Estudo experimental comparativo da eficácia antitrombótica da heparina convencional e da heparina de baixo peso molecular

A comparative experimental study on the antithrombotic efficacy of conventional heparin and low molecular weight heparin

3 - ARTIGO ORIGINAL

ESTUDO EXPERIMENTAL COMPARATIVO DA EFICÁCIA ANTITROMBÓTICA DA HEPARINA CONVENCIONAL E DA HEPARINA DE BAIXO PESO MOLECULAR¹

Pierre Galvagni Silveira²

Gilberto do Nascimento Galego³

Armando José d’Acampora⁴

Agamenon Bittencourt⁵

Darlan Kestering⁶

Fernanda Fiorese Philippi⁷

Juliana Rizzatti⁸

Silveira PG, Galego GN, d’Acampora AJ, Bittencourt A, Kestering D, Philippi FF, Rizzatti J. Estudo experimental comparativo da eficácia antitrombótica da heparina convencional e da heparina de baixo peso molecular. Acta Cir Bras [serial online] 2001 Out-Dez;16(4). Disponível em: URL: http://www.scielo.br/acb.

RESUMO: Em estudo randomizado e cego comparou-se a eficácia antitrombótica (redução do peso do trombo) de duas heparinas; uma de baixo peso molecular (HBPM) e outra não fracionada – heparina convencional (HC). Foram utilizados dois procedimentos de trombose venosa experimental: no grupo I a trombose venosa foi induzida injetando-se oleato de etanolamina na veia jugular de 30 coelhos e glicose a 50% em mais 30, todos da raça New Zealand. No Grupo II a trombose venosa foi induzida por estase mediante a ligadura da veia cava de 30 ratos da raça Wistar. Não se encontrou diferenças estatisticamente significantes com relação à redução do peso do trombo em ambos os grupos. Também concluiu-se que a eficácia antitrombótica das drogas estudadas não variou conforme o tipo de estímulo indutor da trombose nos modelos testados, e que o oleato de etanolamina induziu de forma mais significante a formação de trombos no grupo I.

DESCRITORES: Heparina. Heparina de baixo peso molecular. Trombose.

INTRODUÇÃO

O tromboembolismo venoso é uma complicação freqüente nos pacientes hospitalizados. Atualmente, ocorrem por ano, aproximadamente, 650.000 casos de tromboembolismo pulmonar nos Estados Unidos, com um total de 150.000 óbitos neste período^1,2,3. A maioria dos óbitos ocorre antes mesmo do paciente ser diagnosticado ou receber tratamento adequado. Já não se discute a importância da profilaxia da doença tromboembólica venosa; para tal, dispomos de diferentes métodos, mecânicos e farmacológicos. Dentre os métodos farmacológicos destacam-se as heparinas.

Todos os métodos experimentais de trombose venosa descritos tomam a tríade de Virchow⁴ (lesão endotelial, estase e hipercoagubilidade) como base para estudos da doença tromboembólica venosa e sua profilaxia. A maioria dos trabalhos analisa a eficácia antitrombótica utilizando um dos parâmetros da tríade de Virchow ^{4,5,6,7,8,9,10.}

O primeiro modelo experimental animal de formação de trombose foi descrito por WESSLER5. O método de indução do trombo consistiu em provocar a estase venosa mediante a ligadura de uma veia de um cão ou de um coelho. Em seguida injetou-se soro humano, canino ou de coelho através de uma veia contralateral na perna ou na orelha do animal. Os modelos de estase venosa foram também testados em ratos7, mediante ligadura da veia cava inferior.

FREIDMAN8 descreveu um modelo que consistia na introdução de um corpo estranho na veia cava inferior de ratos.

Outro método de trombose venosa experimental proposto por PETERSON e ZUCKER10 em 1970, associava lesão endotelial e redução do fluxo sangüíneo, em segmentos da veia femoral do coelho com lesão endotelial produzida por morruato de sódio.

A partir da padronização destes modelos de trombose venosa experimental, foi possível o estudo em laboratório das distintas heparinas. DOUTREMEPUICH6, provocando estase em veia cava inferior de ratas, concluiu que HBPM inibe a formação do trombo com uma única dose, ao contrário da heparina convencional (HC). BONEU12, em outro modelo experimental, concluiu que as HBPM são tão eficazes quanto a HC na prevenção e estabilização da trombose. BERGQVIST13 verificou que é possível prevenir a formação de trombos com HBPM em coelhos com lesão endotelial. DINESS14, em um estudo experimental em coelhos, comparando a eficácia antitrombótica entre distintas heparinas, obteve resultados semelhantes.

Os estudos clínicos realizados também confirmaram a eficácia da profilaxia realizada com heparina, como ficou demonstrado no estudo de COLLINS15 que em uma meta análise de mais de 70 séries randomizados, com um total de 16.000 pacientes demonstrou que o uso pré-operatório de heparina subcutânea pode prevenir cerca de metade de todas as embolias pulmonares e cerca de dois terços de todas as tromboses venosas profundas.

Neste estudo experimental avaliamos uma das preparações comerciais da HBPM disponível no Brasil e a comparamos com a HC. Adotamos uma metodologia que permite a comparação entre as duas drogas e a verificação da atividade antitrombótica com diferentes métodos de indução de trombose. Ao final, também poderemos definir a substância com maior capacidade trombogênica, glicose 50% ou oleato de etanolamina.

MÉTODOS

Trata-se de um estudo experimental, randomizado, cego, onde são comparadas duas heparinas.

Após aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa Animal, foram utilizados 60 coelhos (Oryctolagus cuniculus) e 30 ratos (Ratus norvegicus albinus), provenientes do Biotério Central da Universidade Federal de Santa Catarina. Os coelhos, da raça New Zeeland, de ambos os sexos pesavam de 2,5 a 3,0 quilos e os ratos Wistar, fêmeas, pesavam entre 250 a 300 gramas. Foram alimentados com dieta padrão e água "ad libidum" até 12 horas antes da cirurgia.

As soluções estudadas - Liquemineâ (Heparina Ca 5000 U) Roche; Flaxiparinaâ ( Nadropamina - HBPM 4.500 daltons) Sanofi e controle: Solução de cloreto de sódio a 0,9% - , foram colocadas em frascos numerados, codificados, tornando desconhecidas as drogas a serem utilizadas. As doses das soluções foram ajustadas ao peso dos animais de acordo com a prática clínica em humanos e elas foram injetadas via subcutânea 2 horas antes da cirurgia. Todos os animais foram anestesiados com uma solução de 50mg/ml de cloridrato de quetamina (Ketalarâ ) e 0,02 mg/ml de Ronpumâ , tendo como medicação pré-anestésica Diazepamâ .

Os animais foram divididos em dois modelos experimentais:

Modelo 1: método de PETERSON e ZUCKER¹⁰ modificado, utilizando 60 coelhos da raça New Zealand.

A trombose foi induzida por lesão endotelial em veia jugular com oleato de etanolamina em 30 coelhos e glicose a 50% nos outros 30. A veia jugular foi exposta através de uma incisão cervical transversa. Um segmento de 1cm de comprimento da veia foi isolado entre duas pinças hemostáticas e o seu ramo facial canulado com um Abbocathâ 23. O segmento foi lavado com soro fisiológico 0,9% e depois preenchido com oleato de etanolamina em 30 animais e glicose a 50% nos outros 30, durante 5 minutos. Após este período, o segmento foi lavado com soro fisiológico, as pinças abertas e passada uma ligadura estenosante distal do calibre do Abbocathâ . Após 30 minutos a veia foi isolada, aberta longitudinalmente e inspecionada macroscopicamente. O trombo, quando presente, foi imediatamente removido e pesado. Em seguida induzimos a eutanásia do animal.

Modelo 2, Método de REYES⁷ com utilização de 30 ratas da raça Wistar.

A trombose foi induzida com estase por ligadura oclusiva da veia cava inferior. A cavidade abdominal foi aberta por laparotomia mediana longitudinal; isolamento da veia renal esquerda e ligadura da veia cava inferior (infra-renal) com um fio de seda multifilamentar 6/0. Fechamento da cavidade abdominal com relaparotomia seis horas mais tarde. Isolamento de um segmento da veia cava inferior de 1,5cm de extensão; se o trombo estivesse presente, era retirado e imediatamente pesado. Do mesmo modo, induzimos a eutanásia do animal logo após o procedimento.

Todos os trombos foram pesados em uma balança de precisão para o estudo comparativo e avaliados quanto a sua presença para o cálculo do fator tromboprotetor (TPF), descrito por MAGGI e ABBADINI¹⁶. O TPF foi calculado através do seguinte cálculo:

Número total de animais – Número de animais com trombo

Número total de animais

Adotou-se como nível de significância p<0,05 ou 5%.

RESULTADOS

Grupo I: lesão endotelial

A maioria dos animais deste grupo desenvolveu trombo (52 animais). Um bom efeito antitrombótico foi obtido com HC em comparação com placebo no oleato de etanolamina (p < 0,013), o que não ocorreu com a glicose 50% (p < 0,17). Resultados significativos foram obtidos com a HBPM em comparação com o placebo (oleato de etanolamina: (p < 0,0009) e glicose 50% (p < 0,04). Contudo, não houve diferença significativa entre a HC e a HBPM (oleato de etanolamina (p < 0,64) e glicose 50% (p < 0,68).

Grupo II: estase

Neste grupo, a maioria dos animais não desenvolveu trombo. A atividade tromboprotetora foi significativa quando comparados controle e HC (p < 0,001), o que também ocorreu entre o controle e a HBPM (p < 0,003). Já entre a HC e a HBPM não houve diferença estatisticamente significante (p < 0,58).

DISCUSSÃO

O interesse pelas HBPM, como agentes antitrombóticos, cresceu a partir do estudo de JOHNSON¹⁷ em 1976. Neste estudo observou-se que os níveis de atividade anti-Xa no plasma nos pacientes que haviam recebido HBPM, eram 4 vezes maiores quando comparados aos que receberam a heparina não fracionada. Em outros estudos também ficou demonstrado que as complicações hemorrágicas eram pouco freqüentes, às custas de uma menor inibição da função plaquetária pelas HBPM. Por último, a biodisponibilidade e a vida média destas heparinas seria maior, o que permitiria uma única aplicação diária para se obter uma boa tromboprofilaxia ^{1,9,11,16,18.}

Nos estudos experimentais, diferentes modelos vêm sendo utilizados, com uma grande variação nos resultados. FAREED¹⁹ em um estudo experimental em coelhos, comparou a ação antitrombótica intravenosa e subcutânea de várias heparinas. Todas as drogas foram testadas em doses anti-Xa idênticas demonstrando um ação antitrombótica menor da heparina não fracionada. Em nosso estudo procuramos reproduzir situações clínicas em que dois dos componentes da tríade de Virchow estivessem isoladamente presentes, na tentativa de comparar o comportamento das diferentes heparinas segundo o estímulo indutor da trombose. Em alguns estudos experimentais prévios, a trombose foi induzida sem individualizar sua etiologia, como por exemplo, o estudo de HOLMER²⁰ de 1982.

Ao contrário de FAREED¹⁹, utilizamos doses iguais às recomendadas na prática clínica. Finalmente, utilizamos dois tipos de animais (coelhos e ratos), pois o modelo de indução da trombose mediante estase com ligadura de veia cava só está descrito em ratos. No modelo de lesão endotelial e estase utilizamos distintas drogas para a indução da trombose (oleato de monoetanolamina e glicose a 50%), com a intenção de averiguar que substância se comportaria melhor para a avaliação dos trombos conseguidos.

A partir de nossos resultados podemos concluir que nos dois modelos experimentais utilizados a ação tromboprotetora de ambas heparinas foi estatisticamente significativa quando comparada ao placebo, assim como em outros estudos^{6,11,12,13,20}. Entretanto, a comparação entre os dois tipos de heparina não demonstrou diferença significativa. Também não foi demonstrado comportamento distinto das drogas em relação ao estímulo indutor da trombose, ao contrário da literatura, que descreve uma diminuição da atividade tromboprotetora das heparinas quando o estímulo indutor é a lesão endotelial²¹.

Quanto aos resultados das drogas utilizadas na indução da trombose, concluímos que a glicose a 50% apresenta-se menos lesiva ao endotélio vascular, formando trombos menores o que facilitou a avaliação dos resultados.

CONCLUSÕES

Nos dois métodos foi possível induzir a formação de trombose em todos os animais do grupo placebo, assim como na maioria dos animais tratados com heparina.

O efeito tromboprotetor da heparina convencional e da heparina de baixo peso molecular foram estatisticamente significativos quando comparados ao grupo placebo.

Não houve diferença estatisticamente significante quando comparou-se a atividade antitrombótica da heparina convencional com a heparina de baixo peso molecular.

A substância oleato de etanolamina demonstrou maior capacidade trombogênica quando comparada à glicose a 50%.

Silveira PG, Galego GN, d’Acampora AJ, Bittencourt A, Kestering D, Philippi FP, Rizzatti J. A comparative experimental study on the antithrombotic efficacy of conventional heparin and low molecular weight heparin. Acta Cir Bras [serial online] 2001 Oct-Dec;16(4). Available from: URL: http://www.scielo.br/acb.

ABSTRACT: A prospective randomized blind trial was performed, comparing the antithrombotic efficacy (reduction of weigth thrombi) of two heparines with low molecular weight and unfractionated calcium heparine. It was used two differents models of experimental venous thrombosis: in the first group, a combination of endothelial injury and flow reduction, was used to induce jugular vein thrombosis in New Zealand rabbits, 30 with etanolamine, and other 30 with glucose 50%. In the second group, venous stasis was used to induce cava vein thrombosis in 30 female Wistar rats. No significant differences on reduction of thrombus weigth were found on both groups.There was no relationship betwen thrombotic agents and experimental thrombosis model. Etanolamin induced thrombosis more significantly in group I.

KEY WORDS: Heparin. Heparin, low-molecular-weight. Thrombosis.

Conflito de interesses: nenhum

Fontes de financiamento: nenhuma

Endereço para correspondência:

Pierre Galvagni Silveira

Rua Irmã Joaquim,122

Florianópolis-SC

88020-620

Tel: [phone] Fax [phone]

e-mail: [e-mail]

Data do recebimento: 02/04/2001

Data da revisão: 21/05/2001

Data da aprovação: 02/06/2001

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1

- Trabalho da Disciplina de Técnica Operatória e Cirurgia Experimental da Universidade Federal de Santa Catarina - UFSC.

2

- Professor Adjunto III da Disciplina de Cirurgia Vascular da UFSC.

3

- Professor Adjunto III da Disciplina de Técnica Operatória e Cirurgia Experimental da UFSC.

4

- Professor Adjunto de Técnica Operatória e Cirurgia Experimental da UFSC.

5

- Médico graduado pela UFSC.

6

- Médico graduado pela UFSC.

7

- Acadêmica do 4º ano de Medicina.

8

- Acadêmica do 4º ano de Medicina.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  11 Set 2003
• Data do Fascículo
  Dez 2001

Histórico

• Aceito
  02 Jun 2001
• Revisado
  21 Maio 2001
• Recebido
  02 Abr 2001