Avaliação do intumescimento osmótico mitocondrial do fígado submetido a isquemia parcial e ao pré-condicionamento isquêmico

Study of mitochondrial swelling of the liver submitted to ischemia after preconditioning ischemia

AVALIAÇÃO DO INTUMESCIMENTO OSMÓTICO MITOCONDRIAL DO FÍGADO SUBMETIDO A ISQUEMIA PARCIAL E AO PRÉ-CONDICIONAMENTO ISQUÊMICO.

STUDY OF MITOCHONDRIAL SWELLING OF THE LIVER SUBMITTED TO ISCHEMIA AFTER PRECONDITIONING ISCHEMIA

Barbosa Jr, A.B.¹, Maria Cecilia Jordani², Maria Eliza J. de Souza², Clarice F.F. Franco², Maria Ap. N.C. Picinato², Orlando Castro e Silva Jr.³

Núcleo de Pesquisa em Hepatologia Cirúrgica do Depto. Cirurgia,

Ortopedia e Traumatologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto-USP

Resumo: O objetivo deste trabalho foi avaliar a permeabilidade da membrana mitocondrial em animais submetidos a pré-condicionamento isquêmico, isquemia e reperfusão seguido de hepatectomia a 70%. Foram utilizados 30 ratos Wistar divididos em 3 grupos de 10: Grupo Controle (fc), Grupo Isquêmico (fi) e Grupo Pré-condicionado (fp). Após o procedimento cirúrgico os animais foram sacrificados para a remoção do remanescente hepático (30%) do qual foram isoladas as mitocôndrias para a realização dos estudos de permeabilidade da membrana mitocondrial interna através do intumescimento osmótico. Foi observado um aumento significativo do intumescimento osmótico mitocondrial do grupo fi em relação aos grupos fc e fp, sugerindo uma possível participação de espécies reativas do oxigênio no processo.

Introdução: Períodos de isquemia são muitas vezes necessários durante ressecções hepáticas parciais. Sabe-se que a isquemia ao mesmo tempo que evita ou minimiza sangramentos durante a cirurgia, induz diferentes intensidades de sofrimento hepatocelular. No sentido de se proteger o fígado das lesões de isquemia/reperfusão vários tipos de proteção hepática tem sido utilizados como uso de drogas, hipotermia e o pré-condicionamento isquêmico.

Em estudos anteriores observou-se que grupos de ratos com período de isquemia de 25 minutos, com 5 minutos de reperfusão em tempos sucessivos até completar 90 minutos apresentaram valores de função mitocondrial significativamente menores do que o grupo onde o tempo de isquemia foi de 15 minutos, seguido de 15 minutos de reperfusão em 3 tempos sucessivos, completando 90 minutos(1). Nesse mesmo estudo, o período menor de isquemia, 15 minutos, pode ter atuado como tempo de pré-condicionamento isquêmico, já descrito na literatura(5), e que por sua vez, protege o fígado das ulteriores lesões de reperfusão.

O objetivo do presente estudo foi avaliar a permeabilidade da membrana mitocondrial em animais submetidos a pré-condicionamento isquêmico, isquemia e reperfusão seguido de hepatectomia a 70%.

Método: Foram utilizados 30 ratos Wistar (250-350g) divididos em 3 grupos de 10 animais. Os ratos foram anestesiados com éter em recipiente fechado e a anestesia foi mantida com algodão umidecido em éter. Foi utilizado um grupo controle (fc) o qual foi submetido a laparotomia e manipulação, um grupo isquêmico (fi) o qual foi submetido a laparotomia e isquemia de 40 minutos, seguida de hepatectomia a 70% e um grupo pré-condicionado (fp), o qual foi submetido a laparotomia, isquemia de 10 minutos, reperfusão de 5 minutos e isquemia de 40 minutos seguida de hepatectomia a 70%. Após o procedimento foi colhido o remanescente hepático (30%) de um animal de cada grupo para o isolamento das mitocôndrias.

As mitocôndrias foram isoladas por centrifugação diferencial (4), com as quais foram realizados estudos de permeabilidade da membrana mitocondrial interna pelo intumescimento osmótico mitocondrial estimado pela diminuição da absorvância a 540 nm com o auxílio de um espectrofotômetro Beckman DU-640, em presença de CaCl₂ 10 mM, conforme descrito por Kowaltowski et al. 1996 (3). O resultado final foi analisado em gráfico de dispersão de pontos comparando os 3 grupos entre si (fc, fi e fd). O parâmetro pesquisado foi tratado estatisticamente pelo teste F (ANOVA) sendo adotado p < 0,05 (5%) como índice de rejeição de hipótese de nulidade

Resultado: Foi observado um aumento significativo do intumescimento osmótico mitocondrial do grupo fi em relação aos grupos fc e f p.

Discussão: Uma das bases do mecanismo quimiosmótico de transdução de energia é a impermeabilidade da membrana mitocondrial interna a solutos que não sejam dotados de sistemas específicos de transporte. A impermeabilidade pode ser afetada por ação de radicais livres na membrana mitocondrial ou em decorrência da transição de permeabilidade da mesma. A transição de permeabilidade mitocondrial é um fenômeno caracterizado por um aumento não seletivo na permeabilidade da membrana mitocondrial interna, mediada por Ca⁺² mais inúmeros agentes indutores, dentre eles, espécies reativas do oxigênio (radicais livres). A presença de Ca⁺² na matriz mitocondrial é o requisito mais importante para a indução da permeabilidade da membrana(6).

Tem-se observado, que sob determinadas condições, ocorre um aumento de permealidade das mitocôndrias seguido de intumescimento osmótico da matriz e muitas evidências apontam para a participação de espécies reativas do oxigênio no processo (2). O resultado do presente estudo mostra que, em presença de Ca⁺², o grupo que sofreu isquemia teve um intumescimenro osmótico mitocondrial mais acentuado, tanto em relação ao grupo controle como ao grupo que sofreu pré-condicionamento, sugerindo uma possível participação de espécies reativas do oxigênio na indução do processo, que por sua vez seria prevenido pelo pré-condicionamento isquêmico diminuindo de alguma maneira a formação dessas espécies.

Agradecimento a FAPESP pelo apoio financeiro (Processo: 1996/ 1560-2)

• ¹
  Alves Neto W C, Jordani M C, Souza M E J, Franco C F F, Picinato M A N C, Castro e Silva Jr. O. Repercusões teciduais do fígado em dois modelos de isquemia e reperfusão intermitentes. Acta Cir Bras 1998;13(supl.1):38-9.
• ²
  Jordani M C, Santos A C, Prado I M R, Uyemura S A, Curti C. Flufenamic acid is an inducer of mitochondrial permeability transition. Mol Cell Bioch 2000;210:153-8.
• ³
  Kowaltowski AJ, Castilho RF, Vercesi AE. Opening of mitochondrial permeability transition pore by uncoupling or inorganic phosphate in the presence of Ca⁺² is dependent on mitochondrial-generated reactive oxygen species. FEBS Lett 1996;378:150-2.
• ⁴
  Pedersen PL, Greenawalt JW, Reynafarje B, Hullihen J, Deccker GL, Soper JW, Bustamente E. Preparation and characterization of mitochondria and submitochondrial particles of rat liver and liver-derived tissues. Meth Cell Biol 1978;20: 411-81.
• ⁵
  Peralta C, Holtter G, Closa D. Protective effect of preconditioning on the injury associated to hepatic ischaemia/reperfusion in the rat: Role of nitric oxide and adenosine. Hepatology 1997;25(4):934-7.
• ⁶
  Zoratti M, Szabo I. The mitochondrial permeabilty transition. Biochim. Biophys Acta 1995;1241:139-76.

1

² Bioquimica do Núcleo de Pesquisa em Hepatologia Cirúrgica do Departamento de Cirurgia e Anatomia da FMRP-USP

³ Professor Associado do Departamento de Cirurgia e Anatomia da FMRP-USP

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  26 Mar 2001
• Data do Fascículo
  2000