividade antioxidante de substâncias isoladas, do extrato etanólico, e frações hexano, clorofórmio e acetato de etila. Todas as amostras testadas apresentaram atividade antioxidante, sendo que a fração clorofórmio foi a que apresentou maior atividade antioxidante.

Unitermos:Dorstenia multiformis, fitoquímica, atividade antioxidante, carapiá.

ABSTRACT

The species Dorstenia multiformis Miquel, Moraceae, known as "carapiá", is largely employed in folk medicine against skin diseases. In this paper the antioxidant activity of isolated substances, from the ethanol extract, and hexane, chloroform and ethyl acetate fractions has been determined. All of the tested samples showed antioxidant activity, and the chloroform fraction was the one that presented the largest antioxidant activity.

Keywords:Dorstenia multiformis, phytochemistry, antioxidant activity, "carapiá".

INTRODUÇÃO

A família Moraceae apresenta aproximadamente 61 gêneros, com mais de 1000 espécies, e se encontra bem representada no Brasil, tanto por espécies indígenas, como por cultivadas. É freqüente, de um modo geral, nas regiões tropicais e subtropicais de todo o mundo, sendo menos comum em climas temperados (Joly, 1975; Cronquist, 1981).

Segundo Abegaz et al. (2002), o gênero Dorstenia possui muitas plantas que são utilizadas como antiofídicas, antiinfecciosas e anti-reumáticas.

Algumas espécies deste gênero são utilizadas na medicina humana, principalmente contra tosse e bronquite (Agra et al., 2007) e doenças de pele, pela presença de furanocumarinas (Cardoso et al., 2002) e compostos do tipo terpenóides têm sido relatados como os responsáveis pelo uso popular destas plantas como antiofídicos (Vilegas et al., 1997).

Diversas substâncias foram isoladas do gênero Dorstenia, incluindo: psoraleno e bergapteno (Bauer & Noll, 1986); ácidos graxos, triterpenos pentacíclicos, esteróides e furanocumarinas (Vilegas et al., 1992); butirospermol (Tsopmo et al., 1998); furanocumarinas (psoraleno, bergapteno, pimpinelina e isopimpinelina) (Cardoso et al., 2002); catequina e epicatequina (Caceres et al., 2001); um análogo do psoraleno, denominado dorstenina (Lopes et al., 2001); psoraleno, bergapteno, beta-sitosterol e seus derivados D-glucopiranosídicos (Abegaz et al., 2002); dorstenona (Tsopmo et al., 1998); flavonóides prenilados (Abegaz et al., 2002 e Ngadjui et al., 2002) e siriogenina (Casagrande et al., 1974), entre outros.

Os dados farmacológicos sobre o gênero Dorstenia são escassos, mas sabe-se que todas as espécies do gênero conhecidas como carapiá são dotadas de qualidades medicinais, entre elas podem-se citar: atividade analgésica e/ou antiinflamatória (Ruppelt et al.,1991; Abegaz et al., 2002; Falcão et al., 2005), atividade antileishmania (Iwu et al., 1992; Abegaz et al., 2002), atividade antioxidante (Abegaz et al., 2002), atividade citotóxica (Abegaz et al., 2002), atividade giardicida (Amaral et al., 2006), efeitos antihipertensivos e diminuição nos níveis de colesterol e insulina (Dimo et al., 2001).

MATERIAL E MÉTODOS

Obtenção do material vegetal

A espécie Dorstenia multiformis foi fornecida pela indústria farmacêutica "As Ervas Curam", em março de 2004. A coleta foi efetuada na Fazenda Capão Grande, situada no município de Jataí, estado de Goiás, em janeiro de 2004. Amostras da planta inteira foram enviadas ao Museu Botânico Municipal de Curitiba, para identificação botânica pelo botânico Dr. Gerdt Hatchbach do Museu Botânico Municipal (MBM) de Curitiba/PR, e encontra-se registrada neste museu sob o número 37440.

Análise fitoquímica

Foram submetidos 5000 g do material vegetal à extração com etanol absoluto, em aparelho de Soxhlet. O extrato obtido foi filtrado e concentrado em evaporador rotatório sob pressão reduzida, a temperatura de aproximadamente 40 °C e encaminhado ao freezer. Após 24 horas, o extrato concentrado foi filtrado a vácuo, obtendo-se o extrato etanólico bruto e o resíduo correspondente, os quais foram armazenados separadamente.

O resíduo resultante da filtração do extrato concentrado foi lavado com acetona, obtendo-se duas porções, uma solúvel em acetona e outra não solúvel em acetona. Da porção solúvel em acetona fez-se cromatografia em coluna utilizando-se como eluentes hexano e acetato de etila com variação de 10% no gradiente. Desta coluna isolaram-se dois compostos denominados CRS1 (753 mg) e CRS2 (52,6 mg). Estes compostos foram analisados por CG-EM, RMN 13C e RMN 1H, os quais revelaram a presença de psoraleno e bergapteno no composto CRS1 e β-amirina e α-amirina no composto CRS2.

O extrato bruto etanólico foi fracionado em aparelho de Soxhlet modificado (Carvalho, 2001), por meio de partição líquido-líquido utilizando-se solventes de polaridade crescente (hexano, clorofórmio e acetato de etila). Esse procedimento resultou nas frações hexano, clorofórmio e acetato de etila. Os valores do teor de sólidos do extrato bruto etanólico e das frações obtidas de D. multiformis encontram-se na Tabela 1.

Para RMN 13C e 1H utilizou-se espectrofotômetro Brucker® modelo AC 200 em 50 MHZ. O solvente utilizado na espectroscopia de RMN foi clorofórmio deuterado (CDCl3) e como padrão de referência interna utilizou-se tetrametilsilano. Para Cromatografia Gasosa acoplada em massa utilizou-se cromatográfo gasoso 6890 da Agilent® equipado com coluna HP5 (5% fenil e 95% dimetilpolisiloxano) de 0,25 mm de diâmetro interno por 15 cm de comprimento, e espectrômetro de massa 5973 da Agilent®. A identificação dos constituintes foi feita por comparação do espectro de massa do referido constituinte, com os espectros de massa existentes no banco de dados do equipamento (DATABASE/ NIST98).

Avaliação da atividade antioxidante pelo método de complexação do fosfomolibdênio

Este método, descrito por Prieto (1999), fundamenta-se na redução do molibdênio (VI) a molibdênio (V) ocorrida em presença de determinadas substâncias com capacidade antioxidante, com formação de um complexo verde entre fosfato/molibdênio (V), em pH ácido, o qual é determinado espectrofotometricamente a 695 nm.

O complexo fosfomolibdênico, formado pela reação da solução de Na3PO4 (28 mL, 0,1 mol/L) com solução de (NH4)6Mo7O24 .4H2O (12 mL, 0,03mol/L) e solução de H2SO4 (20 mL, 3 mol/L), em meio aquoso. O volume final é ajustado com água destilada para 100 mL, e a coloração amarela, torna-se verde à medida que se reduz.

Para o preparo do complexo fosfomolibdênico, todos os reativos foram transferidos para um balão volumétrico e o volume foi completado para 100 mL com água destilada.

O extrato e respectivas frações foram levados à secura em banho-maria (40 ºC), e a partir do material seco, bem como das substâncias isoladas, prepararam-se soluções aquosas com concentração final de 200 µg/mL, utilizando-se uma quantidade mínima de metanol para dissolver as amostras, quando necessário. Destas, foram tomados 0,3ml e adicionado 1 mL de solução reagente do complexo fosfomolibdênio. Os tubos foram fechados e mantidos em banho-maria a 95 ºC por 90 min. Após resfriamento, procedeu-se a leitura a 695 nm, em um espectrofotômetro UV-1601 Shimadzu®, para obtenção das absorvâncias, usando-se água destilada como branco. A capacidade antioxidante das amostras foi expressa em relação à vitamina C (200 µg/mL) usada como padrão, e rutina (200 µg/mL) cuja atividade antioxidante de referência foi considerada 1,00. A vitamina C é um dos antioxidantes biológicos mais eficazes e mais conhecidos (Youngson, 1996).

Para este ensaio utilizaram-se as seguintes amostras em duplicata: extrato etanólico bruto, frações hexano, clorofórmio e acetato de etila, e os compostos isolados CRS1 e CRS2.

Os resultados da avaliação da atividade antioxidante foram expressos na forma de atividade antioxidante relativa AAR% (ác. ascórbico) e AAR%(rutina). Os cálculos foram estabelecidos por meio das equações:

Avaliação da atividade antioxidante por cromatografia de camada delgada

De acordo com o método descrito por Conforti et al. (2002), as amostras (10 mg/mL) foram submetidas à cromatografia em camada delgada (CCD), usando-se como fase móvel hexano: 20, acetato de etila: 30 e ácido fórmico: 2. Em seguida, as placas foram reveladas com solução a 0,2% (p/v) de DPPH (difenil-picril-hidrazil) em etanol e fotografadas com auxílio de câmera digital.

O DPPH é um radical cromóforo que simula as espécies reativas de oxigênio (EROs); dessa forma, ele pode aceitar um elétron ou radical hidrogênio para se tornar uma molécula estável, que apenas raramente pode ser oxidada irreversivelmente. Possui coloração violeta intenso e quando aplicado em placa cromatográfica na forma de solução alcoólica, adquire coloração amarelo ouro característica em presença de substâncias com atividade antioxidante, não apresentando alteração de cor na ausência destas (Conforti et al., 2002).

RESULTADOS

Identificação dos compostos CRS1 e CRS2

A partir da análise cromatográfica em cromatografia gasosa acoplada a massa, da amostra CRS1 pode-se observar absorção em 11,19 min, indicando estrutura química do psoraleno e outro pico em 13,49 min, indicativo da estrutura do bergapteno. Estes foram confirmados pelo espectro de RMN 13C e 1H.

Os espectros de RMN 13C e 1H revelaram absorções que estão demonstradas nas Tabelas 2 e 3.

Comparando-se os dados do espectro aos valores relatados pela literatura (Masuda et al., 1998) para psoraleno e bergapteno (Figura 1) na Tabela 2 sugere-se que a estrutura majoritária seja o psoraleno, sendo que os sinais excedentes no espectro são coincidentes para a estrutura química do bergapteno.


No espectro de RMN 1H para o composto CRS2 observa-se o perfil característico de triterpenos, conforme Tabela 3. A presença de 10 metilas singleto e seis metilas duplete no espectro de próton é confirmada no carbono-13, sugerindo um esqueleto pentacíclo derivado do ursano e lanostano contendo uma ligação dupla trisubstituída definida pelos sinais de próton em 5,12 ppm H, e carbono em 124,1 e 121,7 ppm CH e 139,4 e 145,1 ppm para C. O duplo duplete centrado em 4,49 ppm para um próton carbinólico correlacionado ao CH em 80,61 indicam a presença de 3β-acetato. A comparação dos deslocamentos químicos de carbono-13 com dados da literatura (Barreto et al., 1998; Gallegos & Roque, 1990; Bandeira et al., 2007) permitiu identificar os triterpenos 3β-O-acetato de β-amirina e 3α-O-acetato de α-amirina (Figura 2).


Avaliação da atividade antioxidante

Os resultados da avaliação da atividade antioxidante pelo método de complexação do fosfomolibdênio estão apresentados na Tabela 4 e os resultados da avaliação da atividade antioxidante por cromatografia de camada delgada na Figura 3.


DISCUSSÃO

De acordo com os resultados apresentados, todas as amostras testadas (extrato etanólico bruto, fração hexano, fração clorofórmio, fração acetato de etila e amostras CRS1 e CRS2) demonstraram atividade antioxidante por redução do complexo fosfomolibdênio, ao adquirir a coloração verde característica. Sugere-se que a atividade antioxidante observada para o extrato bruto e as frações não seja devida aos compostos psoraleno e bergapteno (presentes na amostra CRS1), uma vez que os valores de atividade antioxidante total, obtidos para CRS1 encontram-se significativamente abaixo daqueles obtidos para as demais amostras testadas, atribuindo-se uma baixa atividade antioxidante para esses compostos cumarínicos, por comparação com os padrões utilizados (vitamina C e rutina).

Dessa forma, considerando-se que o extrato etanólico bruto e as frações obtidas do extrato tratam-se de misturas complexas de componentes químicos, pode-se supor que a atividade antioxidante mais pronunciada, observada para essas amostras, em relação à amostra CRS1, possa ser devida a um sinergismo dos componentes presentes nas referidas amostras com as cumarinas psoraleno e bergapteno. Ainda, pode-se sugerir a presença dos compostos terpenóides no extrato bruto etanólico e frações, os quais estão presentes na amostra CRS2, uma vez que tais compostos apresentaram uma atividade antioxidante relativa significativa, quando comparado aos padrões: vitamina C e rutina.

Na avaliação da atividade antioxidante considere-se que a fração clorofórmio apresentou atividade antioxidante relativa superior, quando comparada ao padrão de atividade antioxidante rutina no método de complexação do fosfomolibdênio.

Avaliando-se a atividade antioxidante por cromatografia de camada delgada, observa-se na figura 3 presença de um grande número de substâncias com atividade antioxidante nas amostras testadas, especialmente na fração clorofórmio, confirmando o resultado obtido de atividade antioxidante significativa para essa amostra com o reativo fosfomolibdênio.

Dessa forma, a fração clorofórmio pode ser considerada um antioxidante em potencial, com possibilidade de aplicação na terapêutica, e inclusive com possibilidade de separação de princípios ativos.

AGRADECIMENTOS

A Indústria "As Ervas Curam" pelo fornecimento do material vegetal.

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  • *
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  • Datas de Publicação

    • Publicação nesta coleção
      01 Ago 2008
    • Data do Fascículo
      Jun 2008
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