Efeitos das cardioplegias sangüínea e cristalóide no miocárdio hipertrófico de coelho: avaliação estrutural e ultra-estrutural

Resumos

OBJECTIVE: To experimentally compare the structural and ultrastructural changes in isolated hypertrophied rabbits' hearts submitted to cardiac arrest protected using sanguineous and crystalloid cardioplegia solutions. METHOD: The study comprised two experimental groups and one control group. In Experimental Group I, cardiac arrest was achieved by the continuous infusion of tepid sanguineous cardioplegia solution. In Experimental Group II, cardiac arrest was obtained by an intermittent infusion of a cold crystalloid cardioplegia solution. In the Control Group the hearts were submitted to normothermic anoxic arrest for 45 minutes. After the procedures, eight samples of the left ventricle lateral wall were collected and fixed in 10% formaldehyde and 2.5% glutaraldehyde for structural and ultrastructural analysis. RESULTS: The structural and ultrastructural results demonstrated that the hearts submitted to cardiac arrest protected by continuous tepid sanguineous cardioplegia, Group I, were better preserved and with less accentuated cellular alterations compared to those submitted to cardiac arrest protected using intermittent cold crystalloid cardioplegia and the Control Group. CONCLUSION: Continuous tepid sanguineous cardioplegia was more efficient in the preservation of the structural and ultrastructural integrity of the myocardium when compared to intermittent cold crystalloid cardioplegia.

Cardioplegic solutions; Hypertrophy; Cardiac surgical procedures

ARTIGO ORIGINAL

Efeitos das cardioplegias sangüínea e cristalóide no miocárdio hipertrófico de coelho: avaliação estrutural e ultra-estrutural

Elthon Silveira Cressoni^I; Luiz Ernesto Avanci^II; Domingo Marcolino Braile^III; Ana Paula Marques Lima-Oliveira^IV; Sebastião Roberto Taboga^V; Antonio Sérgio Martins^II; Rosa Sayoko Kawasaki Oyama^IV; Marcos Aurélio Barbosa de Oliveira^II

^IMédico Veterinário. Mestre em cardiologia Faculdade de Medicina Unesp Campus de Botucatu. Cardiopesquisador Braile Biomédica

^IIMédico. Cirurgião Cardiovascular

^IIICirurgião Cardiovascular. Diretor-adjunto de pós-gradução da Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto (FAMERP)

^IVDoutorado em Genética. Braile Biomédica

^VDoutorado em Biologia

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

OBJETIVO: Comparar e avaliar experimentalmente as alterações estruturais e ultra-estruturais em corações hipertrofiados isolados de coelhos submetidos à parada protegida pela solução de cardioplegia sangüínea e cardioplegia cristalóide.

MÉTODO: O estudo compreendeu um grupo controle e dois grupos experimentais. No grupo I, a parada cardíaca foi obtida pela infusão da solução de cardioplegia sangüínea contínua e tépida. No grupo II, a parada cardíaca foi conseguida pela infusão da solução de cardioplegia cristalóide intermitente e fria. No grupo controle, os corações foram submetidos à parada anóxia normotérmica por 45 minutos. Após experimentos, oito amostras da parede lateral do ventrículo esquerdo foram coletadas e fixadas em formaldeído 10% e glutaraldeído 2,5% para análises estrutural e ultra-estrutural.

RESULTADOS: Os resultados estruturais e as descrições ultra-estruturais mostraram que os corações submetidos à parada protegida pela cardioplegia sangüínea contínua e tépida (grupo I) estavam mais preservados com alterações celulares menos acentuadas se comparados aos submetidos à parada protegida pela cardioplegia cristalóide intermitente e fria (grupo II) e ao grupo controle.

CONCLUSÃO: A cardioplegia sangüínea contínua e tépida (Grupo I) foi mais eficiente na preservação da integridade estrutural e ultra-estrutural do miocárdio, quando comparada à cardioplegia cristalóide intermitente e fria (Grupo II).

Descritores: Soluções cardioplégicas, farmacologia. Hipertrofia. Procedimentos cirúrgicos cardíacos.

INTRODUÇÃO

A hipertensão é a maior causa da hipertrofia ventricular esquerda [1], acometendo cerca de um terço da população hipertensa [2], levando não só à isquemia miocárdica, mas, também, à insuficiência cardíaca congestiva e, indiretamente, ao acidente vascular encefálico [3]. É um fator de risco independente para eventos cardiovasculares e de mortalidade por todas as causas [1,2,4].

Com a hipertrofia miocárdica, o coração passa a necessitar de mais energia para manter suas estruturas íntegras, mesmo estando parado. Assim sendo, uma proteção miocárdica eficaz é mandatória para a manutenção da morfologia dos constituintes celulares [5,6].

A utilização das soluções cardioplégicas para proteção do miocárdio contra o dano isquêmico durante cirurgia cardíaca com circulação extracorpórea iniciou-se em 1955, com a solução desenvolvida por Melrose. No entanto, esta causava necrose celular devido à alta concentração de potássio [7]. A partir desta idéia, surgiram novas técnicas de proteção do miocárdio como o pinçamento intermitente [8], cardioplegia cristalóide [9] e sangüínea [9-14], podendo ser quente, normotérmica, fria ou tépida. Quanto à forma de administração, pode ser contínua ou intermitente e ainda quanto à via, anterógrada ou retrógrada. A riqueza de trabalhos recentes nessa área nos mostra que o assunto ainda está em evolução, como é o caso da cardioplegia por polarização de membrana com tetradotoxina, esmolol, entre outros [15].

Nesse contexto, o presente trabalho tem o objetivo de avaliar as alterações estruturais e ultra-estruturais ocorridas após o uso de soluções cardioplégicas sangüínea e cristalóide no miocárdio hipertrófico de coelho.

MÉTODO

Foram utilizados nove coelhos da raça Norfolk-2000, variante Botucatu, sem restrição ao sexo, com pesos variando entre 1850 e 2350 gramas, fornecidos pelo biotério do campus de Botucatu - UNESP, após aprovação pela Comissão de Ética em Pesquisa Animal da Faculdade de Medicina de Botucatu-UNESP.

Condicionamento da hipertrofia miocárdica

Após anestesia geral do animal com Pentobarbital sódico, realizou-se incisão transversal na região cervical, logo acima do esterno. Identificado o arco aórtico, fez-se pericardiotomia e isolamento da aorta ascendente, onde foi provocada coarctação, como descrito por Martins et al. [16]. Após 5 semanas, com os corações já hipertrofiados (Figura 1), os animais foram eutanasiados e separados nos grupos de estudo.

Divisão dos grupos

Os corações hipertróficos foram retirados dos coelhos juntamente com seus pulmões e imediatamente colocados individualmente em um sistema composto por um coelho suporte (um por coração), que fornecia o sangue na raiz da aorta (Figura 2) para perfusão coronariana, por um tempo de 20 minutos, para estabilização do coração. Após esse período, os animais foram divididos em três grupos:

• Grupo experimental I (grupo I): três corações hipertróficos, submetidos à proteção miocárdica, com solução de cardioplegia sangüínea contínua e tépida, por 45 minutos, sendo utilizada inicialmente a solução "mãe" de indução (Tabela 1) para a parada cardíaca, por um período médio de 1 minuto (1 mL/min), seguido pela solução de manutenção (Tabela 2) também a 1 mL/min de solução total pelo tempo remanescente;

• Grupo experimental II (grupo II): três corações hipertróficos, submetidos à proteção miocárdica, com solução de cardioplegia cristalóide intermitente e fria (Tabela 3). Foram padronizados os tempos 0, 20 e 40 minutos, cada um com infusão dessa solução por 2 minutos. A parada cardíaca foi alcançada com um tempo médio de 1 minuto após o início do tempo 0.

• Grupo controle: três corações hipertróficos, submetidos à parada anóxica, sem proteção miocárdica, pelo período de 45 minutos.

Após a parada com e sem proteção, todos os corações passaram por um período de 20 minutos de reperfusão no mesmo sistema utilizado na estabilização. Em seguida, os corações foram removidos do sistema e a parede lateral do ventrículo esquerdo foi cortada em fragmentos de cerca de 4x4 mm, fixados em formaldeído a 10%, para análise estrutural e, em glutaraldeído a 2,5%, pH 7,4, para análise ultra-estrutural.

RESULTADOS

Avaliação estrutural

Os resultados da avaliação estrutural dos fragmentos de coração, pertencentes aos grupos experimentais I e II e grupo controle, estão apresentados nas Figuras 3 1A-D, 2A-D e 3 3A-D, respectivamente. A técnica de coloração com hematoxilina-eosina evidenciou, nos grupos experimentais, estruturas celulares mais preservadas, quando comparado ao grupo controle. No grupo experimental I, foram observadas fibras musculares preservadas, núcleos íntegros e corpúsculo nuclear bem evidente, como mostrado nas Figuras 3 1A-D. No grupo experimental II, foram identificados fibroblastos (Figura 3 2A-C), leucócitos (Figura 3 2D), fibras musculares com leve degeneração e núcleo bem conservado, como mostrado na Figura 3 2A-D. Nesses grupos, também foram observados graus variados de preservação do tecido cardíaco, com suspeita de processo inflamatório e áreas discretas de degeneração miocárdica (Figuras 3 1A-D e 3 2A-D). No entanto, essa preservação foi maior no grupo I (Figura 3 1A-D) do que no grupo (Figura 3 2A-D), como demonstrado no Quadro I.

No grupo controle, foi observado graus variados de degeneração do tecido muscular cardíaco, com miofibrilas apresentando perda do padrão de estriação, presença intensa de fibroblastos, leucócitos e núcleos degenerados, como mostrado na Figura 3 3A-D.

Avaliação ultra-estrutural

A análise ultra-estrutural do grupo controle evidenciou fibras musculares cardíacas com sinais de degeneração citoplasmática (Figura 4A), marginalização do disco intercalar com retração celular (Figura 4B), compactação periférica da cromatina e pregueamento nuclear (Figura 4C). Os vasos sangüíneos apresentavam-se dilatados, com as paredes extremamente finas e poucas vesículas de pinocitose (Figura 4D).

Os grupos experimentais I e II apresentaram alterações ultra-estruturais distintas.

No grupo experimental II (Figura 5A-D), as células musculares apresentavam características ultra-estruturais semelhantes às do grupo experimental I, porém, não foi observado acúmulos de lipídeos, glicogênio e túbulos T dilatados. No entanto, foram identificadas pequenas áreas de necrose (Figura 5A). Os núcleos encontravam-se bem preservados, com nucléolo evidente (Figura 5A-D), assim como os discos intercalares (Figura 5C). Os vasos sangüíneos apresentavam-se dilatados, com paredes mais espessas e ricas em vesículas de pinocitose (Figura 5D).

No grupo experimental I (Figura 6A-F), as células mostraram preservações ultra-estruturais marcantes, com fibras musculares cardíacas apresentando graus variados de preservação, núcleos com descondensação cromatínica (Figura 6A) e acúmulo de lipídeos no citoplasma do miócito (Figura 6B). Foi observada grande concentração de glicogênio ao redor das mitocôndrias, que apresentavam cristas bem evidentes (Figura 6C). Os discos intercalares apresentavam-se bem preservados (Figura 6D), núcleos das células musculares cardíacas com formato regular, aumento da área nucleolar e túbulos T ligeiramente dilatados (Figura 6E). O vaso sangüíneo apresentava endotélio vascular preservado, com vasta quantidade de vesículas de pinocitose (Figura 6F).

DISCUSSÃO

Os corações hipertróficos de ratos submetidos à parada protegida pela cardioplegia sangüínea contínua e tépida (grupo I) tiveram suas características morfológicas, estruturais e ultra-estruturais, mais preservadas quando comparados àqueles submetidos à parada protegida pela cardioplegia cristalóide intermitente e fria (grupo II) e ao grupo controle. Tanto as células musculares cardíacas quanto as células de tecidos adjacentes, fibroblastos e células endoteliais, mantiveram um padrão morfológico próximo do normal. A ausência de edema, presença de mitocôndrias eletrodensas ricas em cristas descondensadas, núcleos com heterocromatina associada ao envoltório nuclear, nucléolo proeminente, acúmulo de lipídeos e glicogênio, evidenciaram a ação protetora. Os fibroblastos e as células endoteliais também apresentaram integridade celular. A baixa concentração de potássio associada ao magnésio, presente na cardioplegia sangüínea (grupo I), permitiu a parada dos batimentos cardíacos e a economia de energia durante o período de indução. Além disso, com a perfusão contínua de oxigênio oferecido pelo sangue do coelho doador a 37°C, evitou-se a isquemia e o período de pinçamento aórtico pôde ser entendido como um período de manutenção das reservas cardíacas do que um período de dano isquêmico [13].

A proteção do miocárdio com solução de cardioplegia sangüínea contínua e tépida, descrita por Braile, demonstrou ser capaz de reduzir o dano isquêmico e funcional, tanto pela pequena elevação das troponinas séricas, como pela menor elevação do lactato e melhor preservação funcional, uma vez que esta oferece boa proteção ao miocárdio com manutenção do metabolismo básico, pois fornece de forma contínua os substratos que mantêm em funcionamento toda "maquinaria oxidativa". A adição de glutamato e aspartato repõe déficits de energia, levando à recuperação anatômica e funcional do miocárdio, que de outra forma estaria condenado ao dano irreversível e à necrose. A introdução da cardioplegia sangüínea demonstrou que o miocárdio, mesmo parado e hipotérmico, mantém atividade celular e, portanto, consumo de energia. Além disso, suas necessidades puderam ser melhor atendidas com a oferta de oxigênio durante a administração das soluções, sendo que dentre todas elas, o sangue do perfusato é o veículo mais adequado à infusão dos agentes cardioplégicos. O perfusato com sangue cede oxigênio aos tecidos, transporta o dióxido de carbono, possui sistemas tampão naturais nas concentrações desejáveis para manutenção do pH ideal, pressões colóido-osmóticas adequadas, concentração ideais dos diversos íons importantes para a função celular, substratos nutritivos e removedores naturais de radicais livres nocivos [17].

Os lipídeos armazenados nos cardiomiócitos são principalmente triglicerídeos, isto é, ésteres de ácidos graxos e glicerol, comuns em células que dependem da degradação de ácidos graxos para o seu suprimento de energia. O metabolismo oxidativo nas mitocôndrias é alimentado não só pelo piruvato produzido a partir da glicólise de açúcares no citosol, mas também, a partir de ácidos graxos. O piruvato e os ácidos graxos são seletivamente transportados do citosol para a matriz mitocondrial, onde são quebrados em grupamentos acetílicos produzindo a acetil-coenzima A. Esta, por sua vez, é degradada no ciclo do ácido cítrico, originando elétrons de alta energia que entrarão na cadeia respiratória, sempre dependente da presença de oxigênio [18]. A análise isolada de glicogênio demonstrou que o grupo I apresentou maior quantidade, o que pode ser traduzido em melhor proteção miocárdica.

No instante em que a aorta é pinçada, o metabolismo cardíaco torna-se anaeróbio, com utilização de glicogênio e glicose estocados para a produção de energia. Nos miócitos, o glicogênio celular é consumido em um período de 20 a 30 minutos de anóxia [19]. Neste estudo, o período de parada anóxica foi de 45 minutos e as reservas de glicogênio das células dos grupos II e grupo controle foram esgotadas. Já a do grupo I foi preservada, devido ao contínuo fornecimento de oxigênio e substratos oferecidos por este método de proteção miocárdica.

No grupo II, o potássio e o magnésio da solução de cardioplegia cristalóide intermitente fria funcionaram como agentes indutores da parada diastólica: o sódio mantém a solução ligeiramente hipertônica em relação ao líquido intersticial pelo ajuste da osmolaridade, com o intuito de evitar edema miocárdico; o bicarbonato de sódio ajusta o pH aos níveis aceitos para a hipotermia. O objetivo principal, nesses casos, é induzir parada rápida do coração, sem exaustão das reservas de ATP. A hipotermia é o fator mais importante na proteção do miocárdio. A cardioplegia hipotérmica atenua os efeitos da isquemia sobre o miocárdio e previne a perda de fosfatos de alta energia, durante o período de pinçamento aórtico. Contudo, em determinadas circunstâncias, como nos casos de hipertrofia ventricular, insuficiência cardíaca grave, isquemia miocárdica importante e choque cardiogênico, o miocárdio pode apresentar um importante déficit metabólico com menor produção dos fosfatos de alta energia [20]. O frio, que por um lado diminui o consumo de energia do coração, por outro diminui a sua produção, impedindo o funcionamento da bomba de cálcio, elevando sua concentração no citosol, que aumenta a tensão das paredes ventriculares, levando ao aumento do consumo de energia. O coração batendo em hipotermia gasta mais energia do que em normotermia. Além da bomba de cálcio, outras bombas e sistemas enzimáticos e de tampões também ficam bloqueados pelo frio [21].

A conservação da integridade dos nucléolos, nas duas situações experimentais, pode ser explicada pelo fato deles possuírem a maquinaria necessária para a síntese dos ribossomos. Durante a proliferação e regeneração celular, muitos ribossomos são requeridos para sintetizar as massas protéicas para a expansão citoplasmática. Dessa forma, durante a reação das células à injúria, os ribossomos produzem enzimas de defesa e de reparo para a sobrevivência celular [22,23]. Portanto, a presença marcante dos nucléolos em todas as células analisadas do grupo I e do grupo II deve-se à ativação dos mecanismos metabólicos nucleolares que levam à proteção celular.

No grupo controle, as alterações morfológicas decorrentes da parada anóxica indicaram oncose parcial do miocárdio. Nas isquemias totais, a oncose tecidual pode ser extensa, sendo as células vistas ao microscópio de luz, coradas pela hematoxilina-eosina, como uma massa vermelha, com intensa acidofilia, devido à perda dos ácidos nucléicos citoplasmáticos, com ou sem o núcleo. A despeito da oncose parcial, a função mecânica do coração pôde ser recuperada devido à presença de células que não apresentaram injúria reversível. As células que sofreram injúria em menor grau tiveram a capacidade de sobreviver às mudanças em sua estrutura e função, adaptando-se ou neutralizando o estresse fisiológico ao qual foram submetidas.

A isquemia ocasiona a vacuolização das mitocôndrias e o rompimento dos lisossomos, o que provoca o extravasamento de suas enzimas para o citoplasma. As enzimas, por sua vez, digerem os componentes celulares, tornando o pH neutro ou alcalino. Finalmente, a célula morta pode ser substituída sob a forma de figuras mielínicas [24].

Existe uma relação direta entre a duração da isquemia e a redução do ATP miocárdico. A quantidade de ATP ao final do período de isquemia também tem relação direta com o grau de recuperação funcional do miocárdio. Lima-Oliveira et al. [13] demonstraram, experimentalmente, que a cardioplegia sangüínea de baixo volume foi eficaz na preservação das células do miocárdio, fibroblastos e células endoteliais.

A reperfusão é uma fase crítica para o miocárdio, uma vez que o coração deverá recuperar os déficits e produzir trabalho eletromecânico com grande consumo de energia, justamente na fase em que mais necessita dela [25,26]. A isquemia prolongada dificulta o processo de reperfusão, devido ao empilhamento de células sangüíneas vermelhas em capilares estreitados por edema endotelial, ou seja, pelo tampão (plugging) dos leucócitos. Estes liberam enzimas proteolíticas e radicais livres, aumentando a permeabilidade capilar e o edema intersticial. Portanto, os leucócitos são importantes mediadores na reoxigenação e também atuam nas lesões de isquemia e reperfusão [27]. Os resultados estruturais do grupo controle e do grupo II demonstraram maior concentração de leucócitos, quantia essa facilmente explicada pela ausência de oxigênio nos seus métodos de proteção. Já o grupo I apresentou menor concentração leucocitária, devido ao fato de sua proteção miocárdica oferecer continuamente oxigênio e substratos, minimizando, desta forma, as injúrias desse mediador na reoxigenação.

De acordo com o método de proteção miocárdica ou as condições do miocárdio, podem ocorrer lesões abaixo do limite de detecção ou, ainda, lesões reversíveis após a reperfusão ou mesmo causadas por ela, com dano miocárdico permanente. Devem ser considerados como especiais os corações que têm grandes déficits de energia, assim como os isquêmicos, hipertróficos, dilatados, cianóticos e imaturos [28].

Embora a reperfusão seja considerada a fase crítica para o miocárdio, uma vez que o coração deverá recuperar os déficits e produzir trabalho eletromecânico com grande consumo de energia, nossos resultados demonstraram que, se a técnica de proteção miocárdica for adequada e atender às necessidades metabólicas do tecido, é possível eliminar os danos às fibras musculares. A adição dos aminoácidos glutamato e aspartato na solução cardioplégica permitiu a melhora da eficiência metabólica do miocárdio, repondo déficits de energia, levando à recuperação anatômica e funcional do músculo cardíaco, que de outra forma estaria condenado ao dano irreversível e à oncose.

Utilizando-se a cardioplegia sangüínea contínua e tépida não ocorre o fenômeno de isquemia ou falta de substratos e oxigênio. Dessa forma, minimiza-se o fenômeno de reperfusão, com suas graves conseqüências.

CONCLUSÕES

A cardioplegia sangüínea contínua e tépida (grupo I) mostrou-se mais eficaz na preservação da integridade estrutural e ultra-estrutural do miocárdio de coração isolado hipertrófico de coelho, quando comparada à cardioplegia cristalóide intermitente e fria (grupo II).

Artigo recebido em 18 de maio de 2006

Artigo aprovado em 26 de fevereiro de 2007

Trabalho realizado na Faculdade de Medicina da Universidade Estadual Paulista, Botucatu, SP.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  11 Set 2007
• Data do Fascículo
  Mar 2007

Histórico

• Aceito
  26 Fev 2007
• Recebido
  18 Maio 2006