Avaliação in vitro da atividade antibacteriana de um cimento odontológico à base de óleo-resina de Copaifera multijuga Hayne

In vitro assessment of antibacterial activity of a dental cement constituted of a Copaifera multijuga Hayne oil-resin

ARTIGO

Avaliação in vitro da atividade antibacteriana de um cimento odontológico à base de óleo-resina de Copaifera multijuga Hayne

In vitro assessment of antibacterial activity of a dental cement constituted of a Copaifera multijuga Hayne oil-resin

Kátia Regina Felizardo Vasconcelos^I; Valdir Florêncio da Veiga Junior^II; Waldireny Caldas Rocha^III; Maria Fulgência Costa Lima Bandeira^{IV, *}

^IPrograma de Mestrado em Patologia Tropical, Universidade Federal do Amazonas, Av Ayrão 1033A, 69025-005 Manaus-AM, Brasil

^IIDepartamento de Química, Universidade Federal do Amazonas, Av. Gal Rodrigo Octávio Jordão Ramos, 3.000, Japiim, 69077-000 Manaus-AM, Brasil

^IIICentro de Biotecnologia da Amazônia, Laboratório de Fitoquímica, Av Gov. Danilo de Matos Areosa 690, 69075-351 Manaus-AM, Brasil

^IVFaculdade de Odontologia, Universidade Federal do Amazonas, Av Ministro Waldemar Pedrosa, 1539, 69025-050 Manaus-AM, Brasil

RESUMO

Um dos materiais utilizados para a adequação do meio bucal no serviço público é o cimento produzido a partir de óxido de zinco e eugenol. Entretanto, o eugenol é uma substância citotóxica que pode desencadear alguns efeitos adversos. Por essa razão, procura-se substituir o eugenol por uma substância que apresente baixa toxicidade, mantendo ou mesmo melhorando as propriedades do cimento. O óleo-resina de copaíba é um produto natural, utilizado pelas populações amazônicas e reconhecido por suas propriedades medicinais. Baseando-se nas propriedades desse óleo-resina, na ação antimicrobiana comprovada do hidróxido de cálcio e na ação anti-séptica do óxido de zinco, propôs-se formular um cimento odontológico obtido da associação do ZnO, Ca(OH)₂ e óleo-resina de Copaifera multijuga Hayne e avaliar sua atividade antibacteriana através do teste de diluição em meio líquido frente às cepas padrão de Streptococcus mutans (ATCC 25175) e S. sanguinis (ATCC 15300). Nesse ensaio, utilizaram-se os seguintes grupos experimentais: o cimento contendo ZnO, Ca(OH)₂ e óleo-resina de copaíba (G1) e cada um dos constituintes isoladamente, ZnO (G2), Ca(OH)₂ (G3) e óleo-resina de copaíba (G4). Todos os grupos analisados demonstraram atividade antibacteriana, o G4 apresentou os melhores resultados e o G1 mostrou-se um cimento promissor a ser utilizado em odontologia.

Unitermos: Óleo de copaíba, atividade antibacteriana, cimentos odontológicos, Copaifera multijuga, Fabaceae.

ABSTRACT

One of the materials utilized for suitability of the oral means in the public service is the cement produced from zinc oxide and eugenol. However, eugenol is a cytotoxic substance that can trigger some adverse effects. For this reason, it is desired to replace eugenol for another substance that presents low toxicity, keeping or even improving the cement properties. The copaiba oil-resin is a natural product, utilized by the Amazonian population and recognized for its medicinal properties. Based on the properties of this oil-resin, on the proven antimicrobial activity of calcium hydroxide and on the anti-septic action of zinc oxide, it was proposed to formulate a dental cement obtained through the association of ZnO, Ca(OH)₂ and Copaifera multijuga Hayne oil-resin and assess its antibacterial activity through the test of dilution in aqueous medium against the standard of Streptococcus mutans (ATCC 25175) and S. sanguinis (ATCC 15300). In this assay, the following experimental groups were utilized: the cement containing ZnO, Ca(OH)₂ and copaiba oil-resin (G1) and each one of the constituents individually, ZnO (G2), Ca(OH)₂ (G3) and copaiba oil-resin (G4). All the analyzed groups showed antibacterial activity, G4 showed the best results and G1 showed itself to be a promising cement for application in dentristy.

Keywords: Copaiba oil, antibacterial activity, dental cements, Copaifera multijuga, Fabaceae.

INTRODUÇÃO

A cárie dental é reconhecida como uma doença infecto-contagiosa, de caráter multifatorial, que acomete cerca de 95% da população, necessitando do hospedeiro, da dieta cariogênica e da microbiota bucal, onde é fundamental o papel dos Streptococcus mutans no início da formação da cárie (Silva & Nelson Filho, 1994). Segundo Fejerskov & Kidd (2005), além dos fatores biológicos relatados, os fatores sócio-econômicos influenciam na susceptibilidade do desenvolvimento da lesão de cárie.

A adequação do meio bucal consiste em um conjunto de procedimentos que visam a diminuição dos níveis de microrganismos cariogênicos, sendo a última etapa realizada através de restaurações provisórias das lesões cavitadas (Silva & Nelson Filho, 1994). Sua realização é de suma importância antes de iniciar as atividades reabilitadoras necessárias ao restabelecimento da função e/ou da estética dos elementos dentários afetados por cavidades (Ribeiro & Bussadori, 2000).

Tradicionalmente, utiliza-se o cimento composto por óxido de zinco e eugenol para adequação do meio bucal em odontologia. Entretanto, o eugenol é uma substância citotóxica, que pode desencadear a degeneração dos tecidos moles e morte de fibroblastos, além de dermatite de contato e reações alérgicas (Barkin et al., 1984; Sarrami et al., 2002). De acordo com Watts & Patterson (1987), a reação inflamatória persistente, necrose pulpar e ausência de reparo foram observadas após o uso desse cimento em exposições pulpares de ratos.

Por essa razão, tem-se procurado uma substituição ao eugenol, devido seu potencial irritativo, buscando uma nova substância com baixa toxicidade, atividade antibacteriana, acessível e de confiabilidade para o cirurgião-dentista (Bandeira et al., 1999a). Além disso, o consumidor tem se tornado cada vez mais exigente com a qualidade dos produtos que utiliza, sendo crescente a sua preocupação em fazer uso de produtos menos agressivos de origem natural (Packer & Luz, 2007).

O óleo-resina de copaíba é um produto extraído de várias espécies do gênero Copaifera (Veiga Junior & Pinto, 2002) e utilizado há muito tempo pelos índios para tratamento de feridas, devido aos seus efeitos antiinflamatórios (Veiga Junior et al., 2001; Veiga Junior et al., 2006; Veiga Junior et al., 2007; Agra et al., 2007; 2008), antitumorais (Lima et al., 2003), anti-sépticos (Bruneton, 1987), ação germicida (Bloise, 2003; Biavatti et al., 2006), antibacterianos (Opdyke, 1976; Lima et al., 1995; Bandeira, 1998; Miranda et al., 2000) Santos et al., 2008) e antifúngico (Abinader, 2005; Bandeira et al., 2006).

A espécie Copaifera multijuga Hayne pertence à família Fabaceae, subfamília Caesalpinioideae. Em uma área de plantação desta espécie na Reserva Adolfo Ducke, do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA), em Manaus, árvores de grande porte atingem até 36 m de altura com diâmetro de até 80 cm. Muitos dos trabalhos realizados com o gênero Copaifera estão relacionados com o óleo-resina que é obtido do tronco destas árvores. Segundo alguns autores, esse óleo é produto da desintoxicação do organismo vegetal e funciona como defesa da planta contra animais, fungos e bactérias (Bandeira et al., 1999b; Veiga Junior et al., 2001; Veiga Junior & Pinto, 2002). As espécies desse gênero que produzem óleo-resina em quantidades apreciáveis são encontradas nas regiões tropicais da América do Sul, como o Brasil, a Venezuela e a Colômbia, com maior incidência no Brasil, onde apresentam ampla distribuição na terra firme da Amazônia (Alencar, 1981; Veiga Junior et al., 2001; Veiga Junior & Pinto, 2002).

Segundo Bandeira et al., (1999b), o óleo-resina de C. multijuga apresenta em sua composição vários sesquiterpenos, principalmente β-cariofileno, α-humuleno, cedreno, cadineno e bisaboleno.

Almeida (1998); Bandeira (1998; 2000); Garrido (2004) e Abinader (2005) comprovaram ser possível a associação entre o óleo-resina de copaíba, óxido de zinco e hidróxido de cálcio, propondo novos estudos para que essa associação pudesse ser utilizada em odontologia.

Estudos demonstraram atividade antibacteriana do óleo-resina de Copaifera multijuga Hayne frente aos Streptococcus mutans e Streptococcus sanguinis (Bandeira, 1998; Simões, 2004; Vasconcelos, 2006).

Analisando as propriedades medicinais do óleo da Copaifera multijuga Hayne e os resultados encontrados por Bandeira et al., (1999a; 1999b), Simões (2004), Storck (2004), Garrido (2004), Garrido et al., (2004) e Abinader (2005), este trabalho tem por objetivo formular um cimento odontológico à base de óleo-resina de Copaifera multijuga Hayne, avaliando sua atividade antibacteriana frente a cepas de Streptococcus mutans e Streptococcus sanguinis, visando sua posterior utilização para adequação do meio bucal em odontologia.

MATERIAL E MÉTODOS

Obtenção do óleo

O óleo-resina da Copaifera multijuga Hayne estudado foi obtido da Reserva Adolfo Ducke, do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA), localizada no Km 17 da Rodovia Manaus-Itacoatiara, no Estado do Amazonas, da espécie catalogada sob o nº 69. A coleta do óleo-resina foi realizada em setembro de 2006.

Análises cromatográficas

Para a identificação dos constituintes do óleo de copaíba foi realizada a análise por meio de cromatografia em fase gasosa acoplada a detector de ionização de chama (CG-DIC) e a detector de espectrometria de massas (CG-EM). Anteriormente a todas as análises cromatográficas realizadas o óleo de copaíba sofreu uma modificação química de forma a adequar sua polaridade às necessidades do sistema cromatográfico utilizado. O óleo foi mantido em contato com solução recém-preparada de diazometano dissolvido em éter, de forma a produzir a esterificação dos grupamentos carboxila dos ácidos diterpênicos presentes no óleo. Para as análises de CG-DIC foi utilizado um cromatógrafo em fase gasosa modelo Hewlett-Packard HP-6890 com injetor automático Agilent 7893B em split 1:20 com injetor a 220 ºC, gás de arraste H₂ a 3,6 ml/min, detectores a 270 ºC, com duas colunas cromatográficas HP-INNOWAX, de 30 m de comprimento, 0,320 m de diâmetro interno e 0,25 um de espessura de fase e HP-5 (5% fenil em metil siloxano), de 30 m de comprimento, 0,320 m de diâmetro interno e 0,25 um de espessura de fase.

Utilizou-se um Cromatógrafo à Gás Varian, modelo 3900; um Espectrômetro de Massas Varian, modelo Íon Trap 2000; um software de busca com biblioteca NIST, Wiley e um software Saturno 2100 T GC/MS. O sistema de análise utilizado para programação do cromatógrafo em fase gasosa apresentou temperatura do injetor 270 °C, Split 1:20, fluxo de hélio na coluna 2,0 mL min^-1 , programação de temperatura do forno com temperatura inicial 110 ºC até 140 ºC com razão de aquecimento de 2 ºC min^-1, 140 ºC a 290 ºC com razão de aquecimento de 8 ºC min^-1, tempo de corrida 35 min, coluna VF-1ms LB com 30 m x 25 mm x 0,25 µm, fase estacionária 100% metil polisiloxano. A programação do espectrômetro de massas apresentou temperaturas de linha transferência em 200 ºC, mainfold 50 ºC e trap em 190 ºC, range de m/z de 40 a 500 u.m.a. e ionização por impacto de elétrons (70 eV).

Formulação do cimento

Para a formulação do cimento foram utilizados 0,57 g de óxido de zinco (SS White^®, Brasil), 0,18 g de hidróxido de cálcio (SS White^®, Brasil) e 0,118 mL de óleo-resina de Copaifera multijuga Hayne, visando obter um cimento com consistência espessa e homogênea, ideal para aplicação como cimento provisório na clínica odontológica.

Determinação do pH do cimento

A medida do pH do cimento e seus componentes foi realizada segundo Leonardo et al., (1992), de acordo com os grupos a seguir:

Óleo-resina de Copaifera multijuga Hayne + óxido de zinco + hidróxido de cálcio (cimento);

Óleo-resina de Copaifera multijuga Hayne + hidróxido de cálcio (pasta);

Óleo-resina de Copaifera multijuga Hayne + óxido de zinco (pasta);

Óleo-resina de Copaifera multijuga Hayne.

Foram pesados 1,5 g dos compostos (cimento e pastas) em balança de precisão (Sartorius^®, EUA) e, em seguida, diluídos em 6 mL de água destilada. Agitou-se as soluções em Vortex por 15 minutos e aferiu-se o pH com auxílio de fitas indicadoras de pH (Merck^®, Alemanha).

Determinação da concentração inibitória mínima

A concentração inibitória mínima (CIM) foi determinada tendo como base o método de diluição em meio líquido preconizado por Andrews (2001) e modificado por Abinader (2005), segundo as normas do NCCLS (2002). Foram utilizadas cepas padrão de Streptococcus mutans ATCC 25175 e Streptococcus sanguinis ATCC 15300, disponibilizadas para a pesquisa pelo Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde (INCQS-Fiocruz, RJ).

O crescimento bacteriano foi obtido em fase exponencial, no período de 24 horas em placa de Petri, em microaerofilia a 37 ± 1 ºC. Em condições assépticas, foram retiradas alíquotas dos microrganismos coletados com alça de platina com 5 mm de diâmetro para inoculação em 5 mL de solução salina estéril em tubos de ensaio de 10 x 150 mm. Os preparados foram turbilhonados em Vortex até a obtenção de uma suspensão homogênea. As suspensões foram padronizadas pela escala #0,5 de McFarland.

Para a realização do ensaio foram utilizados os seguintes grupos experimentais:

(G1) - Óleo-resina de Copaifera multijuga Hayne + óxido de zinco + hidróxido de cálcio (cimento);

(G2) - Óxido de zinco - (ZnO);

(G3) - Hidróxido de cálcio - Ca(OH)₂

(G4) - Óleo-resina de Copaifera multijuga Hayne;

Os experimentos foram realizados em tubos de ensaio estéreis de 19,8 x 1,8 milímetros. Cada tubo continha o meio de cultura (caldo BHI), o grupo experimental e o inóculo. Uma solução inicial foi preparada com o grupo experimental (G1), contendo 0,57 g de óxido de zinco, 0,18 g de hidróxido de cálcio e 0,118 mL de óleo-resina de copaíba, além de 0,05 mL de inóculo e o meio líquido, ajustado para totalizar 10 mL. Foram realizadas diluições sucessivas a 50% da solução inicial, obtendo-se cinco diluições nos 6 tubos (A-F), em que, para o óxido de zinco, por exemplo, utilizou-se 0,57 g no grupo experimental do tubo A e, ao final das diluições, 0,017 g no tubo F (Tabela 1).

Como controle positivo foi utilizada uma solução contendo apenas 9,95 mL de meio de cultura e 0,05 mL de inóculo bacteriano. Em todos os experimentos foi utilizado também um controle negativo, contendo apenas os 10 mL do meio de cultura.

De forma a avaliar se a atividade antibacteriana observada foi originada pelo grupo experimental G1 ou por apenas algum de seus constituintes, isoladamente, foram realizados experimentos utilizando apenas óxido de zinco, hidróxido de cálcio ou óleo de copaíba como grupos experimentais, denominados G2, G3 e G4, respectivamente. Nesses experimentos foram utilizadas as mesmas quantidades dos três materiais analisados inicialmente, 0,05 mL de inóculo e meio de cultura, completando os 10 mL, sempre em 6 experimentos diferentes (A-F), com as cinco diluições descritas anteriormente (Tabela 1).

Antes da incubação os tubos foram agitados em Vortex para homogeneização das substâncias testadas com o meio de cultura. Em seguida, foram incubados em estufa bacteriológica por 24 horas a 37± 1 ºC, em microaerofilia.

Após as 24 horas de incubação, semeou-se com o auxílio de um swab, o conteúdo de cada um dos tubos em placas de Petri, divididas em quatro quadrantes onde cada quadrante correspondia a uma diluição. As placas foram, então, incubadas em microaerofilia e o crescimento bacteriano observado após 24 e 48 horas. Os quadrantes que não apresentaram crescimento bacteriano foram considerados negativos e os que apresentaram crescimento foram considerados positivos.

A CIM foi considerada a menor concentração capaz de inibir 100% do crescimento bacteriano, tendo como referência o seu respectivo controle positivo.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

O gênero Streptococcus foi o escolhido para esse experimento uma vez que é o gênero bacteriano predominante desde o nascimento até a morte do indivíduo e, segundo Uzeda (2002), a superfície coronária dos dentes representa uma área favorável à colonização e implantação de Streptococcus mutans e Streptococcus sanguinis.

Os resultados da análise cromatográfica do óleo-resina da Copaifera multijuga Hayne revelaram que entre os seus componentes estão vários sesquiterpenos, principalmente β-cariofileno (9,2%), α-humuleno (1,8%), germacreno D (3,5%), óxido de cariofileno (11,5%), cubenol (16,7%) e bisabolol (7,2%) e também diterpenos de esqueleto labdano, como os ácidos copálico (2,1%), 3β-hidróxi-copálico (1,7%) e pinifólico (1,3%). Esses resultados foram semelhantes aos encontrados por vários autores (Bandeira, 1998; Cascon & Gilbert, 2000; Bandeira, 2000; Veiga Jr & Pinto, 2002, Lima et al., 2003 e Simões, 2004).

As análises do pH das soluções mostraram que a de maior pH (9,5) foi a da associação Ca(OH)₂ + óleo-resina de Copaifera multijuga Hayne, seguida da associação de ZnO + óleo-resina de Copaifera multijuga Hayne (pH = 6,5). O pH do óleo-resina de Copaifera multijuga Hayne foi de 4,5 confirmando os achados de Trease (1983), Bandeira (1998), Simões (2004) e Abinader (2005) que afirmaram que o óleo-resina de copaíba apresentou característica ácida de pH, enquanto que o pH do cimento G1 foi de 10, o que para o gênero Streptococcus proporcionaria um meio com pH de difícil crescimento (Cruz et al., 2001).

A CIM foi obtida para cada grupo experimental e os resultados analisados através de estatística descritiva.

Os resultados obtidos foram promissores, mostrando que o cimento G1 apresentou atividade antibacteriana mesmo em quantidades muito pequenas. Frente ao S. mutans e ao S. sanguinis mostrou atividade antibacteriana em todas as diluições analisadas no tempo de 24 horas, e em 48 horas, a concentração inibitória mínima foi até a diluição de 1:2, mostrando que a atividade antibacteriana foi proporcional à concentração do cimento (Tabela 2).

A inibição dos microrganismos ocorreu em todos os grupos testados. O óxido de zinco (G2) apresentou atividade antibacteriana frente ao S. mutans em todas as diluições analisadas e frente ao S. sanguinis a inibição foi até a diluição de 1:16, no tempo de 24 horas. Em 48 horas, a concentração inibitória mínima foi até a diluição 1:2, frente ao S. mutans, e até a diluição 1:4, frente ao S. sanguinis. Esse resultado é condizente com o observado por Bandeira (1998), que demonstrou atividade bactericida do óxido de zinco até a concentração de 50 mg/mL.

Outro componente do cimento testado isoladamente foi o hidróxido de cálcio (G3), o qual foi capaz de inibir o S. mutans em todas as diluições testadas e frente ao S. sanguinis até a diluição 1:8, no período de 24 horas. Em 48 horas, a concentração inibitória mínima foi até a diluição de 1:8, frente ao S. mutans e até a diluição 1:2, frente ao S. sanguinis.

Os componentes do cimento analisados isoladamente (G2, G3 e G4) apresentaram-se com capacidade de inibir as duas bactérias. Os espectros de ação dos grupos 2 e 3 foram muito semelhantes, porém a ação antibacteriana do óleo de copaíba (G4) se diferenciou por apresentar eficiência mesmo quando em pequena concentração.

O óleo de copaíba (G4) apresentou o melhor desempenho frente aos microrganismos analisados, com as vantagens de ser um produto natural e de menor custo. Sua capacidade de inibir as duas bactérias em todas as diluições analisadas demonstrou a atividade antibacteriana desse óleo-resina, conforme já anteriormente observado por outros autores (Marussella & Sicurella, 1960; Opdyke, 1976; Lima et al., 1995; Bandeira, 1998; Miranda et al., 2000; Cascon & Gilbert, 2000; Garrido et al., 2004 e Abinader, 2005).

CONCLUSÃO

O óleo-resina de Copaifera multijuga Hayne e o cimento produzido apresentaram atividade antibacteriana frente ao S. mutans e ao S. sanguinis no teste de diluição em meio líquido, portanto o óleo de copaíba apresentou-se com grande potencial para o uso como veículo ao cimento.

O cimento mostrou-se um material promissor a ser utilizado em odontologia, necessitando de estudos posteriores no que tange a propriedades físico-químicas e de biocompatibilidade.

Recebido 1 Outubro 2008

Aceito 18 Novembro 2008

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  09 Mar 2009
• Data do Fascículo
  Dez 2008

Histórico

• Recebido
  01 Out 2008
• Aceito
  18 Nov 2008