Estudo comparativo das extensões das lesões causadas por duas e quatro passadas de laser Erbium em ratos Wistar com 0% de sobreposição dos spots

Comparative study of alterations found in 2 and 4 Erbium: YAG laser passes in Wistar rats with 0% overlap of spots

7 – ARTIGO ORIGINAL

ESTUDO COMPARATIVO DAS EXTENSÕES DAS LESÕES CAUSADAS POR DUAS E QUATRO PASSADAS DE LASER ERBIUM EM RATOS WISTAR COM 0% DE SOBREPOSIÇÃO DOS SPOTS¹

Lúcia de Noronha²

Vanessa D. M. Martins³

Jean Rodrigo Tafarel⁴

Nicolau Gregori Czeczko⁵

Antônio Luiz Francalacci França⁶

Noronha L, Martins VDM, Tafarel JR, Czeczko NG, França ALF. Estudo comparativo das extensões das lesões causadas por duas e quatro passadas de laser Erbium em ratos Wistar com 0% de sobreposição dos spots. Acta Cir Bras [serial online] 2001 Abr-Jun;16(2). Disponível em URL: http://www.scielo.br/acb.

RESUMO: Lasers de CO₂ tem sido apresentados com a finalidade de rejuvenecer a face através do resurfacing. Embora cada sistema de laser tenha o mesmo princípio básico, há significativa diferença entre os lasers que pode resultar em variações no efeito tecidual clínico e histológico. O laser Erbium:YAG que tem como característica o comprimento de onda com 10 vezes mais afinidade pela água que o laser de CO₂. O propósito deste estudo experimental foi comparar as alterações morfométricas encontradas em 2 e 4 passadas com laser Erbium:YAG com sobreposição de 0% dos spots. Foi avaliada a homogeneidade da ablaçãoem comprimento e usou-se a pele do dorso de 3 ratos in vivo. Foi selecionada uma área de pele controle de cada rato. Finalmente, num período máximo de 3 horas, a pele foi ressecada e encaminhada à histopatologia para as avaliações propostas. Como resultados com 4 passadas houve mais homogeneidade da extensão da ablação do que em 2 passadas. Conclui-se que a extensão e homogeneidade de ablação foi maior com 4 passadas. A utilização de 0% de sobreposição dos spots não garante homogeneidade de ablação.

DESCRITORES: 1. Laser. 2. Rejuvenecimento. 3. Erbium.

INTRODUÇÃO

Ao longo do último século várias técnicas têm sido utilizadas na tentativa de retardar os efeitos nocivos do envelhecimento, não apenas cronológico, mas também daquele decorrente de exposições solares ou a outros fatores ambientais. As modalidades de tratamento, visando melhoria da pele danificada, envolvem desde de os "peelings" químicos, dermoabrasão e, mais recentemente, "resurfacing" cutâneo a laser.

Resurfacing de pele a laser começou ser realizada em 1994, com o laser de dióxido de carbono (CO₂), para remoção de cicatrizes, rugas, lesões benignas de pele e transplante de cabelo.¹ O uso do laser CO₂ expandiu-se principalmente devido às suas vantagens como ausência de sangramento e, subsequentemente, menor edema e menos dor no pós-operatório

O conhecimento das vantagens proporcionou novamente o conhecimento das limitações. Quando utilizado para resurfacing, observou-se pós-operatório difícil, doloroso, com manchas e pigmentações deixando uma vermelhidão que se prolongava de três a quatro meses. Além disso, os primeiros sistemas de lasers CO₂ produziram danos térmicos de difícil controle, relacionados com os efeitos da difusão de calor em tecido adjacente, resultando em necrose térmica. Desapontando resultados clínicos, os inaceitáveis índices de cicatrizes hipertróficas colocaram sérias questões ao seu uso contínuo.

As potencialidades médicas da utilização do laser Erbium se tornaram aparentes em 1995, quando VEDLIN descreveu que o pico de onda deste laser correspondia ao pico de absorção pela água.² Dessa forma, por apresentar uma maior absorção pela água que o laser de CO₂, causa menores danos térmicos à pele do paciente, atenuando os problemas de lesões térmicas, propiciando uma recuperação mais rápida. A radiação de 29,40 micrômetros do Erbium YAG tem aproximadamente dez vezes o grau de aborção de água quando comparada com os lasers CO₂, explicando, desta forma, sua habilidade em produzir verdadeira ablação tecidual em contraposiçao à coagulação tecidual dos lasers CO₂.³

A literatura consultada revelou a quase inexistência de trabalhos experimentais em pele de rato, que visassem a análise morfométrica das lesões causadas pelo laser de Er:YAG com 0% de sobreposição dos spots. A proposta deste estudo foi a realização de pesquisa experimental em dorso de rato, com o objetivo de comparar a extensão das alterações histopatológicas encontradas em 2 e 4 passadas com laser de Er:YAG avaliando a homogeneidade destas lesões e a validade de se usar 0% de sobreposição dos spots.

MÉTODOS

Foram utilizados 3 ratos machos (rattus norvegicus variação albinus, rodentia mammalia, da linhagem EPM-1- Wistar) com idade de 90 dias e peso entre 250 e 300 gramas, cuja utilização foi aprovada pelo Conselho de Ética do Hospital de Clínicas de Curitiba, Brasil. Empregou-se um aparelho de laser Erbium: YAG de nome comercial DERMA 20, produzido pela ESC Medical Systems Ltd. , Yokneam , Israel.

Os locais de aplicação do laser foram definidas como: região crânio dorsal, compreendida entre a região cervical até 2 cm em direção a cauda limitados no sentido latero-lateral pela articulação ecapulo-umeral. Região dorso caudal compreendida entre a implantação da cauda até 2 cm acima no sentido caudal–cranial delimitado em suas laterais pelas articulações coxo-femorais. E finalmente a região dorsal como sendo a área compreendida entre as duas regiões anteriores. Cada região media 1 cm².

Os padrões estabelecidos para a aplicação do laser Erbium foram: energia liberada por pulso de 1,7 joules, duração do pulso 350 microsegundos, freqüência de 12 Hz (pulsos por segundo) e potência de 20 watts. A caneta utilizada foi específica do CPG, mantida a uma distância de 20 centímetros da pele em posição perpendicular. O tamanho do spot foi de 3mm de diâmetro, aplicado com 0% de sobreposição. O formato da figura escolhida foi um quadrado de 9 x 9 mm onde couberam em seu interior 9 pulsos em seqüência.

Os animais foram mantidos em decúbito ventral sob anestesia inalatória com éter sulfúrico. Sobre a primeira área selecionada nada foi aplicado e serviu de controle do próprio animal. Sobre a segunda área, foram aplicadas duas passadas o laser de Er:YAG. Para a terceira área selecionada, foram aplicadas quatro passadas do mesmo laser.

O intervalo de tempo entre uma aplicação do laser Er: YAG, a colheita do material e o sacrifício dos animais foi de cerca de 3 horas.

De cada animal ressecou-se 3 fragmentos de pele em forma de fuso. O primeiro referente a região de controle, o segundo da lesão causada por 2 passadas e o terceiro da lesão causada por 4 passadas com o laser Er: YAG. Cada lesão foi ressecada com 5 mm de margem de segurança de tecido, que não tivesse sido atingido diretamente pela aplicação do laser. Cada fragmento media 2 cm². Todos os fragmentos de pele foram retirados até a fáscia muscular do dorso dos animais e foram fixados em frascos contendo 100 ml de formalina a 10%.

Após 72 horas de fixação, o material foi retirado da formalina e os fragmentos de pele foram então levados ao autotécnico e processados conforme técnicas convencionais, sendo posteriormente incluídos em parafina sólida cuidando-se para que a face dermo-epidérmica do material ficasse voltada para a face de corte do bloco.

Obteve-se um total de 9 blocos histológicos, cada um contendo 1 fragmento de pele, sendo que cada rato do experimento apresentava 3 amostras de pele (C, 2P e 4P). Para cada bloco foram feitas 3 lâminas contendo 4 níveis de cortes histológicos corados com hematoxilina-eosina.

A leitura das lâminas foi feita através de microscópio binocular Olympus BH-2, com gratícula F10 (20,4 nm).

Os seguintes parâmetros morfométricos, todos medidos em micrômetros, foram avaliados:

• Extensão das áreas de pele lesada pelo laser Erbium nos 3 animais (A1, A2 e A3), nas amostras com 2 (2P) e 4 passadas (4P).

• Extensão dos intervalos de pele não lesada nas áreas onde foi aplicado o laser Erbium nos 3 animais (A1, A2 e A3), nas amostras com 2 (2P) e 4 passadas (4P).

Para se avaliar a extensão da pele nas áreas lesadas e nas áreas não lesadas foram utilizados os seguintes critérios morfométricos: medida com objetiva de 4, com aumento de 40x, onde cada quadrado da gratícula vale 56 µm. Foram medidas todas as extensões de pele lesada e não lesada nos 4 cortes corados por hematoxilina-eosina de cada fragmento estudado.

Para análise estatística dos resultados morfométricos, considerou-se um modelo de análise de variância hierárquico, dada a estrutura do experimento. Para cada uma das variáveis de interesse, testou-se a hipótese nula de medidas iguais para duas e quatro passadas, versus a hipótese alternativa de medidas diferentes ou seja:

1. A extensão média das áreas lesadas para 2 passadas é igual a esta mesma media para 4 passadas, versus a hipótese alternativa de médias de extensão de áreas lesadas diferentes.

2. A extensão média dos intervalos de pele não lesada para 2 passadas é igual a esta mesma medida para 4 passadas, versus a hipótese alternativa de médias de extensão dos intervalos de pele não lesada diferentes.

O nível de significância considerado foi de 5% e os intervalos foram construídos com 95% de confiança.

RESULTADOS

Observou-se que tanto com 2 como com 4 passadas do laser havia intervalos de pele não lesada intercalados com aqueles de pele lesada, sendo a freqüência e a amplitude destes intervalos de pele não lesada muito maior para 2 do que para 4 passadas. Além disso, o formato das lesões para 2 passadas foi em "U" e para 4 passadas em forma de plateau invertido (Esquema 1). Os resultados morfométricos corroboram as alterações histopatológicas encontradas. Assim, o Gráfico 1 ilustra os valores da extensão da pele lesada para 2 e 4 passadas de laser. O valor médio observado nos 3 animais para 2 passadas foi de 358,40 micrômetros e para 4 passadas de 807,02 micrômetros. A análise estatística dos resultados demonstrou que essa diferença foi significativa (p<0,001), ou seja, as médias da extensão das áreas lesadas foram diferentes para duas e quatro passadas de laser Erbium. A análise da extensão dos intervalos de pele não lesada (Gráfico 2) também mostrou diferença significativa (p<0,001), isto é, as médias da extensão de pele não lesada para 2 e 4 passadas não são iguais. Para 2 passadas do laser o valor médio foi de 323,31 micrômetros e para 4 passadas de 212,51 micrômetros.

DISCUSSÃO

As colorações utilizadas neste estudo foram a hematoxilina-eosina (HE), a coloração para fibras elásticas de Hart (FEH) e o tricrômico de Gomori (TG). A HE foi utilizada por se tratar de coloração de rotina, amplamente utilizada em serviços de anatomia patológica e que permite a visualização das células e de seus núcleos, bem como da matriz extracelular, com bastante detalhe histológico.⁴ O TG foi utilizado neste estudo a fim de evidenciar melhor as fibras colágenas da derme que são lesadas pelo laser, uma vez que estas são as principais responsáveis pela elasticidade da pele. A FEH foi escolhida por se tratar de uma coloração a base de prata que evidencia muito bem as fibras elásticas, uma tipo especial de fibra colágena presente na derme superficial de mamíferos que é responsável pelo aspecto jovem da pele.⁵

Os cortes histológicos (total de 108), em número de 12 para cada área (C, 2P, 4P) de cada animal (A1, A2, A3), foram retirados de forma seriada a fim de se representar uma grande área da amostra. Os cortes seriados são aqueles retirados em fita e pescados da cuba histológica de forma seqüencial, isto é, se estes cortes fossem sobrepostos nos dariam um desenho tridimensional da amostra, pois nenhum corte é desprezado. Para este estudo não seria interessante desprezarmos cortes histológicos uma vez que se quer avaliar a homogeneidade das lesões causadas pelo laser Erbium com duas e quatro passadas com 0% de sobreposição dos spots.

Para análise dos dados deste estudo utilizou-se um modelo de variância hierárquico uma vez que este experimento conta apenas com três animais. Em vista disso, poder-se-ia considerar a amostragem inadequada e pequena, porém, utilizando-se o modelo hierárquico de variáveis pode-se entender que a amostra é suficiente como demonstraram os testes estatísticos. Sendo assim o nível hierárquico mais alto foram os 3 ratos. O segundo nível foram o número de passadas (2P e 4P) em cada rato, dividindo-se assim a amostragem em dois grupos. A seguir, para cada um destes dois grupos foram feitos 4 cortes corados em hematoxilina-eosina perfazendo 24 cortes, o que caracterizou o terceiro nível hierárquico. O quarto e último nível hierárquico deste estudo foi o número de medidas feitas para cada uma das variáveis de interesse (extensão das áreas lesadas e extensão das áreas não lesadas), em cada um dos cortes realizados, a fim de se obter um nível de 5% de significância estatística. Para tanto, em cada um dos 24 cortes realizados, foram feitas inúmeras medidas destas variáveis de interesse. A exemplo disto no primeiro corte do rato de número um com 2 passadas foram realizadas 7 medidas de extensão das áreas de ablação e 6 medidas de extensão das áreas de pele não lesada. Já no quarto corte do mesmo animal para o mesmo número de passadas foram realizadas 13 medidas de extensão das áreas de ablação e 12 medidas de extensão das áreas de pele não lesada. Esta variação numérica se deve ao fato de que, segundo a metodologia utilizada, foram realizadas tantas medidas quantos intervalos de áreas lesadas e não lesadas fossem encontrados no corte, e estes intervalos foram variáveis de corte para corte. Para cada uma das variáveis de interesse se testou a hipótese nula de medidas iguais para 2 e 4 passadas, versus a hipótese alternativa de medidas diferentes. E o nível de significância considerado foi de 5% com intervalos de confiança de 95%.

Quando da observação da pele lesada pelo laser Erbium com duas passadas pode-se notar que haviam intervalos de pele lesada intercalados com intervalos de pele não lesada. Estes intervalos, tanto de pele lesada quanto de pele não lesada são relativamente regulares em frequência e extensão conferindo um aspecto lesional heterogêneo com duas passadas. Quando observamos a pele lesada pelo laser Erbium com quatro passadas pode-se notar que também haviam intervalos de pele lesada intercalados com intervalos de pele não lesada. Os intervalos de pele não lesada, entretanto, são bem menos frequëntes e menos extensos com quatro passadas e, conseqüentemente, as extensões de pele lesada são bem maiores, conferindo-lhe um padrão lesional bem mais homogêneo que o observado com duas passadas (Esquema 1). Esses dados segerem que as descargas dos spots não estariam totalmente alinhadas (Esquema 2).

Nos locais onde havia lesão observou-se dois padrões distintos para 2 passadas. Nas porções mais centrais da área lesada havia ausência completa da epiderme e das camadas mais superficiais do colágeno dérmico. Isto caracteriza o dano de ablação causado pela vaporização dos tecidos devido ao seu aquecimento causado pela afinidade destes pela água. Havia também homogenização do colágeno da derme superficial e perda da sua afinidade tintorial, o que carateriza o dano térmico residual. Nas porções periféricas da área lesada (área de transição entre pele lesada e não lesada) observou-se que o dano de ablação não é tão importante, isto é, a ablação pode se restringir somente a epiderme ou mesmo as camadas mais superiores desta (córnea, granulosa e intermediária) deixando intactas algumas células epiteliais da camada basal. O dano térmico residual também é um pouco menos importante nestas áreas periféricas. Isto sugere um padrão lesional semelhante a uma curva em "U" com áreas centrais apresentando mais profundidade de dano de ablação que as áreas periféricas. Estas observações podem ser comparadas àquelas feitas por Parvoti, 1987, para o laser CO₂ com sopreposição de 30%.⁶ O laser CO₂ teria um forma geométrica de pulso que faria uma lesão curva semelhante a encontrada no nosso estudo com o laser Erbium, tornando a sobreposição de cerca de 30% necessária para a homogenização das lesões. Entretanto, as informações do fabricante do laser Erbium indicam que o formato geométrico do seu pulso faria uma lesão mais homogênea, na forma de plateau, tornando teoricamente desnecessária a sobreposição. Porém, não foi o que ocorreu neste estudo com sobreposição de 0%, uma vez que a lesão não se mostrou homogênea tanto em profundidade como em extensão. Observamos na realidade, não uma lesão em forma de plateau, mas sim em forma de "U", sugerindo a necessidade de sobreposição ou de mais passadas para a sua homogenização.

Com 4 passadas, nos locais onde havia lesão, observou-se os mesmo dois padrões descritos com duas passadas. Havia dano de ablação da epiderme e derme superficial e dano térmico residual de camadas superficiais do colágeno dérmico. O padrão lesional semelhante a uma curva em "U", visto com duas passadas, não foi observado com quatro passadas. Na verdade, o pardrão lesional com quatro passadas foi semelhante a um plateau, como relatado pelos fabricantes, isto é, a periferia das lesões apresenta tanta ablação ou dano térmico como as porções centrais. Isto sugere que o efeito do maior número de passadas poderia estar de certa maneira substituindo o efeito da sobreposição de 30% recomendada para o laser CO₂. Sendo assim, talvez não seja a forma do pulso que influencie no padrão lesional observado, como sugerem os fabricantes do laser Erbium, e sim a sobreposição ou o número de passadas. Além disso a informação dada pelos fabricantes de que o laser Erbium não necessitaria de sobreposição não foi confirmada por este estudo como mostram os nossos resultados, a não ser que aumentássemos o número de passadas.

Na literatura pesquisada não foi encontrado nenhum estudo a cerca da porcentagem da sobreposição dos spots realmente necessária na utilização do laser de Er:YAG. Weinstein (1998) estudando 141 pacientes, usando o laser de Er:YAG com scanner, utilizou 30% de sobreposição dos spots e obteve ablação homogênea e precisa da epiderme e derme superficial.⁷ Mas não fez nenhuma comparação com outros variedades de overlap. Com o laser de CO₂ se utiliza sobreposição de 30% em função do formato geométrico de seu pulso, em "U", na tentativa aumentar o dano de ablação que é menor na periferia do pulso. Parvoti, 1987, descreve essa porcentagem de sobreposição em aplicações com o sistema de laser de dióxido de carbono para o resurfacing.⁶

Uma padrão lesional muito interessante foi encontrado nas áreas contendo pêlos. Estas áreas apresentam menor profundidade de dano de ablação e térmico residual, sugerindo que o pêlo possa servir como estrutura protetora. Essa observação pode ser explicada pelo fato do teor de hidratação do pêlo ser menor que o dos tecidos vizinhos, causando menor aumento de temperatura nessas áreas e preservando os tecidos. Este aspecto foi encontrado tanto com duas como com quatro passadas.

Não havia reação inflamatória do tipo celular nas áreas de lesão (tanto em duas como em quatro passadas), isto é, não havia presença de neutrófilos ou outras células inflamatórias. Porém havias sinais iniciais de atividade inflamatória como edema e congestão vascular. Isto porque a retirada das amostras e o sacrifício dos animais foi feito cerca de 3 horas após a aplicação do laser permitindo reação inflamatória inicial.

CONCLUSÕES

A extensão da lesão média para 2 passadas foi de 358,40 micra e para 4 passadas 807,02 micra, seguindo uma coerência esperada pois quanto maior o número de passadas maiores são as possibilidades de se obter uma maior extensão de área com ablação e menor quantidade de intervalos de pele não lesada que mediram para 2 passadas 323,31 micra e para 4 passadas 212,51 micra como valores médios.

A partir dos resultados desse estudo podemos concluir que aplicando-se o aparelho de laser de Erbium:YAG (DERMA 20 ^TM) na pele do dorso de ratos com 2 e 4 passadas com 20 watts, 1,7 joules, 12 Hz e com spot de 3 mm de diâmetro e utilizando 0% de sobreposição, não houve homogeneidade da ablação em extensão. Com 4 passadas, entretanto, a ablação foi mais homogênea do que com 2 passadas. Independente desse dado, uso de 0% de sobreposição dos spots não foi capaz de produzir ablação completa.

Noronha L, Martins VDM, Tafarel JR, Czeczko NG, França ALF. Comparative study of alterations found in 2 and 4 Erbium:YAG laser passes in Wistar rats with 0% overlap of spots. Acta Cir Bras [serial online] 2001 Apr-Jun;16(2). Available from URL: http://www.scielo.br/acb.

ABSTRACT: CO₂ lasers has been presented with the purpose of rejuvenating the face by means of resurfacing. Though each laser systems has the same base principle, there is a significant difference among lasers which could result in variations in the clinical and histological effects of the tissue. The Erbium:YAG laser has the characteristic of having the wavelength with 10 times more affinity for water than the CO₂ laser. The purpose of this experimental study was to compare the morphometric alterations found in 2 and 4 Erbium:YAG laser passes with 0% overlap of spots. It was evaluated the homogeneity of ablation in length and was used the dorsal skin of 3 living mice. It was selected a control area in each mouse. Finally, in the maximum period of three hours, the skin was resected and sent to histopathology for evaluations proposed. As a result there was more homogeneity in the length of the ablation with 4 passes than with 2 passes. The conclusions of the experiment indicated that the length and homogeneity of the ablation were larger with 4 passes. The use of 0% overlap of spots does not guarantee homogeneity in ablation.

KEY WORDS: 1. Laser. 2. Resurfacing. 3. Erbium.

Conflito de interesses: nenhum

Fontes de financiamento: nenhuma

Endereço para correspondência:

Dra. Lúcia de Noronha

Laboratório de Patologia Experimental

Centro de Ciências Biológicas e da Saúde – Campus 1

Pontifícia Universidade Católica do Paraná

Rua Imaculada Conceição, 1155

Curitiba – PR

80215-901

TEL: [phone] Ramal 2493

FAX: [phone]

Data do recebimento: 18/01/2001

Data da revisão: 21/02/2001

Data da aprovação: 15/03/2001

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• 5. Bancroft JD, Stevens A. Theory and practice of histological techniques. London: Churchill Livingstone; 1982.
• 6. Parvoti F. A model for thermal ablation of biological tissue using laser radiation. Lasers Surg Med 1987;7:141.
• 7. Weinstein C. Computerized scanning Erbium: YAG laser for skin resurfacing. Dermatol Surg 1998:24:83-9.

1

. Trabalho realizado no Laboratório de Patologia Experimental - Pontifícia Universidade Federal do Paraná Instituto de Pesquisas Médicas - Faculdade Evangélica de Medicina do Paraná - Curitiba.

2. Professora Assistente da Disciplina de Patologia da PUC-PR, Mestre em Dermatopatologia.

3. Acadêmica do Curso de Medicina - UFPR.

4. Acadêmico do Curso de Medicina - PUC-PR.

5. Professor da Faculdade Evangélica de Medicina do Paraná, Doutor em Cirurgia.

6. Cirugião Plástico Titular da Sociedade Brasileira de Cirurgia Plástica e Mestre em Cirurgia.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  11 Set 2003
• Data do Fascículo
  Jun 2001

Histórico

• Aceito
  15 Mar 2001
• Revisado
  21 Fev 2001
• Recebido
  18 Jan 2001