MÉTODO DE INDUÇÃO DE CIRROSE BILIAR SECUNDÁRIA COM USO DE PRÓTESE DE SILICONE

METHOD FOR THE EXPERIMENTAL INDUCTION OF SECUNDARY BILIARY CIRRHOSIS IN WISTAR RATS

MÉTODO DE INDUÇÃO DE CIRROSE BILIAR SECUNDÁRIA COM USO DE PRÓTESE DE SILICONE¹

METHOD FOR THE EXPERIMENTAL INDUCTION OF SECUNDARY BILIARY CIRRHOSIS IN WISTAR RATS

Araujo Lima A. A. L. de²;Sankarankutty A. K.³;

Ramalho L. N. Z.⁴; Zucoloto S.⁵;Silva Júnior O. de C.⁶

Resumo: O objetivo deste experimento foi o desenvolvimento de um modelo de obstrução do ducto biliar comum através da interposição de uma prótese de silicone extrínseca ao ducto com única ligadura sem secção. Desenvolveu-se um modelo experimental alternativo, em ratos Wistar, que provoca a interrupção do fluxo bílio-duodenal com resultado satisfatório, pois houve distorção da arquitetura hepática, caracterizada por fibrose e proliferação ductal além de indicadores bioquímicos da colestase.

Descritores: Obstrução biliar experimental. Cirrose biliar secundária. Colestase. Prótese de silicone.

Key Words: Bile duct obstruction.Secondary biliary cirrhosis.Cholestasis.Silicone tube.

Introdução: A obstrução biliar tem sido induzida em ratos, mas a intensidade, a duração da icterícia e alterações histológicas no fígado dependem do método utilizado.³ Alguns autores têm demonstrado a ocorrência de cirrose biliar secundária^2,9 e outros somente fibrose.^5,15 Vários métodos foram descritos para a obstrução biliar: ligadura simples do ducto, ligadura seguida de transecção, ressecção ou enovelamento, ligadura segida de secção e introdução de cateter no coto proximal com exposição subcutânea e por último a obstrução extrínseca do ducto sem seccioná-lo.^6,7 O índice de sucesso varia em cada modelo, sendo que as repermeabilizações do ducto biliar comum após ligadura simples ou ligadura e transecção têm sido mais frequentemente as causas de insucesso na indução da colestase,^1,2,5. Os mecanismos responsáveis descritos são a invaginação do coto proximal em direção ao distal e a proliferação de glândulas epiteliais na extremidade distal do ducto.¹⁴ O objetivo deste estudo consiste em descrever um método simples e eficiente de obstrução biliar para a obtenção de cirrose biliar secundária.

Métodos: Foram utilizados 17 ratos, linhagem Wistar, machos, com peso inicial de 250 a 300g, tratados de acordo com o International Guiding Principles for Biomedical Research Involving Animals. Foram distribuídos em dois grupos: 10 animais foram submetidos à obstrução do ducto biliar comum (grupo OB) e 7 foram submetidos à operação simulada (grupo OS).

Técnica cirúrgica: Os animais foram submetidos a anestesia geral por via inalatória com éter etílico. A seguir realizou-se laparotomia por incisão mediana de 5 a 6 cm de extensão e posicionamento de afastador auto-estático em forma de duplo gancho. Inicialmente tracionou-se a alça duodenal para baixo e para a esquerda com exposição plena do ducto biliar comum desde a junção proximal dos dois ductos até o segmento justa-pancreático. Cerca de 3mm abaixo da junção, o ducto biliar comum foi ligado com 5 nós de fio monofilamentar (Prolene Suture-blue monofilament 5-0, Ethicon, INC). Em seguida com a mesma agulha deste fio transfixou-se a borda superior de uma prótese de silicone, de aproximadamente 5 mm, seccionada longitudinalmente. Envolveu-se o ducto biliar comum pela prótese e transfixou-se sua borda contra-lateral superior, aproximando as duas bordas e juntando-as com o mesmo fio em 5 nós. Abaixo completou-se a fixação da prótese com outro fio similar (figura). O fechamento da aponeurose e da pele foi feito com sutura contínua. A avaliação histopatológica e bioquímica do fígado destes animais foram realizados após 4 semanas da obstrução, período no qual se administrou vitamina K, 15U, subcutânea a cada 3 dias.

Estudos bioquímicos: De todos os animais foram colhidos aproximadamente 3 ml de sangue por punção da veia cava inferior no momento do sacrifício e feitas as seguintes dosagens:

Fosfatase Alcalina (FA): Dosagem pelo método de BESSEY.⁴

Bilirrubina total e frações (BT,BI,BD): Dosagem pelo método de SIMS & HORN.¹³

Estudo histopatológico: Os animais foram sacrificados sob anestesia com éter. Após a análise macroscópica do fígado, dois fragmentos foram fixados em solução de formalina a 10% tamponada por 12h e, após, transferidos para solução alcoólica a 70% até o momento de inclusão em parafina. Secções de 5 mm de espessura foram coradas pelas técnicas de Hematoxilina e Eosina e Tricrômico de Masson para análise. As frações de volume da fibrose, hepatócitos, ductos biliares e vasos foram avaliados através da morfometria sobre os cortes corados com o tricrômico de Masson. Utilizou-se a ocular integradora com 100 pontos (Integrating eyepiece II, Zeiss, Oberkochen, FRG), com aumento de 10x e objetiva de 40x. O número de campos analisados para cada biopsia hepática foi calculado em função da média acumulada da fração de volume de cada componente. Nos animais com obstrução biliar e nos submetidos a operação simulada, a análise de 30 campos foi considerada estatisticamente adequada.

A análise estatística para comparação entre os grupos utilizou-se o teste U de MANN-WHITNEY⁸. O nível crítico a partir do qual as diferenças foram consideradas significantes foi de 5% ( p< 0,05).

Resultado: Os animais evoluíram satisfatoriamente. O tempo esperado para progressão da lesão hepática colestática para a cirrose biliar foi de 25-30 dias após ligadura do ducto biliar,. Da obstrução de 10 animais, obtivemos resultados satisfatórios em 75-80% deles. Um animal morreu no período pós-obstrução. Clinicamente, os animais apresentavam icterícia, colúria, dilatação do ducto biliar em diferentes intensidades. O fígado apresentava-se endurecido, aumentado com nodulações difusas; esplenomegalia, aumento da circunferência abdominal, hérnias da parede abdominal e granulomas, além de ascite em diferente graus.

Avaliações bioquímicas: Bilirrubinas total, direta e indireta (BT,BD,BI) em mg/dl e fosfatase alcalina (FA) em U/l. O grupo cirrótico apresentou valores de BT, BD e BI mais elevados que o grupo CN, com diferença significante. A FA foi mais elevada no grupo cirrótico. Os resultados da avaliação bioquímica do sangue estão demonstrados na tabela.

Avaliação Histopatológica: Em todos os animais com obstrução biliar houve desarranjo da arquitetura parenquimatosa pela presença de fibrose e abundante proliferação de ductos biliares e vasos sangüíneos, além de nódulos de regeneração distribuídos irregularmente pelo parênquima hepático. A presença de infiltrado inflamatório mononuclear entre a fibrose e ductos biliares foi constante. Esse conjunto de alterações foi caracterizado como cirrose biliar. Na análise morfométrica, representada em valores percentuais, encontrou-se diferença estatística muito significante nos números de hepatócitos, ductos biliares vasos sangüíneos e fibrose apresentados pelos grupos de animais cirróticos quando comparados ao grupo controle normal. Nos animais normais, o número de hepatócitos excede os valores dos cirróticos, ocorrendo o inverso quando se trata dos demais parâmetros (tabela).

Discussão: A cirrose biliar experimental em animais é influenciada por vários fatores e depende inclusive do tipo de animal usado. Vários modelos para a obstrução biliar com a interrupção do fluxo biliar ao duodeno têm sido descritos.^{2,3,5,9,12,15} Dois fatores são os mais relevantes na indução da cirrose biliar experimental: a taxa de morte nas primeiras duas semanas e a recanalização ductal.^5,6 As ligaduras simples ou duplas podem ser seguidas mais frequentemente por recanalização do ducto biliar.^7,9 A introdução de cateter de polietileno no ducto biliar tem bons resultados mas a necessidade de se abrir o ducto eleva a taxa de mortalidade do animais.¹¹ Sob análise bioquímica, os resultados desse experimento foram superiors aos de trabalhos anteriores.¹

No presente estudo, o uso da prótese de silicone impede a recanalização do ducto biliar a partir da porção dilatada do ducto sobre a extremidade inferior ou previne a proliferação de dúctulos colaterais a partir do ducto imediatamente abaixo da prótese em direção ascendente.¹⁴ Os resultados desse experimento demonstram que o modelo utilizado foi eficaz no desenvolvimento de cirrose biliar secundária, pois houve marcante desarranjo da arquitetura hepática com o surgimento de fibrose e proliferação ductal, bem como aumento significante de bilirrubina e fosfatase alcalina. Na análise histológica ressalta-se a presença de nódulos de regeneração.¹⁰

Essa técnica é de simples realização com sucesso em aproximadamente 75-80% dos casos e não há a necessidade de procedimentos mais agressivos como a transecção com ou sem ressecção de um segmento ductal.

Conclusão: Este modelo de obstrução do ducto biliar comum, através da interposição de uma prótese de silicone em ratos Wistar, levou a um aumento significativo nas dosagens séricas da bilirrubina, da fosfatase alcalina, aparecimento de fibrose e intensa proliferação de ductos biliares em relação ao grupo controle. Os resultados indicaram ser um método eficiente de obstrução biliar extra-hepática, com sucesso em 75-80% dos casos.

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1

Trabalho realizado junto aos Departamentos de Cirurgia e Anatomia, Departamento de Patologia, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo;

2

Pós-graduanda do Departamento de Cirurgia e Anatomia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, USP.

3

Professor Assistente do Departamento de Cirurgia e Anatomia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, USP.

4

Professora Doutora o Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, USP.

5

Professor Titular do Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, USP.

6

Professor Associado do Departamento de Cirurgia e Anatomia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, USP.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  11 Jun 2002
• Data do Fascículo
  2001