Avaliação da atividade antimicrobiana de extratos de Dioclea grandiflora Mart. ex. Benth., Fabaceae

Evaluation of antibacterial activity of Dioclea grandiflora Mart. ex. Benth., Fabaceae extracts

ARTIGO

Avaliação da atividade antimicrobiana de extratos de Dioclea grandiflora Mart. ex. Benth., Fabaceae

Evaluation of antibacterial activity of Dioclea grandiflora Mart. ex. Benth., Fabaceae extracts

Luiz Lúcio Soares da Silva^*,I; Edeltrudes de Oliveira Lima^I; Silene Carneiro do Nascimento^II; Diógenes Luiz da Mota^III; Nicassio Henrique da Silva^IV; Edvaldo Rodrigues de Almeida^II; Marta Gerusa Soares da Silva^V

^ILaboratório de Tecnologia Farmacêutica "Prof. Delby Medeiros", Universidade Federal da Paraíba, 58051-970 João Pessoa-PB, Brasil

^IIDepartamento de Antibióticos, Universidade Federal de Pernambuco, Avenida Prof. Moraes Rego s/n, 50670420 Recife-PE, Brasil

^IIIDepartamento de Histologia e Embriologia, Universidade Federal de Pernambuco, Avenida Prof. Moraes Rego s/n, 50670420 Recife-PE, Brasil

^IVDepartamento de Bioquímica, Laboratório de Produtos Naturais, Universidade Federal de Pernambuco, Avenida Prof. Moraes Rego s/n, 50670420 Recife-PE, Brasil

^VDepartamento de Zootecnia, Universidade Federal Rural de Pernambuco, Dois Irmãos, 50.000 Recife-PE, Brasil

RESUMO

A espécie Dioclea grandiflora Mart. ex. Benth., Fabaceae é uma planta que pertence à família Fabaceae, popularmente conhecida como mucunã-de-caroço e olho-de-boi, e, encontra-se distribuída nas regiões da caatinga e serrado do Brasil. Os extratos aquoso, etanólico e hidroalcoólico da casca do caule, da casca da raiz e da folha de D. grandiflora, nas concentrações de 313 µg/mL a 10.000 µg/mL, foram analisados por meio de técnica de difusão em ágar, frente a vinte microrganismos representantes de bactérias Gram positivas, Gram negativas, fungos filamentosos e leveduras. O extrato aquoso da casca do caule, na concentração de 10.000 µg/mL, inibiu o crescimento de Staphylococcus aureuscom halo de 20 mm. Já o extrato hidroalcoólico da casca do caule inibiu apenas S. aureuscom halo de 18 mm, enquanto o extrato da folha inibiu o crescimento de dois dermatófitos, Trichophyton mentagrophytese Microsporum canis. Por outro lado, o extrato hidroalcoólico da casca da raiz inibiu apenas M. caniscom halo de 15 mm de diâmetro. Das frações do extrato aquoso da folha, apenas acetato de etila inibiu o crescimento de Streptococcus epidermides, Candida albicans, T. metagrophytese M. canis.Para o extrato etanólico do caule, a fração aquosa inibiu S. epidermidese S. aureus.

Unitermos: Dioclea grandiflora, Fabaceae, atividade antimicrobiana, produtos naturais.

ABSTRACT

The species Dioclea grandifloraMart. ex. Benth., Fabaceae is a plant that belongs to the Fabaceae family, popularly known as "mucunã-de-caroço" and "olho-de-boi". It can be found distributed in mountainous regions and in the scrub savanna of Brazil. The aqueous, ethanol and hydroalcoholic extracts of stem bark, root bark and leaves of D. grandifloraon concentration from 313 µg/mL to 10.000 µg/mL, were analyzed by the agar diffusion technique, front to twenty microorganisms, representatives of Gram-positive and Gram-negative bacteria, filamentous fungi and yeasts. The aqueous extract of stem bark, on concentration of 10.000 µg/mL, inhibited the growth of Staphylococcus aureuswith a 20 mm halo. Hydroalcoholic extract of stem bark only inhibited S. aureuswith a halo of 18 mm, while leaves extract inhibited the growth of two dermatophytes, Trichophyton mentagrophytes and Microsporum canis. On the other hand, hydroalcoholic extract of root bark only inhibited M. caniswith a halo of 15 mm diameter. From the fractions of aqueous extract of leaves, only ethyl acetate inhibited the growth of Streptococcus epidermides, Candida albicans, T. mentagrophytese M. canis. For the ethanol extract of stem bark, the aqueous fraction inhibited S. epidermides and S. aureus.

Keywords: Dioclea grandiflora, Fabaceae, antimicrobial activity, natural products.

INTRODUÇÃO

A utilização das plantas com atividades terapêuticas é uma das práticas mais antigas empregadas, pelo homem, para cura das suas enfermidades. Grande parte das informações advém do conhecimento popular, quanto ao uso das plantas e seus possíveis efeitos curativos. (Funke & Melzing, 2006; Biavatti et al., 2007; Oliveira et al., 2007 ; Agra et al., 2007). A Organização Mundial de Saúde (OMS) estima que 80% da população do mundo utilizam plantas medicinais como principal recurso no atendimento básico de saúde, e vem incentivando tal prática (Elizabetsky, 1993; WHO, 2002).

A planta Dioclea grandiflora Mart. ex. Benth é uma planta pertencente à família Fabaceae. É conhecida popularmente como mucunã, mucunã-de-caroço e olho-de-boi, e encontra-se distribuída nas regiões de Caatinga e do cerrado do nordeste brasileiro. Suas sementes e raízes são também utilizadas pela população em formas de infusos nos distúrbios renais e prostáticos (Agra,1996 ). Desta planta foi isolado e identificado diocleína, que induziu um efeito analgésico em roedores (Batista, 1993). Mattei e colaboradores (1995) examinaram a ação farmacológica central das sementes da Dioclea grandiflorae detectaram uma possível atividade ansiolítica. Posteriormente, Bhattacharyya e colaboradores (1997) isolaram e identificaram o dioclenol da casca da raiz dessa planta. Jenkins e colaboradores (1999) isolaram e identificaram o agradol, paraibanol e o diosalol, também da casca da raiz de Dioclea grandiflora.Ainda foi detectado um potencial vaso relaxante no endotélio da aorta de ratos, a partir da diocleína (Lemos et al, 1999). A atividade farmacológica do dioclenol e da dioflorina foi demonstrada por Almeida e colaboradores (2000) em modelos experimentais de analgesia. Almeida e colaboradores (2003) demonstraram o efeito antinoceptivo central do extrato hidroalcoólico das sementes de Dioclea grandiflorasobre roedores. O presente trabalho tem como objetivo analisar a atividade antimicrobiana dos extratos e frações obtidas da casca do caule de Dioclea grandiflora frente a microorganismos patogênicos (fungos e bactérias).

MATERIAL E MÉTODOS

Material vegetal

Folha, casca do caule e da raiz de Dioclea grandifloraMart. ex. Benth., Fabaceae, foram coletadas no município de Santa Rita no Estado da Paraíba, no mês de junho de 2001. O material botânico foi identificado pela Professora Drª. Maria de Fátima Agra, do Laboratório de Tecnologia Farmacêutica do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal da Paraíba e sua exsicata encontra-se depositada no Herbário Lauro Pires Xavier (PPB), sob o código 444-JPB, MO.

Preparação de extratos para o ensaio microbiológico

Para extração aquosa da casca do caule, da casca da raiz e da folha, foram utilizados 100 g de cada material, previamente seco e pulverizado, individualizado, adicionado água destilada e submetido à agitação mecânica por 1 h e, em seguida, deixado em repouso por 24 h. Após o período da extração, cada extrato foi filtrado, submetido à liofilização e acondicionado no freezer, até o momento dos testes de atividade antimicrobiana. Na obtenção dos extratos hidroalcoólicos, 100 g do material seco e pulverizado foi colocado em Becker, separadamente, adicionado uma mistura hidroalcoólica (1:1) e colocado em banho-maria durante 1 h a 80 ºC sob agitação. Em seguida, os extratos foram concentrados sob pressão reduzida, em evaporador rotatório (40 ^oC), e posteriormente submetido à liofilização.Os extratos brutos alcoólicos da folha, casca do caule e casca da raiz foram obtidos, a partir de 100 g de cada material seco e pulverizado. Cada material foi colocado em extrator Soxhlet e extraído com etanol 95%, por esgotamento, em uma temperatura de 81 ºC, por um período de 72 h. Após esta etapa, os extratos foram concentrados sob pressão reduzida em evaporador rotatório (40 ºC).

Cromatografia em coluna

Cerca de 3 g do extrato etanólico da casca do caule e cerca de 3 g do extrato aquoso da folha foram submetidos a cromatografia de coluna de sílica gel 70-230 mesh 250 g (6x45 cm). Após sedimentação da sílica, 3 g do extrato etanólico da casca do caule, dissolvido na mistura de acetato de etila e metanol (1:1 v/v), foi colocado no topo da coluna, seguindo-se a uma eluição utilizando-se um gradiente crescente de polaridade: acetato de etila, acetato de etila e metanol (1:1 v/v), metanol e água. Da mesma forma, realizaram-se os mesmos procedimentos para o extrato aquoso da folha. As frações de cada eluição foram submetidas a testes de atividade antimicrobiana.

Microrganismos e meios

Os microrganismos selecionados para o estudo foram representantes dos grupos de bactérias Gram-positivas (Staphylococcus aureusATCC-6538; Streptococcus epidermidisATCC-12228), Gram-negativas (Escherichia coliLM-209; Psudomonas aeruginosa LM-36), fungos filamentosos (Trichophyton rubrum LM-05; Trichophyton rubrumLM-09; Trichophyton mentagrophytes LM-06; Microsporum canisLM-819; Aspergillus flavusLM-27; Aspergillus parasiticusLM-130; Penicillumsp. LM-131; Fusarium sp. LM-135; Geotrichum candidumLM-23) e leveduriformes (Candida albicansATCC-76615; Candida albicansLM-17; Candida tropicalesLM-25; Candida guilliermondii LM-16; Candida kruseiLM-07 Cryptococcus neoformansLM-214; Trchosporon inkinLM-267). Esses microorganismos foram oriundos de coleção de material clinico e de meio ambiente, e se encontram catalogados no Laboratório de Micologia do Departamento de Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal da Paraíba. Para realização dos ensaios microbiológicos in vitro pelo método de difusão em meio sólido, foram usados Agar Muller-Hinton (Merck) e Agar Sabouraud dextrose a 2%-ASD, respectivamente, para bactérias e fungos.

Ensaios de atividade antimicrobiana

Preparação do inoculo

O inóculo foi preparado, partindo-se de culturas recentes das cepas bacterianas e fúngicas, mantidas, respectivamente, em agar Muller-Hinton e agar Sabouraud dextrose. As culturas bacterianas e de fungos leveduriformes, foram mantidas a 37 ºC, durante 24-48 h; as de fungos filamentosos a temperatura ambiente (28-30 ºC) durante dez dias. O inóculo foi preparado em solução salina 0,85% esterilizada, contendo 1% de Tween 80. A suspensão foi padronizada pelo tubo 0,5 da escala Mc Farland e ajustada para 90% em espectrofotômetro, para contar aproximadamente 10⁶ células/mL.

Ensaio realizado pelo método de difusão em meio sólido

Por essa metodologia, foi feita a avaliação da atividade antimicrobiana dos extratos de D. grandiflora frente a bactérias e fungos, incluindo o screeningmicrobiológico e a determinação da concentração inibitória mínima (CIM). Em placas de Petri 10x90 mm, esterilizadas, foi colocado 1 mL da suspensão de cada microrganismo. Em seguida, 21 mL de agar Muller-Hinton e agar Sabouraud dextrose, previamente fundidos, mantidos a 50 ºC, foram adicionados em cada placa. Após solidificação, foram feitas cavidades de 6x8 mm de diâmetro, onde foi inoculado 50 µL dos extratos em suas variadas concentrações.

Foram feitos controles, para cada microrganismo teste e com antimicrobiano padrão: cloranfenicol (30 µg) para bactérias e cetoconazol (50 µg) para fungos. O ensaio foi incubado a 37 ºC por 24-48 h para bactérias e fungos leveduriformes; a temperatura ambiente por 10 a 14 dias, para fungos filamentosos. Cada ensaio foi feito em duplicata e após, o período de incubação, procedeu-se à leitura e interpretação dos resultados, através de formação ou não dos halos de inibição. Foram considerados ativos, os extratos que produziram halos de inibição igual ou superior a 10 mm diâmetro, contra os microrganismos usados nos ensaios microbiológicos.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

As plantas continuam a representarem uma rica fonte de drogas com diferentes princípios de atividade farmacológica, utilizada na medicina popular e, posteriormente suas ações comprovadas em teste de laboratório. A presença de substâncias antimicrobianas nos vegetais não é um fato recente. As plantas possuem várias vias metabólicas secundárias que dão origem a compostos, incluindo alcalóides, flavanóides, isoflavonóides, taninos, cumarinas, glicosídeos, terpenos, poliacetilenos que, por vezes, são específicos a determinadas famílias, gêneros ou espécies cujas funções, até pouco tempo eram desconhecidas (Agra & Barbosa, 1990; Barbosa et al., 1987; Farnswort, 1966). Esses metabólitos produzidos pelas plantas estão relacionados ao mecanismo de defesa da planta, em resposta ao ataque de predadores como fungos, bactérias, vírus, parasitas, insetos, moluscos ou animais superiores.

Os extratos de D. grandifloraapresentaram atividade diversificada frente às bactérias e aos fungos. Assim, o extrato aquoso do caule inibiu, apenas, o crescimento de S. aureus(Tabela 1), enquanto que, as demais espécies foram todas resistentes ao citado produto. Comportamento similar foi observado e registrado, quanto aos resultados obtidos da avaliação da atividade antibacteriana e antifúngica do extrato etanólico da folha, caule e raiz. Não houve interferência sobre o crescimento de nenhuma das cepas testadas. Por outro lado, o extrato hidroalcoólico frente às espécies bacterianas e fúngicas, foram bem mais promissores. Os extratos hidroalcoólicos da folha, caule e raiz inibiram T. mentagrophytes, M. canise S. aureus, produzindo halos de inibição entre 12 e 18 mm de diâmetro (Tabela 2).

Na Tabela 3 encontram-se os resultados da CIM do extrato aquoso do caule e hidroalcoólico do caule, raiz e folha. O micorganismo S. aureusfoi sensível ao extrato aquoso e hidroalcoólico do caule de D. grandiflora, até a concentração de 2.500 µg/mL, com respectivos halos de inibição de 12 e 20 mm de diâmetro. As espécies fúngicas C. albicans, T. metagrophytese M. canisforam sensíveis ao extrato hidroalcoólico da raiz e folha, onde a CIM ficou registrada entre 2.500 e 10.000 ug/mL. Vale ressaltar que os produtos testados não exerceram nenhuma atividade sobre as bactérias Gram negativas P. aeruginosae E. coli, outras espécies de Candida, C. krusei, C. tropicalise C. guilliermondii, os gêneros Trichosporone Cryptococcus, como também, sobre os contaminantes Aspergillus,Penicillium, Geotrichume Fusarium.Na Tabela 4, estão ponderados os valores dos resultados acerca da avaliação da atividade antimicrobiana das frações obtidas do extrato aquoso da folha de D. grandiflora.Apenas a fração acetato de etila a 3.000 µg/mL, produziu inibição sobre o crescimento de S. epidermidis, C. albicans(LM-17), T. mentagrophytese M. canis, cujos halos de inibição foram entre 10 a 20 mm de diâmetro (Figura 1). As frações do extrato etanólico (Tabela 5), apresentaram pouca atividade biológica sobre os microrganismos usados nos ensaios microbiológicos. Somente a fração aquosa, 3.000 µg/mL, inibiu o crescimento de S. aureus e S. epidermides, produzindo halos de inibição de 10 mm de diâmetro. Na tabela 6, estão notificados os resultados da avaliação da CIM da fração acetato de etila da folha de D. grandiflora. A CIM da fração acetato de etila, que inibiu o crescimento de S. epidermides, C. albicans (LM-17) e T. metagrophytes foram, respectivamente, 1.500, 3.000 e 750 µg/mL.

As bactérias Gram negativas P. aeruginosae E. coli, e as espécies de leveduras do gênero Candida, Cryptococcus e Trichosporon, bem como fungos contaminantes não apresentaram sensibilidade às frações dos extratos aquoso e etanólico de Dioclea grandiflora.

As dermatofitoses, cujos agentes etiológicos pertencem aos gêneros Trichophyton, Microsporum e Epidermophyton,constituem um dos grupos de doenças mais importantes dentro da prática dermatológica, e tem causado grandes problemas de saúde pública (Lima, 1996). Neste estudo, T. mentagrophytese M. canis foram os mais susceptíveis, frente ao extrato hidroalcoólico do caule.

Embora os resultados obtidos sejam importantes para o conhecimento farmacológico dessa espécie, é prudente termos cautela no uso dessa planta, e se faz necessário um aprofundamento no conhecimento de seus constituintes, para um uso seguro eficaz.

AGRADECIMENTOS

Ao Laboratório de Tecnologia Farmacêutica da Universidade Federal da Paraíba, na pessoa da Dra. Maria de Fátima Agra, pelo suporte no deslocamento e orientação para coleta do material botânico e ao PICDT/UFPE.

Received 13 October 2008; Accepted 17 December 2008

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  11 Jun 2010
• Data do Fascículo
  Maio 2010

Histórico

• Aceito
  17 Dez 2008
• Recebido
  13 Out 2008