Acompanhamento de um modelo de indução de cirrose em ratos mediante vídeolaparoscopia

Accompanying of a cirrhosis induction model in rat through the videolaparoscopy

ACOMPANHAMENTO DE UM MODELO DE INDUÇÃO DE CIRROSE EM RATOS MEDIANTE VÍDEOLAPAROSCOPIA¹

Enelruy Ávila Farias²

Paulo Roberto Ott Fontes³

Cláudia Ramos Rhoden⁴

Márcio Luís Lucas⁵

Márcio Luís Migliavacca Leal⁵

Marcelo Sabedotti⁵

Ernani Luis Rhoden⁶

Farias EA, Fontes PRO, Rhoden CR, Lucas ML, Leal MLM, Sabedotti M, Rhoden EL. Acompanhamento de um modelo de indução de cirrose em ratos mediante vídeolaparoscopia. Acta Cir Bras [serial online] 2000 Jul-Sept;15(3). Available from: URL: http://www.scielo.br/acb.

RESUMO: Os autores apresentam um modelo de vídeolaparoscopia experimental para avaliar a hepatotoxicidade induzida pelo tetracloreto de carbono (CCl₄) em ratos. Nódulos sobre a superfície hepática e aumento significativo das provas de função hepatobiliar (alanina aminotransferase, aspartato aminotransferase, fosfatase alcalina e g - glutamiltranspeptidase) foram observados nos ratos tratados com CCl₄. Além disso, cirrose hepática foi diagnosticada por estudo histopatológico em todos os ratos submetidos à administração de CC1₄. Desta maneira, a vídeolaparoscopia experimental em ratos parece ser um método diagnóstico excelente que merece mais investigação para explorar as conseqüências fisiológicas da cirurgia laparoscópica.

DESCRITORES: Laparoscopia. Cirrose hepática. Tetracloreto de carbono. Ratos.

INTRODUÇÃO

Com o advento da vídeolaparoscopia, temos à disposição um procedirnento que tem revolucionado a técnica operatória nestas últimas duas décadas. A cirurgia laparoscópica possibilita mínima invasão na cavidade abdominal, reduzindo a dor pós-operatória, o tempo de permanência hospitalar, bem como pode apressar o retorno das atividades habituais do paciente. Em vista disso, torna-se necessária a realização de estudos experimentais que visem o treinamento e aperfeiçoamento da técnica laparoscópica, possibilitando, também, um melhor entendimento das alterações fisiopatológicas decorrentes do procedimento. Até o momento, animais de grande e médio porte, tais como o cão e o porco, são utilizados na maioria dos modelos animais que empregam a videolaparoscopia. Apesar de possuírem anatomia visceral familiar aos cirugiões e permitirem o uso de instrumental cirúrgico de tamanho padronizado, esses animais são de difícil obtenção e manuseio, possuindo, também, um custo elevado. Assim, animais de pequeno porte seriam úteis no esclarecimento dos detalhes fisiológicos da cirurgia laparoscópica, em vista da maior facilidade de manipulação deste tipo de animal no laboratório.

O objetivo do estudo é otimizar o método da videolaparoscopia na cirurgia experimental, disponibilizando tal método no intuito de simplificar o diagnóstico da cirrose experimental induzida por tetracloreto de carbono (CCl₄) em ratos. Pretendemos estudar a superfície hepática dos ratos, buscando a identificação das características da cirrose, validando, dessa maneira, o procedimento laparoscópico como método diagnóstico por meio da comparação com outros parâmetros, tais quais o perfil laboratorial das provas de função hepática, bem como o estudo histológico dos fígados expostos ao CCl₄.

MÉTODOS

Foram utilizados 20 ratos Wistar, com peso variando entre 220 e 330g, criados no Biotério da Disciplina de Farmacologia e Toxicologia da FFFCMPA. Durante o experimento, os animais foram mantidos em número de quatro por gaiola, sob condições controladas de luz, (ciclo claro das 7 às 19 horas) e temperatura (22±4^oC), recebendo ração padronizada e água ad libitum.

Foi preparada solução de tetracloreto de carbono (CCL₄) (Delaware, Brasil) na proporção 1:7 em óleo mineral (Nujol, Brasil). Utilizou-se solução fisiológica (NaCl - 0,9%) no grupo controle. Como solução anestésica, empregou-se solução composta na proporção de 1:1 de cloridrato de xilazina (König, Argentina, 20mg/ml) e cloridrato de quetamina (König, Argentina, 50 mg/ml).

A indução de cirrose foi baseada no modelo proposto por RHODEN ET AL (1992), consistindo em 25 administrações da solução de CCl₄ em óleo mineral (1:7) (1ml/kg; via i.p.), em três fases: na primeira, dez doses de CCl₄ obedeceram a um intervalo de cinco dias, durante 50 dias; a segunda fase consistiu na administração de outras dez doses de CCl₄, obedecendo um intervalo de quatro dias, num total de 40 dias; na terceira fase, foram administradas mais cinco doses com um intervalo de três dias, num total de 15 dias. 0 tempo total de indução foi de 105 dias.

Os animais foram distribuídos em dois grupos:

# GRUPO CONTROLE (n=10): constituído de ratos normais, nos quais administrou-se solução fisiológica (NaCl a 0,9%) l ml/kg, via i.p. em doses obedecendo ao esquema de administrações de CCl₄.

# GRUPO CIRRÓTICO (n=l0): ratos submetidos à indução de cirrose hepática, conforme o esquema descrito anteriormente.

Instrumental utilizado na videolaparoscopia: óptica (Hopkins) de 3mm, 30^o , empregada em rinoscopia; Hysteroflator Storz; microcâmera Endovision XI; cabeça de câmera Storz XL CE; fonte de luz Xenon 175W; monitor de vídeo; ampola de C02; e trocarte de 5mm para introdução do CO₂.

Os animais foram anestesiados com solução de cloridrato de xilazina/cloridrato de quetamina e posicionados em suporte de madeira na posição supina, mantendo-se respiração espontânea. Fixou-se as patas e realizou-se a tricotomia abdominal e anti-sepsia com iodopovidine. Realizou-se, com bisturi, uma incisão de 0,5cm na linha média do abdome. Seguiu-se a divulsão até a musculatura e, posteriormente, a introdução da agulha (trocarte) para rea1ização do pneumoperitôneo. Fez-se uma sutura em bolsa com fio mononylon 3.0 para controlar a saída de ar do abdome. Abriu-se a cavidade com controle da saída de CO₂, introduzindo-se a óptica e procedendo-se à videolaparoscopia, com exame panorâmico das estruturas intra-abdominais e posterior observação direta do fígado. O fechamento da cavidade foi feito com fios mononylon 3.0 (figura 1) .

Figura 1.

No último dia da segunda fase de adrninistrações de CCl₄, todos os animais (grupo controle e cirrótico) foram anestesiados com éter etilico, via inalatória, em campânula de vidro fechada e submetidos à coleta de sangue do plexo retro-ocular, utilizando-se, para isso, capilares de vidro. Com as amostras de sangue coletado, realizou-se a análise das seguintes provas enzimáticas: alanina transferase (ALT), aspartato transferase (AST), fosfatase alcalina (FA) e gama-glutamiltranspeptidase (g GT).

Nos dias subseqüentes à coleta de sangue, os animais foram submetidos ao procedirnento laparoscópico conforme a técnica descrita. Realizada a videolaparoscopia, os animais permaneceram cinco dias nas gaiolas. Após esse período, todos os animais foram submetidos ao sacrifício em câmara de CO₂, sendo feita, a seguir, a remoção dos fígados. Os órgãos foram colocados em recipiente com álcool etílico a 100% por 12 horas, sendo retirados e recolocados em outro recipiente com xilol por uma hora, e após isso, em outro frasco com xilol por mais uma hora. 0 material foi incluído em bloco de parafina, cortado em micrótomo e submetido à coloração de hematoxilina-eosina (HE). As lâminas contendo os tecidos hepáticos foram analisadas pelo patologista.

Para análise estatística dos valores enzimáticos (média ± desvio padrão), utilizamos o teste t de Student, considerando-se um nível de significância para p<0,05.

RESULTADOS

Através da manipu1ação da óptica, podemos avaliar a cavidade abdominal e algumas de suas estruturas, como estômago e intestino. De maneira direta, conseguiu-se observar o fígado satisfatoriamente. Com o acoplamento de pinças, manipulou-se o fígado, obtendo uma análise extensa da superfície hepática. Nos ratos submetidos à indução de cirrose com CCl₄, observou-se irregularidades evidentes na superfície hepática desses animais (figura 2). 0 tempo de procedimento laparoscópico variou de 15 a 25 minutos.

Figura 2.

Não houve acidentes nem complicações trans-operatórias, tais como 1aceração hepática e perfuração de vísceras ocas, tais como estômago ou intestino. A mortalidade nos cinco dias subseqüentes à laparoscopia foi igual a zero, tanto no grupo controle como no grupo cirrótico.

Os valores das provas enzimáticas pesquisadas estão expressos na tabela 1. Obteve-se diferença estatisticamente significante entre os grupos controle e cirrótico em todas as provas enzimáticas (p<0,05).

O aspecto microscópico do fígado dos animais submetidos à indução de cirrose pelo CCl₄ está representado na figura 3. O patologista descreveu tecido hepático com alterações de arquitetura pela presença de nódulos regenerativos delimitados por septos de tecido conjuntivo fibroso, compatível com cirrose hepática, em todos os animais em que se administrou CCl₄. Os animais do grupo controle não demonstraram alterações hepáticas microscópicas. Em apenas um caso, foi diagnosticada neoplasia hepática.

Figura 3.

DISCUSSÃO

O modelo laparoscópico utilizado permitiu simpIificação na indução de cirrose hepática proposto por RHODEN e col. (1992), reduzindo o número de administrações de 25 para 20, sendo o tempo de indução também reduzido de 105 para 90 dias. O processo cirrótico visto na videolaparoscopia foi confirmado pelo estudo histopatológico. Além disso, a deterioração hepática provocada pela intoxicação pelo CCl₄ foi evidenciada pelo incremento significativo das provas de função hepática quando em comparação com o grupo controle. A hepatotoxicidade provocada pelo CCl₄ já foi avaliada em ratos por ITO e col. (1982), que avaliaram a necrose hepatocitária induzida por CCl₄ em modelo de peritoneoscopia.

O modelo de videolaparoscopia em ratos monstrou ser simples, efetivo e de baixo custo para o objetivo proposto. O acesso mínimo à cavidade abdominal impediu a ocorrência de traumas trans-operatórios nos animais. Considerou-se que tal modelo possa servir em experimentos posteriores que visem ao melhor esclarecimento das repercussões fisiopatológicas do procedimento laparoscópico, bem como ao treinamento de cirurgiões que estejam ingressando no campo da videolaparoscopia. Outros procedimentos laparoscópicos em animais de pequeno porte e que requeiram anastomoses ou remoção de órgãos possam ser realizados. Nesse contexto, BERGUER e col. (1993) descreveram uma técnica laparoscópica de fundoplicatura gástrica em ratos com bons resultados (2).

Observou-se que um bom pneumoperitôneo foi alcançado com no mínimo 4mmHg, sem trazer riscos para o animal, possibilitando boa avaliação da cavidade abdominal, sem, contudo, ocasionar distúrbios respiratórios.

Nos cinco dias de pós-operatório, não houve mortalidade nos dois grupos estudados. Mesmo em modelos mais complexos de dissecção cirúrgica retroperitoneal, como o proposto por SANDOVAL e col. (1996), a mortalidade atinge índices inferiores a 6%. Tal fato demonstra a segurança do modelo experimental vídeolaparoscópico.

Recomendamos uma óptica de 3mm, um bom monitor e, principalmente, para quem deseja editar as imagens, desaconselhamos o uso de sistemas de "dueto" (televisão e vídeo acoplados), em vista da perda significativa da coleta de imagem e do resultado menos satisfatório da gravação. Contudo, para quem deseja exclusivamente realizar o procedimento, sem a necessidade de fazer o registro fotográfico, este sistema pode ser usado. Salientamos, também, que a câmera acoplada a um bom monitor e um vídeo duo system (VHS que grave NTSC) é o melhor equipamento para oferecer uma boa impressão da imagem selecionada.

Broncoscópio flexível parece ser o instrumento ideal para a exploração da cavidade abdominal durante o procedimento cirúrgico. Contudo, aqui no Brasil, GOLDENBERG e col. (1997) já propuseram um modelo de videolaparoscopia em ratos, empregando uma óptica de 3mm utilizada em artroscopia.

WATSON e col. (1995) já utilizaram camundongos em modelos experimentais de laparoscopia; contudo, os resultados parecem ser menos satisfatórios, tendo em vista ao tamanho reduzido da cavidade abdominal desses animais, tornando o procedimento cornplexo e de difícil execução.

No presente estudo, o tempo de procedimento laparoscópico variou entre 15 a 25 minutos; no entanto, para procedimentos laparoscópicos mais complexos, o tempo de cirurgia pode prolongar-se significativamente (40 a 90 minutos), resultando em aumento da morbi-mortalidade peri-operatória nos animais.

Como modelo experimental ainda pouco utilizado em nosso meio, constatou-se que a videolaparoscopia proporcionou praticidade e objetividade no presente estudo. A riqueza das imagens, a ótima visibilização da cavidade abdominal, a baixa morbi-mortalidade dos animais e o adestramento das pessoas envolvidas no procedimento fortaleceram a proposição e a utilização desta nova técnica no campo da cirurgia experimental, principalmente no emprego deste procedimento na ava1iação de outros modelos de afecções em animais.

CONCLUSÃO

O emprego de animais de pequeno porte para a realização da laparoscopia experimental, além de minimizar os custos, possibilita o emprego de maior número de animais por procedimento e permite a avaliação de modelos diversos, tornando a morbi-mortalidade peri-operatória baixa.

Farias EA, Fontes PRO, Rhoden CR, Lucas ML, Leal MLM, Sabedotti M, Rhoden EL. Accompanying of a cirrhosis induction model in rat through the videolaparoscopy. Acta Cir Bras [serial online] 2000 Jul-Sept;15(3). Available from: URL: http://www.scielo.br/acb.

ABSTRACT: The authors present a model of experimental vídeolaparoscopy to evaluate the hepatotoxicity induced by carbon tetrachloride (CCl₄) in rats. Nodules in hepatic surface and significative increase of hepatobiliar function tests (alanine aminotransferase, aspartate aminotransferase, alkaline phosphastase, and gammaglutamyltranspeptidase) were observed in rats treated with CCl₄. Furthermore, liver cirrhosis was diagnosed by histopathologic study in all rats submitted to administration of CCl₄. In this manner, experimental vídeolaparoscopy in rats seems be a excelent diagnostic method that merits further investigation to explore the physiologic consequences of laparoscopic surgery.

SUBJECT HEADINGS: Laparoscopy. Liver cirrhosis. Carbon tetrachloride. Rats.

Endereço para correspondência:

Enelruy A. Farias

Caixa Postal 5031 - Agência Bom Fim

Porto Alegre – RS

90041-970

e-mail: [e-mail]

Data do recebimento: 12/03/2000

Data da revisão: 23/05/2000

Data da aprovação:20/06/2000

²Aluno do Curso de Pós-Graduação em Cirurgia da FFFCMPA.

³Mestre em Gastroenterologia, Doutor e Livre-Docente em Cirurgia. Professor Assistente da Disciplina de Cirurgia da FFFCMPA.

⁴Professora Assistente da Disciplina de Farmacologia da FFFCMPA.

⁵Acadêmicos de Medicina da FFFCMPA.

⁶Médico Urologista. Mestre em Clínica Cirúrgica pela FFFCMPA.

• 1. Rhoden EL, Pereira-Lima J, Rhoden CR, Zettler CG, Barros EG. Efeito da colchicina sobre a cirrose hepática, em ratos, induzida por tetracloreto de carbono. GED 1992;11(1):35-40.
• 2. Ito T, Itoshima T, Kiyotoshi S, Kawaguchi K, Ogawa H, Hattori S, Kitadai M, Maruyama T, Nagashima H. Peritoneoscopic study on rat liver cell necrosis induced by carbo n tetrachloride and allyl formate. Gastroenterol Jpn 1982;17(1):31-5.
• 3. Berguer R, Gutt C, Stiegmann GV. Laparoscopic surgery in the description of a new technique. Surg Endosc 1993;7:345-7.
• 4. Goldenberg A, Lobo EJ, Marcondes W, Louzada M, Barbosa CDL. Proposiçăo de vídeolaparoscopia em ratos. Acta Cir Bras 1997;12(4):219-20.
• 5. Watson RWG, Redmond HP, McCarthy J, Burke PE, Bouchier-Hayes D. Exposure of the peritoneal cavity to air regulates early inflammatory responses to surgery in a murine model. Br J Surg 1995;82:1060-5.

1

Trabalho realizado nas Disciplinas de Cirurgia e de Farmacologia da Fundação Faculdade Federal de Ciências Médicas de Porto Alegre (FFFCMPA).

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  04 Set 2000
• Data do Fascículo
  Set 2000

Histórico

• Aceito
  20 Jun 2000
• Revisado
  23 Maio 2000
• Recebido
  12 Mar 2000