Estudo espectrométrico de diferentes estágios fenológicos da Brassica oleracea var. capitata

Spectrometric study at different phenologic stages of the cabbage (Brassica oleraceae var. capitata)

ARTIGO

Estudo espectrométrico de diferentes estágios fenológicos da Brassica oleracea var. capitata

Spectrometric study at different phenologic stages of the cabbage (Brassica oleraceae var. capitata)

Camilo Amaro de Carvalho^I; Marcelo Barreto da Silva^{*, II}; Tancredo Gonçalves de Oliveira^II; Jadson de Matos Lima^II; Marcelo Barcellos da Rosa^II

^IDepartamento de Biologia Celular, Universidade Federal de Viçosa, 36570-000 Viçosa-MG, Brasil

^IIFaculdade de Ciências Agrárias, Universidade Vale do Rio Doce, Rua Israel Pinheiro, 2000, Bairro Universitário, 35020-220 Governador Valadares-MG, Brasil

RESUMO

O repolho (Brassica oleracea var. capitata), planta do gênero Brassica, vem sendo utilizado na medicina popular brasileira principalmente no tratamento da cicatrização. Neste trabalho, foi desenvolvido um estudo espectrométrico na região do ultravioleta-visível aliado a uma prospecção fitoquímica para diferentes estágios fenológicos da Brassica sp. O perfil espectrométrico das concentrações globais relativas dos constituintes da planta, com relação ao seu crescimento vegetativo, foi traçado para extratos em água, etanol e diclorometano. A hidrólise dos extratos aquosos foi também avaliada. Os resultados da prospecção fitoquímica mostraram a presença positiva de compostos fenólicos, flavonóides, triterpenos e esteróides para os extratos etanólicos e aquosos nos estágios vegetativos IV e V. Analisando o perfil espectral e a redução da concentração global relativa para cada solvente e estágio fenológico, foram obtidas reduções (estágio IV até o VII) na ordem de 87%, 73% e 55%, respectivamente para estratos obtidos com água, etanol e diclorometano em relação ao estágio IV. As concentrações dos constituintes ativos são inversamente proporcionais ao estágio de crescimento vegetativo do repolho, servindo como uma ferramenta útil no controle de qualidade de fitoterápicos.

Unitermos: Brassicaceae, repolho, espectrometria UV-VIS, fitoquímica.

ABSTRACT

The cabbage (Brassica oleraceae var. capitata), plant of the genus Brassica, has been used by the Brazilian folk medicine mainly in the treatment of healing. In this work, a spectrometric study at ultraviolet-visible range allied to a phytochemical screening on different phenologic stages of Brassica sp. was developed. Aiming at obtaining a spectrometric profile of the global concentrations of the constituents in relation to the vegetative growth, ethanol, aqueous and dichloromethane extracts were studied. Hydrolysis of aqueous extracts was also performed. The results of the phytochemical prospection show a positive presence of phenolic compounds, flavonoids, triterpenes, steroids for the ethanol and aqueous extracts at stages IV and V. Analyzing the spectral profile and the reduction of the relative global concentration for each solvent and phenologic stage, reductions were obtained (stage IV until stage VII) in the order of 87%, 73% and 55% for aqueous, ethanol and dichloromethane extracts, respectively and in relation to stage IV. Therefore, the constituents concentrations were inversely proportional to the vegetative growth and can be used as useful tool to determinate the quality control of the herbal medicines.

Keywords: Brassicaceae, cabbage, UV-VIS spectrometry, phytochemistry.

INTRODUÇÃO

O repolho (Brassica oleracea var. capitata) é uma planta da família das Brassicaceae (crucíferae), herbácea, folhosa, com grande aplicabilidade, não somente por apresentar um alto valor nutritivo, alta concentração de cálcio, proteínas e ácido ascórbico (Filgueira, 2000; Lédo et al., 2000), mas também pelo seu caráter social, pois se trata de uma planta cultivada essencialmente por pequenos agricultores (Silva Júnior, 1987; Silva Júnior et al., 1988; Filgueira, 2000).

Segundo Balbach e Boarim (1993), os romanos já empregavam a Brassica sp., tanto interna, como externamente como abstergente (produto utilizado para limpar ferimentos) e na forma de cataplasmas no tratamento das feridas. Relatos informam ainda o uso da Brassica sp. a mais de um milênio em processos de cicatrização de abscessos, cefalalgias idiopáticas (dores de cabeça de causas desconhecidas), independentes de febre ou distúrbios intestinais, dores reumáticas e reumatóides, tumores, prevenção de tuberculose, auxílio em casos de afonia, desnutrição, anemia, enfermidades do estômago, úlceras internas, hemorróidas, alcoolismo, gota e reumatismo.

A busca e intensificação do uso de plantas in natura pela população para fins medicinais ocorre até mesmo em países industrializados (Miguel & Miguel, 2000). No Brasil, a Brassica sp. vem sendo utilizada como produto cicatrizante (Ferradeira et al., 2003), no combate a osteoporose (Agra et al., 2007), no tratamento de dependência ao álcool (Carlini et al., 2006) ressaltando o seu uso em casos de diabetes (Barbosa-Filho et al., 2005), visto que o quadro clínico de dificuldade de cicatrização decorrente da doença é comprovado. Vários estudos têm sido realizados, como de toxicidade e análise histológica (Antunes et al., 2003); microbiológicos (Sarandy et al., 2003); na estabilização da massa óssea após a menopausa (Pereira et al., 2006); bioensaios comparativos com outros produtos cicatrizantes (Freire et al., 2003), com a finalidade de comprovação científica dos efeitos fitoterápicos da Brassica sp.

Um ponto importante no estudo de princípios ativos de uma planta são os estágios fenológicos da cultura (Andaloro et al., 1983), o que facilita a transposição de informação sobre a cultura, tendo em vista que a duração do ciclo reprodutivo de cada vegetal é função também da interação com os componentes do ambiente como temperatura, água, luz, etc. O ciclo vegetativo da cultura do repolho pode ser dividido em fases fenológicas, assumindo valores distintos, como pode ser visto na Figura 1. Essas fases compreendem um período de crescimento ou período vegetativo da cultura, formação da colheita (aumento do tamanho) e maturação.

A busca da qualidade é um movimento que adquiriu dimensão mundial. Cada vez mais os produtores de bens e serviços percebem que a qualidade é o componente mais importante para oferecer produtos capazes de satisfazer as necessidades dos usuários. Da mesma forma, os usuários desses bens e serviços requerem cada vez mais o melhor desempenho dos produtos que adquirem.

O controle de qualidade de fitoterápicos é imprescindível no meio comercial, pois muitas espécies vegetais são vendidas sem quaisquer garantia de qualidade, favorecendo, desde a venda de espécies falsificadas, até o armazenamento inadequado durante a sua comercialização, como destaca a Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - controle de qualidade de ervas medicinais, edição nº 31, Julho/Dezembro de 2003.

Diante desta realidade, se torna fundamental a sistematização de técnicas para uma melhor comprovação científica da real utilização dos fitoterápicos e validação dos processos tecnológicos de cultivo e produção.

Dentre os inúmeros solventes utilizados na farmacotécnica de fitoterápicos envolvendo a Brassica sp., o que possui um maior apelo popular é a água, pois proporciona a extração de moléculas polares como glucosinolatos, encontrados também no brócolis e nabo (Simões et al., 1999). Estes constituintes possuem a propriedade de promover a agregação plaquetária, que é fundamental num processo de cicatrização (Simões et al., 1999). Quando coágulos de sangue se formam, em uma ferida, por exemplo, as plaquetas do sangue são incorporadas ao coágulo e acionadas para liberar o fator de crescimento derivado das plaquetas. Este então se liga ao receptor da enzima tirosinoquinase das células sobreviventes no local da ferida, estimulando-as a proliferação e conseqüentemente cicatrização da mesma (Alberts et al., 2006). Outras moléculas que podem estar correlacionadas à ação cicatrizante da Brassica sp. são os taninos (ácidos fenólicos) e flavonóides. Os ácidos fenólicos e flavonóides pertencem a uma classe de metabólitos secundários, largamente distribuídos em plantas. Estes possuem pelo menos um anel aromático com um ou mais grupamentos hidroxila, juntamente com outros substituintes (Havsteen, 2002). Os polifenóis de leguminosas e cereais são predominantemente taninos de origem flavonóide (Deshpande & Cheryan, 1985). Os flavonóides conferem uma ação anti-oxidante com potencial terapêutico (Jang et al., 1995; Barreiros et al., 2003; Carbonezi et al., 2007; Andrade et al., 2007). Estudos in vitro têm mostrado que a quercetina e outros flavonóides inibem fortemente, tanto a produção de óxido nítrico, como a necrose tumoral provocadas pelas células de Kupffer quando estimuladas pela injúria (Kawada et al., 1998). Portanto, esta pode ser uma possível via de atuação da Brassica sp. nos processos de cicatrização, através do sinergismo entre glucosinolatos e polifenóis.

O conhecimento da constituição química das plantas usadas na medicina popular envolve um sistema complexo e combinatório de diferentes ferramentas capazes de elucidar estruturalmente as inúmeras classes e/ou moléculas que podem vir a constituir uma única planta. A espectrometria na faixa do ultravioleta e visível (UV-VIS) é uma técnica consolidada e amplamente utilizada nos últimos 50 anos. A espectrometria UV-VIS permite análises qualitativas e quantitativas de misturas moleculares, pois possibilita a visualização dos perfis espectrais que indicam a presença dos constituintes de uma mistura.

Neste estudo, a espectrometria UV-VIS foi utilizada no monitoramento de algumas classes de compostos globais constituintes das folhas da Brassica sp., bem como na determinação do perfil de concentração global relativa vinculada a cada estágio do desenvolvimento vegetativo/fenológico da planta utilizando-se diferentes solventes a partir de uma prospecção fitoquímica. Cabe ressaltar que a identificação de constituintes ativos específicos não foi focalizada.

MATERIAL E MÉTODOS

Preparo das mudas

Mudas de repolho foram produzidas sob ambiente protegido, em bandejas de isopor de 128 células, preenchidas com substrato agrícola comercial recomendado para a cultura e três sementes ISLA^® - Coração de Boi - Lote 15787 - sem Defensivos por célula. O preparo dos vasos para o plantio ocorreu durante o mês de abril de 2006.

Preparo dos canteiros

O solo da área experimental, classificado como argiloso vermelho-amarelo, apresenta uma análise laboratorial/constitucional mostrada na Tabela 1.

Para o transplante das mudas foram preparados três canteiros, dispondo-se em cada 32 mudas, sendo um para a colheita aos 40 dias (correspondente ao estágio fenológico IV), o segundo aos 60 dias (correspondente ao para estágio fenológico V) e o terceiro aos 80 dias (correspondente ao para o estágio fenológico VII) (Tabela 2). A determinação das datas de coletas foi aleatória, mantendo-se o intervalo fixo de 20 dias. A referência ao estágio fenológico faz-se necessária caso o experimento seja realizado em outras condições. O espaçamento entre linhas utilizado nos canteiros foram 30 x 30 x 50 cm (Figura 2). O preparo do solo consistiu de uma aração e abertura dos sulcos de plantio com auxílio de enxada. Aos 28 dias após a semeadura, as mudas aprestavam de 4 a 5 folhas definitivas, o que correspondente ao estágio II (Andaloro et al., 1983), e foram transplantadas para o local definitivo. Todo o plantio foi realizado na área agrícola experimental do Curso de Agronomia da Universidade Vale do Rio Doce - Campus II, Governador Valadares.

Durante a condução do experimento, realizaram-se duas capinas manuais aos 18 e 31 dias após o transplante das mudas para o canteiro definitivo. Aos 30 dias após o transplante, foi pulverizado extrato aquoso de folhas de Nim (Azadiraca indica), para controle da traça do repolho (Plutella xylostella). As irrigações foram realizadas de acordo com a necessidade da cultura.

Reagente e soluções

Todos os reagentes utilizados foram de grau analítico (Merck): etanol, diclorometano, NaOH e HCl. A água utilizada no preparo das soluções e limpeza das vidrarias foi de origem de filtro de osmose reversa (Permution^®).

Preparo dos extratos

Foram feitas três coletas de material vegetal no campo, ao acaso e em intervalos regulares de 20 dias. O material foi coletado aos 40 dias (estágio IV), 60 dias (estágio V) e 80 dias (estágio VII), Figura 3. De cada canteiro foram colhidas aleatoriamente dez plantas. O material coletado foi lavado em água corrente, seco em estufa à 40°C e umidade relativa controlada e moído em moinho de facas (Marconi® - Modelo 340).

Uma amostra de 10 g de cada material seco e triturado foi adicionado a 100 mL de solvente. Os solventes utilizados foram água, etanol e diclorometano. Em seguida, a suspensão foi submetida a 60 minutos de ultrasonicação (Unique^® - MaxiClean 1400), a temperatura ambiente (28 ºC). Aos extratos de etanol e diclorometano, foi adicionado 1,0 g de carvão ativo, com a finalidade de retirar a clorofila dos extratos, pois a mesma mascara os resultados colorimétricos da prospecção fitoquímica. Todos os extratos foram filtrados à vácuo e os filtrados resultantes analisados quimicamente. O estudo químico foi realizado no Laboratório de Pesquisa em Química da Universidade Vale do Rio Doce, Campus II, Governador Valadares.

Prospecção fitoquímica

Os extratos filtrados foram submetidos a testes fitoquímicos descrito por Simões et al., 1999, onde foi verificada a presença de açúcares redutores, compostos fenólicos, taninos, flavonóides, cumarinas, compostos antracênicos, heterosídeos cardiotônicos, saponinas, naftoquinonas, antraquinonas, triterpenos e esteróides. A prospecção fitoquímica foi realizada em triplicata. Os testes se baseiam em reações cromáticas e de precipitação (Simões et al., 1999).

Análises espectrométricas UV-VIS

O perfil espectrométrico das concentrações globais relativas dos constituintes da planta, com relação ao seu crescimento vegetativo nos estágios fenológicos IV (40 dias), V (60 dias) e VII (80 dias), foi traçado para extratos em água, etanol e diclorometano. Foram retiradas alíquotas de 1 mL de cada extrato e preparadas soluções a 0,1% (m/V - extrato seco/solvente) para as análises espectrométricas. Também, para efeito de comparação com os extratos etanólicos de cada estágio fenológico, foi realizada a extração dos fitoconstituintes da semente por trituração em grau de porcelana, sendo o extrato final de concentração 0,1% (m/V - triturado/solvente). Os espectros foram medidos com espectrômetro Femto 800 XI, com cubeta de quartzo de 1,0 cm de caminho óptico com varreduras de 200 a 700 nm, com intervalos de 2 nm.

Medidas de pH

Para os estudos de hidrólise do extrato aquoso, etanólico e em diclorometano de Brassica sp. em seus respectivos estágios fenológicos IV, V e VII, os diversos valores de pH foram obtidos através da adição de volumes conhecidos de NaOH 0,01 M ou HCl 0,01 M, tendo sido medidos potenciometricamente (pHmetro Quimis^®- Q 400A), com eletrodo de vidro calibrado previamente com tampões pH 4,0, 7,0 e 10,0 (Merck). Como o perfil espectrométrico de todos os extratos testados apresentaram o mesmo perfil espectral, foi adotado apenas o espectro do extrato aquoso para as análises.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A determinação da concentração global relativa dos constituintes fisiológicos em uma cultura específica depende de vários fatores que podem variar principalmente com a distribuição demográfica e sazonal da cultura (Rodrigues & Osuna, 2004; Yariwake et al., 2005; Santos et al., 2006; Monteiro et al., 2006; Gobbo-Neto & Lopes, 2007). Essas variações podem ocorrer em função de pequenas mudanças climáticas: incidência luminosa, recursos hídricos, etc.

Adotou-se a expressão concentração global relativa por dois motivos, ou seja, pelo fato de não se estar mensurando a contribuição isolada de cada molécula em cada extrato obtido e pelo fato de se estar vinculando um decréscimo relativo de concentração ao estágio fenológico IV, que é o ponto de partida, ou concentração relativa global considerada como inicial (100%), como mostra a Tabela 3.

Os espectros dos extratos aquosos e etanólicos de Brassica sp. (Figuras 4 e 5) apresentaram um decaimento da concentração global relativa dos constituintes, quando comparados os diferentes estágios fenológicos, evidenciado pela diminuição do coeficiente de extinção (absorvância) total para toda a faixa espectral medida. Porém, as concentrações dos extratos aquosos demonstraram maior absorção, evidenciando ser o solvente mais adequado para a extração de constituintes, que absorvem na faixa espectral de 225 a 420 nm. Para o extrato etanólico, apesar de apresentar baixa absorção, este extrai constituintes que absorvem na faixa de comprimento de onda entre 400 - 500 nm e 600 - 700 nm, como taninos condensados e alguns pigmentos (Havsteen, 2002; Simões et al., 1999), não sendo observado no extrato aquoso. A semelhança observada de 200 a 425 nm se dá em função da relativa proximidade das polaridades de ambos solventes. Segundo Solomons (1996), a água é o solvente mais eficiente para promover a ionização, mas a maioria dos compostos orgânicos não se dissolve apreciavelmente em água.

O extrato em diclorometano apresentou uma semelhança nos valores de absorção para os comprimentos de onda abaixo de 345 nm, mostrando um mesmo perfil de decaimento observado nos demais extratos. Acima de 345 nm ocorre uma inversão do perfil espectral apresentando valores de absorvância do estágio IV menores que aqueles apresentados no estágio V. Entretanto, as concentrações relativas voltam a decair no estágio fenológico VII (Figura 6).

Medidas de deslocamento espectral em função da hidrólise forçada (adição de concentrações e/ou gotas/volumes conhecidos de NaOH) e formação de pontos isosbésticos (Skoog et al., 2002) em função do pH foram obtidos para todos os extratos aquosos nos diferentes estágios vegetativos. Na Figura 7 é mostrado o perfil espectral do extrato aquoso para o estágio IV onde é variado o pH de 5,85 - 11,01. Espectros foram medidos para valores de pH entre 1,0 e 5,0 e não apresentaram modificações significativas em suas estruturas, indicando uma protonação molecular para esta faixa de pH. Os espectros para os estágios V e VII não são mostrados, por apresentarem o mesmo perfil que o apresentado na Figura 7, sendo este um indicativo de manutenção das mesmas classes de compostos, porém em menores concentrações relativas para os diferentes estágios vegetativos. Observa-se também uma mudança significativa no espectro para valores de pH > 9,0 o que indica uma possível/plausível deprotonação de grupos funcionais apenas em pH alcalino.

Em termos dos resultados da prospecção fitoquímica, estes mostraram a presença positiva de compostos fenólicos, flavonóides, triterpenos e esteróides para os extratos etanólicos nos estágios IV e V. Contudo, o estágio V revelou ainda a possível presença de taninos e heterosídeos cardiotônicos. Os extratos aquosos dos estágios IV e V revelaram positivamente a presença de açúcares redutores, compostos fenólicos, taninos, flavonóides, cumarinas, heterosídeos cardiotônicos, triterpenos e esteróides. Os extratos etanólicos e aquosos do estágio VII revelaram a presença de açúcares redutores, compostos fenólicos, flavonóides, taninos e heterosídeos cardiotônicos. Os extratos em diclorometano, para todos os estágios fenológicos, apresentaram resultados negativos para todas as classes analisadas, devido à diferença na polaridade.

CONCLUSÃO

A partir de análises espectrométricas verificou-se que o estágio fenológico em que há maior concentração global relativa dos constituintes da Brassica sp. é o fenológico IV, para todos extratos (Tabela 3). Porém, uma variação considerável é percebida entre os mesmos devido à presença de constituintes que absorvem em comprimentos de onda distintos. Apesar dos constituintes encontrados em água serem de polaridade relativamente próxima aos do extrato etanólico, a água é o melhor extrator para os compostos de interesse como derivados polifenólicos. Isso leva a compreender que um veículo hidroalcoólico seria mais adequado para formulação de fitoterápicos à base de Brassica sp. de uso tópico.

O extrato realizado em diclorometano não apresentou um estágio fenológico predominante com uma uniformidade das concentrações dos constituintes na faixa espectral analisada. Assim, a escolha do solvente dependerá do constituinte ativo em questão, como evidencia Simões et al., 1999.

Este trabalho contribui para o aperfeiçoamento da aplicação do repolho na fitoterapia, visto que as características demográficas e sazonais podem variar, mas não o estágio fenológico. A padronização do estágio fenológico permite uma redução no tempo do cultivo da cultura, de mão-de-obra e principalmente de injúrias causadas por pragas. Esta redução é importante para a economia na produção de extrato, pois como foi mostrado, não se necessita aguardar o estágio fenológico IX para a colheita, que leva em média 110 dias, dependendo das condições climáticas e ambientais da região.

Muitas formulações farmacêuticas nas farmácias magistrais são preparadas a partir de extratos brutos adquiridos de indústrias de fitoterápicos e com preços acessíveis. Vale ressaltar que farmacêuticos poderão adquirir extratos brutos de Brassica sp. de indústrias que utilizam desta metodologia e conseqüentemente obterão melhores resultados na terapia da cicatrização de feridas dos seus clientes, pois os constituintes ativos encontrar-se-ão mais concentrados.

AGRADECIMENTO

Os autores agradecem à FAPEMIG, pelo apoio prestado.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  01 Ago 2008
• Data do Fascículo
  Jun 2008