Investigação das atividades alelopática e antimicrobiana de Mikania laevigata (Asteraceae) obtida de cultivos hidropônico e tradicional

Investigation of the allelopathic and antimicrobial activities of Mikania laevigata (Asteraceae) obtained in hydroponic and traditional cultivars

ARTIGO

Investigação das atividades alelopática e antimicrobiana de Mikania laevigata (Asteraceae) obtida de cultivos hidropônico e tradicional

Investigation of the allelopathic and antimicrobial activities of Mikania laevigata (Asteraceae) obtained in hydroponic and traditional cultivars

Leopoldo Baratto^I; Karen Luise Lang^II; Danielli Cássia Vanz^III; Flávio Henrique Reginatto^IV; Jorge Barcelos Oliveira^V; Miriam Falkenberg^IV,*

^ICurso de Graduação em Farmácia, Centro de Ciências da Saúde, Campus Trindade, Universidade Federal de Santa Catarina, 88040-970 Florianópolis-SC, Brasil

^IIPrograma de Pós-Graduação em Farmácia, Centro de Ciências da Saúde, Campus Trindade, Universidade Federal de Santa Catarina, 88040-970 Florianópolis-SC, Brasil

^IIICurso de Farmácia, Universidade de Passo Fundo, 99001-970 Passo Fundo-RS, Brasil

^IVDepartamento de Ciências Farmacêuticas, Centro de Ciências da Saúde, Campus Trindade, Universidade Federal de Santa Catarina, 88040-970 Florianópolis-SC, Brasil

^VDepartamento de Engenharia Rural, Centro de Ciências Agrárias, Campus Itacorubi, Universidade Federal de Santa Catarina, 88040-900 Florianópolis-SC, Brasil

RESUMO

Os extratos etanólicos de folhas de guaco (Mikania laevigata) cultivado tradicionalmente no solo ou por hidroponia foram avaliados quanto às atividades alelopática e antimicrobiana. Para a atividade alelopática foi utilizado o ensaio de inibição da germinação de sementes de alface (Lactuca sativa), enquanto que para a atividade antimicrobiana utilizouse a técnica de difusão em disco. Observou-se um notável efeito alelopático dos extratos de ambos os cultivos, em especial do extrato etanólico do guaco tradicional, que mesmo na menor concentração testada inibiu completamente a germinação das sementes. Nenhum dos extratos etanólicos do guaco apresentou atividade antibacteriana significativa para as linhagens de Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis e Enterococcus faecium.

Unitermos: Mikania laevigata, Alelopatia, Atividade antimicrobiana, Hidroponia, Cultivo tradicional.

ABSTRACT

The ethanolic extract of "guaco" (Mikania laevigata) traditionally cultivated in the soil or in a hydroponic system were tested for allelopathic and antimicrobial activities. Allelopathic activity was evaluated by the inhibition of germination assay using lettuce seeds, and antimicrobial activity by the disc diffusion assay. A notable allelopathic effect was observed for both extracts, although a more expressive activity of traditional "guaco" was verified, since the inhibition of seeds germination was 100% even in the lower concentration. None ethanolic extract of "guaco" presented significant antimicrobial activity against Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium.

Keywords: Mikania laevigata, Allelopathy, Antimicrobial activity, Hydroponics, Traditional cultivation.

INTRODUÇÃO

O gênero Mikania, pertencente à família Asteraceae, possui mais de 430 espécies, sendo que cerca de 150 ocorrem no Brasil (Hind, 1993; Brandão et al., 2006; Agra et al., 2007 & 2008; Brandão et . al., 2008). Mikania laevigata Schultz Bip. ex Baker, conhecida popularmente como "guaco", é utilizada pelas suas propriedades antisséptica, expectorante, antiasmática e antirreumática (Simões et al. , 1988) e por sua semelhança morfológica com Mikania glomerata é freqüentemente confundida com esta espécie. Ambas são subarbustos de hábito trepador, apresentando caule cilíndrico, folhas opostas e de contorno oval, sendo que os capítulos dispõem-se em forma de glomérulos (Gilbert et al., 2005).

No gênero Mikania relata-se a presença de taninos, saponinas, óleo essencial contendo diterpenos e sesquiterpenos (Silva Júnior et al. , 1994; Martins et al., 1998), além de cumarina, ácidos hidroxicinâmico e metilcaurenóico (Fierro et al., 1999; Taleb-Contini et al., 2006), e também ácidos caurenóico e cinamoilgrandiflórico (Davino et al., 1989; Bertolucci et al., 2006; Pedroso et al., 2008). Diterpenos derivados do ácido caurenóico foram detectados em ambas as espécies, porém, pela análise em CLAE, foi observado que eles ocorrem em maiores concentrações em M. glomerata (Bertolucci et al., 2006). O óleo essencial de M. laevigata é constituído por sesquiterpenos representados por β-cariofileno, germacreno-D e biciclogermacreno (Limberger et al., 1998), enquanto que o óleo essencial de M. glomerata contém sesquiterpenos altamente oxigenados, como espatulenol e óxido de cariofileno (Limberger et al., 2001).

As cumarinas são responsáveis pelo aroma característico do guaco e sua concentração nas folhas pode variar em função de vários fatores, como os níveis de radiação solar e fotoperíodos (Castro et al., 2006). Cerca de 0,5% de cumarina foi encontrada nas folhas de M. glomerata e de 1,1 até 2,6% nas folhas de M. laevigata processadas da mesma maneira (Gilbert et al., 2005). Foi observado que quando as partes aéreas de M. glomerata foram irradiadas com raios gama, o conteúdo de cumarina aumentou, enquanto que a concentração de ácido o-cumárico diminuiu (Peregrino & Leitão, 2005).

A notável versatilidade do cultivo hidropônico, aliada aos excelentes resultados que se podem obter nos mais variados lugares, faz dele o sistema ideal para se adotar em uma ampla gama de condições diferentes (Douglas, 1987). Em alguns casos, o solo pode carecer de nutrientes ou ter uma estrutura pobre, e ainda a presença de insetos reduz consideravelmente as produções de forma tradicional (Resh, 1996). As vantagens do cultivo hidropônico incluem produção de melhor qualidade, crescimento vegetal mais rápido, economia de tempo e trabalho, custos menores, maior produtividade por área, equilíbrio nutricional, melhor aproveitamento da água, entre outros (Teixeira, 1996; Douglas, 1987; Resh, 1996; Alberoni, 1998; Delfín et al., 2000).

Em trabalhos anteriores de nosso grupo, relacionados ao cultivo hidropônico de plantas medicinais, verificamos vantagens deste sistema na produção de biomassa de Mikania laevigata (Scalco et al., 2002; Dinon et al., 2003; Baratto et al., 2006). O objetivo do presente trabalho foi avaliar o potencial alelopático e antimicrobiano dos extratos etanólicos das folhas de Mikania laevigata obtida por dois tipos de cultivo.

MATERIAL E MÉTODOS

Material vegetal

Mikania laevigata foi cultivada nas instalações do Laboratório de Agricultura Irrigada e Hidroponia (LabHidro) no Centro de Ciências Agrárias (CCA) da Universidade Federal de Santa Catarina (Florianópolis, Brasil). As estacas foram preparadas a partir de exemplar autêntico, identificado por Mara Rejane Ritter (exsicata FLOR29367, Departamento de Botânica, UFSC). Uma parte das estacas foi transplantada para o solo, constituindo o grupo controle (guaco tradicional, cultivado no solo) e as demais foram transferidas para uma bancada de hidroponia e receberam uma solução nutritiva balanceada de acordo com a condutividade, que foi mantida entre 1,2 a 2,2 mS/cm. As folhas do guaco de ambos os cultivos foram coletadas no mês de outubro de 2005, quando apresentavam grande desenvolvimento e produção de biomassa.

Preparo dos extratos

As folhas de ambos os experimentos foram secas em estufa de ar circulante, a cerca de 30 ºC, trituradas em moinho de facas e submetidas a extração por maceração em etanol (EtOH) P.A. (96%) na proporção de 1:10 (m/V) durante sete dias. O extrato foi filtrado e concentrado em rotavapor sob temperatura inferior a 60 ºC até secura total dos extratos.

Ensaio da inibição germinativa (alelopatia)

Os extratos secos de guaco hidropônico e tradicional foram redissolvidos em etanol P.A., obtendo-se soluções em concentrações de 5, 10, 15 e 20 mg/mL. Foram aplicados 3 mL de cada uma das soluções ou 3 mL de água destilada ou etanol P.A. 96% sobre discos de papel de filtro colocados em placas de Petri, deixando-se evaporar completamente o solvente. Em seguida, todos os discos foram umedecidos com 3 mL de água destilada e sobre a superfície de cada um foram distribuídas 20 sementes de alface (Lactuca sativa L., variedade Boston Branca). O ensaio foi realizado em triplicata, sendo monitorado por dois controles em que o disco de papel foi anteriormente impregnado com água destilada (controle "branco") ou EtOH P.A. (controle do solvente utilizado na extração e na diluição do extrato seco). As placas foram recobertas com filme plástico, expostas à luz natural e mantidas à temperatura ambiente. A contagem das sementes que germinaram deu-se em intervalos de 24, 48, 72 e 96 horas após a distribuição das sementes e baseou-se na emissão de radícula (Figura 1). Calculou-se a percentagem de inibição da germinação das sementes em relação aos controles e a significância da inibição da germinação foi avaliada pelo teste do qui-quadrado (χ²) (tabela de contingência 2x2), com correção de Yates, sendo que valores iguais ou superiores a 3,84 foram considerados significativos (α = 0,05) (Centeno, 1990).

Ensaio da atividade antimicrobiana

Foi realizada uma triagem da atividade antibacteriana frente a linhagens padrão ATCC de Staphylococcus aureus(25923),Escherichia coli(25992), Pseudomonas aeruginosa (27853), Enterococcus faecalis (29212) e Enterococcus faecium (10541), empregando-se a técnica de difusão de disco conforme as normas preconizadas pelo NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standard, 2004). O meio de cultura utilizado para o ensaio antibacteriano foi ágar Müller-Hinton (Merck) recém-preparado e submetido previamente ao teste de esterilidade. Em seguida foram aplicados os discos de papel de filtro impregnados com volume definido das soluções etanólicas dos extratos (20 µL), bem como os discos de fármacos antimicrobianos (ampicilina, amicacina, cloranfenicol e ceftadizima) em concentração definida para o controle de qualidade do ensaio. As concentrações testadas dos extratos de guaco foram de 1,25; 2,5; 10, 25, 50 e 100 mg/mL. Os extratos foram diluídos em água esterilizada e aplicados em discos de papel de filtro de 6 mm de diâmetro. Após a aplicação dos discos, as placas foram incubadas em estufa a 35 ± 1 ºC e após 18 horas de incubação foi realizada a leitura dos diâmetros dos halos de inibição.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Inibição da germinação (alelopatia)

Observou-se um notável efeito alelopático de ambos os extratos, considerado estatisticamente significativo. O extrato do guaco tradicional inibiu completamente a germinação das sementes em todas as concentrações testadas, enquanto que o extrato do guaco hidropônico teve 53% das sementes inibidas na concentração de 5 mg/mL e 100% de inibição da germinação nas demais concentrações (Tabela 1). Verificou-se uma maior atividade alelopática do extrato etanólico do guaco tradicional, em comparação ao guaco hidropônico, uma vez que o primeiro inibiu completamente a germinação das sementes mesmo na menor concentração, conforme pode ser observado na tabela 2.

A interação entre plantas consorciadas é bastante explorada em cultivos convencionais, trazendo inúmeros benefícios do ponto de vista agronômico, favorecendo a produtividade (França, 2004). Através desta interação, chamada de alelopatia, um vegetal compete com outro, provavelmente para assegurar o fornecimento de água, luz e nutrientes (Poser & Mentz, 2004). A alelopatia envolve uma cadeia complexa de comunicações químicas entre as plantas (Inderjit & Dakshini, 1995) e é um importante mediador da dinâmica populacional, determinando o padrão e a densidade da vegetação, em sistemas naturais e cultivados (Souza Filho, 2006). Os efeitos alelopáticos são sempre mediados por substâncias que pertencem a diferentes classes de metabólitos secundários, tais como fenóis, derivados dos ácidos cinâmico e benzóico, flavonóides, cumarinas, taninos, terpenos, alcalóides e poliacetilenos. No entanto, é difícil identificar qual desses grupos de metabólitos secundários é o principal responsável pela atividade alelopática (Inderjit & Dakshini, 1995).

Independentemente dos tipos de cultivos, M. laevigata mostrou-se uma planta promissora do ponto de vista agroecológico. Propriedades alelopáticas já foram descritas para uma outra espécie conhecida como guaco (Dias et al., 2005). Shao et al. (2005) demonstraram que o extrato aquoso de M. micrantha inibiu a germinação e o crescimento de algumas plantas, até mesmo quando resíduos do extrato foram incorporados na superfície do solo. Foram identificados alguns sesquiterpenos com significativa atividade alelopática; eles podem ser depositados diretamente no solo pela água da chuva ou gradualmente liberados durante a decomposição das folhas, afetando o crescimento de plantas vizinhas e colaborando para que M. micrantha torne-se uma espécie dominante em novos ecossistemas. A falta de predadores naturais desta espécie, como insetos fitófagos e fungos, permite que ela se dissemine rapidamente, provocando desequilíbrios ecológicos. Foram identificados alguns compostos responsáveis pelo efeito alelopático de espécies de Asteraceae: cumarinas, ácido trans-cinâmico, ácidos o-cumárico e p-cumárico, demonstrando que muitas espécies desta família possuem potencial herbicida (Chon et al., 2003). Os extratos aquosos e etanólicos de Baccharis trimera (Less.) DC. (carqueja) e Hypericum spp por exemplo, possuem substâncias que apresentam elevada inibição da germinação das sementes de alface (Carreira et al., 2005; Fritz et al., 2007).

A diferença na potência alelopática dos extratos obtidos a partir dos dois tipos de cultivos pode ser explicada pela influência dos diversos fatores ambientais a eles relacionados, como a temperatura, a intensidade luminosa, a textura do solo e microrganismos presentes, e ainda a disponibilidade de água e nutrientes (Gatti et al., 2004), variando conforme o ambiente no qual o vegetal se desenvolve e o tipo de cultivo empregado (Simões & Spitzer, 2004). No sistema hidropônico, o aporte de água e nutrientes é constante, o que freqüentemente contribui para o crescimento e produção de biomassa, mas na ausência de substrato (solo) a exposição a microrganismos é reduzida, o que pode diminuir a produção de certos metabólitos secundários.

Recentemente, estudos vêm sendo realizados, focados no manejo e no controle das ervas daninhas, na tentativa de diminuir o uso de herbicidas comerciais, seja através da utilização da alelopatia, por meio da rotação de culturas, sistemas adequados de semeadura entre espécies e entresafras, além de sistemas agroecológicos (Gatti et al., 2004). Assim, o cultivo de Mikania laevigata pode vir a se estabelecer como uma nova alternativa para o manejo de ervas daninhas, vantagem que se somaria ao próprio valor econômico como planta medicinal.

Atividade antimicrobiana

Não houve formação de halo de inibição com nenhum dos extratos de M. laevigata, de modo que nas concentrações testadas não houve atividade antibacteriana significativa para as linhagens de S. aureus (25923), E. coli (25992), P. aeruginosa (27853), E. faecalis (29212) e E. faecium (10541). Estes resultados são, de certa forma, inesperados, considerando o uso popular da espécie como antisséptico e outros estudos publicados com espécies de guaco. A cumarina é considerada uma das substâncias responsáveis pela atividade antimicrobiana do guaco (dos Santos et al. , 1996) e sua presença já foi comprovada em M. laevigata. Em outro estudo com esta espécie, comprovou-se atividade inibitória do extrato etanólico sobre o crescimento e a adesão celular de Streptococcus mutans, um grupo de microorganismos associados às cáries dentais. Acredita-se que os ácidos cupressênico, diterpênico e caurenóico possam ser responsáveis por esta atividade (Yatsuda et al., 2005).

O óleo essencial de outra espécie de guaco, M. glomerata, exibiu uma forte atividade contra Candida albicans. Dentre os componentes do óleo essencial, alguns apresentaram atividade antimicrobiana, incluindo 1,8-cineol, limoneno, linalol, geranial, germacreno-D e mentol (Duarte et al., 2005). As frações obtidas em diclorometano, acetato de etila e n-butanol a partir de M. lanuginosa e o ácido caurenóico apresentaram atividade antimicrobiana frente a bactérias Grampositivas (Staphylococcus aureus e S. epidermidis), mas foram inativos contra bactérias Gram-negativas (Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli e Bacillus cereus) (Rios et al., 2000). O extrato etanólico das folhas de M. hirsutissima não exibiu atividade antibacteriana contra E. coli, no entanto mostrou-se ativo contra S. aureus (Brasileiro et al., 2006).

A avaliação da atividade frente a outras espécies de microrganismos contribuirá para uma melhor definição do perfil de atividade antimicrobiana de Mikania laevigata e de eventuais diferenças entre extratos obtidos a partir de diferentes formas de cultivo.

AGRADECIMENTOS

À Profa. Dra. Mara Rejane Ritter (Depto. de Botânica, UFRGS) pela identificação do material vegetal, ao Programa Institucional de Bolsas de Iniciação Científica (PIBIC/CNPq/UFSC) pela bolsa concedida ao autor L. Baratto; à Fundação de Apoio à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul (FAPERGS, Edital PROADE 2) e à Fundação de Apoio à Pesquisa do Estado de Santa Catarina (FAPESC, Edital Universal 2003), pelos financiamentos concedidos.

Received 29 August 2008; Accepted 4 October 2008

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  18 Fev 2009
• Data do Fascículo
  Dez 2008

Histórico

• Aceito
  04 Out 2008
• Recebido
  29 Ago 2008