Atividade antioxidante e captora de radicais livres dos extratos de Achyrocline alata (Kunth.) DC. em comparação com extratos de Achyrocline satureioides (Lam.) DC.

Antioxidant and free radical scavenging effects in extracts of the Achyrocline alata (Kunth) DC. in comparison with the extracts of the Achyrocline satureioides (LAM.) DC.

ARTIGO

Atividade antioxidante e captora de radicais livres dos extratos de Achyrocline alata (Kunth.) DC. em comparação com extratos de Achyrocline satureioides (Lam.) DC.

Antioxidant and free radical scavenging effects in extracts of the Achyrocline alata (Kunth) DC. in comparison with the extracts of the Achyrocline satureioides (LAM.) DC.

Rafaela F. Grassi-Zampieron^I; Maria C. Vieira^II; João M. de Siqueira^{III, *}

^ILaboratório de Farmacognosia, Departamento de Farmácia-Bioquímica, Centro de Ciências Biológicas e da Saúde, Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, CP 549, 79070-900 Campo Grande, MS, Brasil

^IIFaculdade de Ciências Agrárias, Universidade Federal da Grande Dourados,. CP 533, Rodovia Dourados a Ithaum, km 12, 79804-970 Dourados-MS, Brasil

^IIIUniversidade Federal de São João Del Rei, Campus Centro-Oeste Dona Lindu, Rua Sebastião Gonçalves Coelho, 400, 35501-296 Divinópolis-MG, Brasil

RESUMO

Achyrocline alata (Kunth.) DC. e Achyrocline satureioides (Lam.) DC., espécies pertencentes à família Asteraceae, são utilizadas na medicina popular de Campo Grande, Mato Grosso do Sul, como plantas sucedâneas. O presente trabalho teve com objetivo comparar os extratos obtidos dessas espécies através de ensaios químicos simples destinados a testar as atividades antioxidante e captora de radicais livres, utilizando como modelo β-caroteno e DPPH, respectivamente. Tais ensaios revelaram que os extratos de A. satureioides foram mais ativos como captores de radicais livres do que os extratos obtidos de A. alata. Todos os experimentos foram feitos em triplicata, utilizando quercetina como padrão.

Unitermos:Achyrocline alata, Achyrocline satureioides, Asteraceae, antioxidante, DPPH, β-caroteno.

ABSTRACT

Achyrocline alata (Kunth.) DC. and Achyrocline satureioides (Lam.) DC. are species belonging to the family Asteraceae widely used in the folk medicine of Campo Grande, Mato Grosso do Sul, being considered substitute plants. The present work aimed to compare the obtained extracts of these species to simple chemical assays, in order to test the antioxidant activity and free radical scavenging, using β-carotene and DPPH as reference, respectively. With these assays it was observed that the obtained extracts of Achyrocline satureioides were more active, as free radical scavenging, than the same obtained extracts of Achyrocline alata. These chemical assays were compared to a known patterned, quercetin, and and they were dealt under triplicate basis.

Keywords:Achyrocline alata, Achyrocline satureioides, Asteraceae, antioxidant, DPPH, β-carotene.

INTRODUÇÃO

O gênero Achyrocline (Less.) DC., Asteraceae, inclui cerca de trinta espécies distribuídas em regiões tropicais e subtropicais, não só no Brasil como também nas Américas do Sul e Central e na África, incluindo Madagascar (Bremer et al., 1994). Na América do Sul são encontradas A. alata, A. tomentosa, A. flaccida e A. satureioides (Souza, 2002; Sonaglio, 1987).

Destas espécies, a Achyrocline alata (Kunth.) DC. é citada como uma das seis plantas medicinais mais utilizadas na medicina popular em Campo Grande, Mato Grosso do Sul (Nunes et al., 2003), onde é conhecida popularmente como "jateí-kaá". Essa espécie, juntamente com outra do mesmo gênero é muito comum no Brasil e países vizinhos - Achyrocline satureioides (Lam.) DC., conhecida popularmente como "macela" -, são utilizadas de forma indistinta, sendo a primeira considerada sucedânea desta última (Nunes et al., 2003; Vendruscolo et al., 2005).

Investigações químicas de ambas as espécies, publicados anteriormente, resultaram no isolamento de diferentes flavonóides (Broussalis et al., 1988; 1993) e sesquiterpenos (Bohlman et al., 1980). No entanto, somente A. satureioides foi estudada sob o ponto de vista farmacológico, e seu extrato aquoso apresentou atividades antiinflamatória e analgésica e efeito sedativo, prestando-se também ao tratamento de disfunções gastrintestinais, devido a suas atividades hepatoprotetora e antiespasmódica (Kadarian et al., 2002; Simões et al., 1988). Fachinetto et al. (2007) verificaram atividade anti-proliferativa e citotóxica desta espécie, sobre o ciclo celular de Allium cepa indicando seu potencial terapêutico. A. satureioides foi também avaliada, revelando significativa atividade antioxidante in vitro (Desmarchelier et al., 1998). Entretanto, tanto o extrato acetato de etila de A. alata como A. satureioides não apresentaram atividade antimalárica quando testados em ratos infectados pelo Plasmodium berghei (Mariath et al., 2009).

O objetivo no presente trabalho foi traçar um perfil comparativo das capacidades captora de radicais livres e antioxidante das duas espécies e, desse modo, obter parâmetros de avaliação que permitissem justificar a substituição de uma espécie pela outra, já que ambas são utilizadas indistintamente na medicina popular sul-mato-grossense. Diversos modelos já foram propostos para a avaliação prévia de substâncias e extratos vegetais com possível atividade antioxidante e captora de radicais. No presente trabalho foi utilizado ensaios químicos por autografia envolvendo β-caroteno e o radical 2,2-difenil-1-picril-hidrazila (radical-DPPH), seguidos de avaliação quantitativa com DDPH por espectrometria (Cavin et al., 1998a,b).

MATERIAL E MÉTODOS

Material vegetal

Inflorescências de A. alata e de A. satureioides (Asteraceae) foram coletadas em Dourados, MS, no campus da UFMS, Brasil, em abril de 2002. A identificação botânica foi realizada por Lílian Auler Mentz e amostras foram depositadas no Herbário CGMS, do Laboratório de Botânica, CCBS, UFMS, Campo Grande, MS, Brasil, sob números 11 486 e 11 487, respectivamente. As inflorescências foram submetidas a secagem com ventilação e, posteriormente, trituradas e tamisadas (Tamis Mesh 9).

Extratos

Para comparar as atividades antioxidante e captora de radicais livres de A. alata (AA) e A. satureioides (AS), foram inicialmente preparados extratos aquosos (EAQU-AA e EAQU-AS). Para a obtenção de cada extrato, adicionaram-se 100 mL de água fervente a 5 g da droga vegetal, mantendo-se a mistura em recipiente fechado por 20 min e, em seguida, filtrando-a. O infuso resultante foi liofilizado (Lemos-Senna et al., 1997; Desmachelier et al., 1998). Outros extratos e preparações de droga vegetal foram obtidos: diclorometânicos (EDCM-AA e EDCM-AS), cada um deles preparado com 5 g da droga vegetal em 50 mL de solvente, sendo a mistura mantida em recipiente fechado em temperatura ambiente, e então filtrada e concentrada em rotavapor. À torta resultante de cada extrato diclorometânico foram adicionados 50 mL de metanol, e após 24 horas as misturas foram filtrados e concentrados (EMeOH-AA e EMeOH-AS) (Desmachelier et al., 1998). Além desses, a tintura preparada pelo processo de percolação, ou seja, maceração com etanol 70% GL por 6 h ao abrigo da luz, seguida de extração (gotejamento a 1 mL/min), até se obter uma solução a 20% p/v em etanol 70° GL (Farmacopéia Brasileira, 1988) (TINT-AA e TINT-AS).

Atividade antioxidante

Ensaio de autografia em CCD: Para o ensaio da atividade antioxidante desenvolveu-se metodologia semelhante à proposta na literatura (Bouchet et al., 1998; Cavin et al., 1998a). para a cromatografia em camada delgada (CCD) foram utilizadas placas 20x20 de sílica-gel (Merck) eluídas em solventes apropriados aos extratos. Os cromatogramas resultantes foram então autografados com solução de β-caroteno a 0,05% (Sigma) em clorofórmio (Merck) e submetidos a radiação de 254 nm (utilizando um aparato de lâmpadas germicidas de 8 W e 16 W desenvolvido para o presente trabalho) até se observar descoloração do fundo da placa (De Siqueira, 2002).

Atividade Captora de Radicais Livres

Ensaio de autografia em CCD: Para avaliar a atividade captora de radicais livres (Aldrich) foi empregada a técnica de CCD acima descrita, utilizando solução de DPPH a 0,2% em MeOH como revelador (Cavin et al., 1988a,b). A placa, depois de revelada, foi submetida exposição a radiação de 254 nm (utilizando o aparato acima mencionado) até se observarem manchas de coloração amarela (extratos) sobre fundo púrpura (DPPH).

Ensaio espectrofotométrico: Realizou-se também um ensaio quantitativo com DPPH a 0,02% em MeOH. Para tanto, a solução de DPPH foi adicionada à solução-teste e a leitura foi realizada após 30 min em espectrofotômetro com comprimento de onda de 517 nm (Braca et al., 2002). Os extratos foram testados em seis concentrações diferentes (0,34 g/L; 0,86 g/L; 1,30 g/L; 1,70 g/L; 3,40 g/L; 34,00 g/L) e em triplicata para cada concentração.

RESULTADOS

A propriedade antioxidante de cada extratos (1 µg) foi avaliada por autografia com β-caroteno. Os extratos EAQU-AA, EAQU-AS, EMeOH-AA, EMeOH-AS, TINT-AA e TINT-AS mostraram ação protetora sobre β-caroteno, enquanto EDCM-AA e EDCM-AS não se mostraram ativos.

Para a atividade captora de radicais livres foi utilizado o radical DPPH (cor violeta, no visível), que é um radical estável, mas que, ao sofrer adição de H radical, por exemplo, a partir de substâncias doadoras (Pryor, 1986), passa a apresentar cor amarelada. Por sua estabilidade e simples manipulação e por prestar-se facilmente para detectar a reação de terminação de radical, devido à mudança de cor, o radical DPPH tem sido amplamente utilizado para estudo monitorado por autografia e quantificação do potencial de captação de radicais livres de extratos, frações e substâncias isoladas de plantas medicinais.

No monitoramento de extratos por autografia, uma solução de radical DPPH foi borrifada sobre a placa de CCD com extratos eluídos (1 µg), os quais se apresentaram ativos, como indicado pela mudança de cor prontamente detectável a olho nu (coloração amarelada, típica da reação de terminação desse radical, contra fundo púrpura, indicador de presença do radical ativo).

Pelo ensaio quantitativo, realizado por método espectrométrico, os extratos foram avaliados em seis concentrações diferentes, em triplicada, comparados a quercetina (Braca et al., 2002). Essa atividade foi determinada através da capacidade de descoloração que cada extrato apresentou sobre a solução de radical DPPH em comparação com a capacidade de descoloração da quercetina. Tal capacidade de descoloração foi determinada com o seguinte cálculo:

No qual a Abs. A é a absorvância do extrato testado com a solução de DPPH (0,02% em MeOH), Abs.BA é a absorvância do extrato em metanol e Abs.B é a absorvância do branco (0,02% de DPPH em metanol).

O modelo utilizado no presente trabalho permitiu comparar a eficiência das duas espécies vegetais quanto à inibição do radical DPPH (Desmachelier et al., 1998; Katalinic et al., 2004). No presente experimento (Figuras 1 e 2), é possível considerar que todas as preparações de droga vegetal (extratos, tinturas etc.) (Anvisa, 2004) obtidos de A. satureioides revelaram-se ligeiramente mais eficientes que os da espécie sucedânea (A. alata), principalmente na concentração mais alta. Somente os extratos aquosos, nas maiores concentrações e para ambas as espécies, é que se apresentaram semelhantes quanto à atividade inibidora de DPPH. Esta última observação é relevante, uma vez que essa forma de utilização da planta medicinal é a mais disseminada na medicina popular regional, o que poderia justificar o hábito regional de substituir a "macela" pelo "jateí-kaá" (Nunes et. al., 2003).

Nenhuma das espécies mostrou-se tão eficiente quanto a substância-padrão na inibição do radical-DPPH, o que pode ser justificado pela diversidade química de um extrato ou de qualquer outra preparação de droga vegetal em comparação a uma substância reconhecidamente ativa (Pietta, 2000). Apesar de ambas as espécies conterem flavonóides e estes, reconhecidamente, serem bons exemplos de princípios ativos antioxidantes, o padrão de substituição, o tipo de esqueleto de flavonóide presente e o teor de um extrato são variáveis que devem ser levadas em consideração.

DISCUSSÃO

Há diferentes modelos para avaliação da atividade captora de radicais e da atividade antioxidante, principalmente envolvendo reações quimicas in vitro. No presente trabalho, os modelos utilizados são ensaios químicos in vitro, de baixo custo, simples, rápidos e com boa reprodutibilidade para a pesquisa de novos compostos antioxidantes e captores de radicais livres (Ioset et al., 2001; Vicentino & Menezes, 2007; Nunes et al., 2008; Morais et al., 2009).

A participação de reações envolvendo a produção de radicais livres em diferentes processos patológicos (Gordon 1996; Cao & Li, 2004; Dasgupta et al., 2004) e na defesa do organismo (Gordon, 1996; Stosic-Grupicic et al., 2004) tem sido discutida, bem como o aumento de radicais em algumas organelas, devido a algum desequilíbrio que pode ser danoso ao sistema biológico. As metodologias acima mencionadas visam confirmar as atividades de substâncias naturais e extratos vegetais que freqüentemente não estão presentes in loco em organelas vitais de um sistema biológico (Gordon, 1996; Pietta, 2000), mas que, de outra forma, podem ser associada indiretamente à defesa dessas organelas frente a um ataque por espécies ativas de oxigênio ou por qualquer outro radical produzido durante o estresse oxidativo (Gordon, 1996; Pietta, 2000).

Apesar dessa distinção entre os tipos de substâncias encontradas in vivo e in loco (Gordon, 1996) e dos metabólitos secundários testados nos modelos in vitro, é bastante difundido o hábito de inserção na dieta alimentar de alimentos ricos em substâncias com propriedade antioxidante. De maneira semelhante a utilização preventiva de produtos medicamentosos antioxidantes é frequentemente sugerida, uma vez que diferentes substâncias naturais (Pietta, 2000) e extratos vegetais apresentam atividade captora e/ou inibidora de radicais livres e de espécies reativas de oxigênio. Nisso destacam-se as substâncias fenólicas, como por exemplo os flavonóides (Gordon, 1996; Pietta, 2000; Donatini et al., 2009), havendo evidências epidemiológicas para tal consideração (Pietta, 2000, Katalinic et al., 2004).

Essa constatação poderia justificar o uso popular de A. alata e A. satureioides em diferentes processos patológicos que envolvem processos inflamatório e infeccioso, uso este já apontado em outro estudo (Nunes et al., 2003), uma vez que a presença de diferentes tipos de flavonóides e outras substâncias fenólicas foi constatada na constituição química de ambas as espécies (Broussalis et al., 1988; 1993; Bohlmann et al., 1980). Por sua vez, o uso popular predominante de extratos aquosos, pela constatação (Figura 1) de que em suas maiores concentrações eles apresentaram, dentro do modelo utilizado, atividades semelhantes em ambas as espécies, o que corrobora o fato de serem utilizados indistintamente.

AGRADECIMENTOS

À Professora Lílian Auler Mentz, pela identificação botânica. Ao PIBIC-CNPq-UFMS, pelas bolsas de iniciação científica, e à FUNDECT-MS, pelo apoio financeiro.

Received 27 July 2007; Accepted 1 March 2009

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  24 Nov 2009
• Data do Fascículo
  Jun 2009

Histórico

• Aceito
  01 Mar 2009
• Recebido
  27 Jul 2007