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Acta Cirurgica Brasileira

Print version ISSN 0102-8650On-line version ISSN 1678-2674

Acta Cir. Bras. vol.16  suppl.1 São Paulo  2001

http://dx.doi.org/10.1590/S0102-86502001000500010 

a10v16s1

SWELLING MITOCONDRIAL EM AMOSTRAS TECIDUAIS DE GATOS SUBMETIDOS À OCLUSÃO DA ARTÉRIA CEREBRAL MÉDIA1

MITOCHONDRIAL SWELLING IN TISSULAR SPECIMENS OF CATS SUBMITED TO OCLUSION OF MIDDLE CEREBRAL ARTERY

 

Câmara, RLB2; Roselino, JES3; Colli, BO4

 

 

Resumo: A isquemia cerebral tem sido largamente estudada com intuito de se obter medidas terapêuticas eficazes que minimizem seus efeitos, visto que uma grande quantidade de pacientes, clínicos ou cirúrgicos, apresentam conseqüências freqüentemente irreversíveis da mesma.
A escolha de um modelo experimental satisfatório a fim de nortear pesquisas com agentes neuroprotetores tem sido a base desses estudos.
No presente trabalho foi escolhido o gato como modelo experimental de isquemia e a avaliação foi realizada através do swelling mitocondrial.
Os trinta e dois animais utilizados neste experimento, foram divididos em quatro grupos distintos, cada qual com dez animais sendo submetido a um tempo de isquemia, que aumentou progressivamente (15, 30 e 60 minutos), exceto no último grupo com dois animais e que não foi submetido a nenhum procedimento isquemiante.
Foram observadas alterações evidentes nas curvas de swelling mitocondrial energizado nos animais submetidos a 60 minutos de isquemia, quando se comparou amostras do lado isquêmico em relação ao controle, isto ficou ainda mais claro quando se adicionou o antibiótico Alameticina durante os ensaios laboratoriais do swelling mitocondrial.
Foi possível chegar às seguintes conclusões: o swelling funciona como indicador de diferenciação mitocondrial entre diversos tecidos; a mitocôndria do cérebro, quando exposta ao efeito da Alameticina, apresenta uma sensibilidade diferenciada em relação às dos outros tecidos; a mitocôndria do cérebro submetido a isquemia durante 60 minutos se torna mais sensível à Alameticina; e finalmente, as mitocôndrias do cérebro apresentam uma instalação extremamente rápida da reversão do swelling.
Descritores:
isquemia cerebral, swelling mitocondrial.
Key Words: cerebral ischemia, mitochondrial swelling.

 

 

Introdução: As alterações na permeabilidade da membrana mitocondrial são conhecidas de longa data. Mitocôndrias isoladas são capazes de inchar em sacarose hipotônica. Este processo de entumescimento (swelling) é observado na amostra mitocondrial levada a espectrofotômetro, acompanhando-se a diminuição da dispersão de luz a um comprimento de onda de 520nm. A explicação é que a matriz inchada possui um índice de refração menor que a forma condensada, tornando-se perceptível as modificações na organização estrutural. Uma vez que a penetração de água ou solutos, acompanhados de água, promove o distanciamento de elementos estruturais, promovido por um rearranjo estrutural de sistemas macromoleculares, este fenômeno pode ser acompanhado na sua velocidade ou na sua extensão, mantidas constantes as condições de temperatura, força iônica e pH. O swelling está associado à alteração da permeabilidade da membrana mitocondrial provocada por vários fatores, tais como íons, agentes desacopladores, estado inicial das mitocôndrias, condições de incubação e ausência ou ocorrência de respiração ou fosforilação. O swelling mitocondrial compreende genericamente uma série de fenômenos de diferentes naturezas, que podem ser medidos como uma alteração da absorção de luz no caso de espectrofotômetros ou de seu desvio em espectrofluorímetros (1, 2).

Baseando-se na premissa de que a ativação da respiração mitocondrial por adição de ADP também pode ser vista como um processo de transição de membrana entre estados que correspondem à respiração basal e à respiração ativada por ADP, buscou-se demonstrar fenômenos de swelling que fossem reversíveis. Processos que devem ser mantidos acoplados para que ocorra a máxima conversão de energia quimiosmótica em síntese de ATP.

O swelling dependente da respiração mitocondrial (mitocôndrias energizadas) em sais de acetato (um ânion carregador de prótons), ocorre devido à penetração de cátions através da membrana interna, em resposta a um potencial negativo no interior da mesma. Inicialmente é gerado um gradiente transmembrana de pH (D pH) dependente da respiração. O acetato acompanha o fluxo de cargas positivas, sendo utilizado no ensaio como um substituto do ânion Cl- a fim de excluir interferências devidas à permeabilidade seletiva deste último (para excluir nas condições estudadas alterações na permeabilidade de ânions). Assim, a energização da mitocôndria induz um decréscimo na absorbância em 520nm devido à expansão osmótica da matriz mitocondrial que deve representar fluxo de Na+ e principalmente de K+ (1, 3).

Nossos resultados mostraram que este fenômeno de swelling se mostra diferente, conforme o tecido do qual se obtém a mitocôndria. Em geral, o fenômeno do swelling inicia-se após a adição de succinato à suspensão mitocondrial e observa-se uma variação de DO inicial muito rápida e cuja velocidade passa a ser relativamente mais lenta até a expansão máxima do volume da matriz, na população mitocondrial da amostra, seguindo-se uma fase de redução do volume.

O swelling de mitocôndrias energizadas em presença de potássio envolve a entrada deste cátion via uniporter. A entrada do ácido diminui o pH da matriz mitocondrial. Isto diminui a barreira energética para a ejeção respiração-dependente de prótons, permitindo um continuado bombeamento de prótons para manter o gradiente elétrico enquanto o cátion entra. Alternativamente, o volume da matriz mitocondrial parece ser controlado por um equilíbrio entre a entrada eletrogênica de potássio e a extrusão pelo antiporter K+/H+ movido por gradiente próton motor. O antiporter K+/H+ é ativado em faixas de osmolaridade onde há desdobramento das cristas, mas não há alteração da ultraestrutura da membrana. Isto significa dizer que o efluxo de potássio é estimulado pelo estiramento da membrana, já bastante evidente em sacarose a 0,15M. Esta saída de potássio foi demonstrada ser inibida de modo não competitivo pelo íon magnésio. Nos ensaios energizados induzidos por succinato, o efluxo de potássio seria realizado às custas do componente D do pH do potencial protônico (1, 3, 4, 5, 6).

O swelling passivo (mitocôndrias não energizadas), também pode ser verificado. Todavia, esta condição experimental tem a desvantagem de eliminar o envolvimento da respiração e do potencial de membrana, mas é apropriada para estudar o intumescimento mitocondrial induzido pelo cálcio. Foi observado que mitocôndrias em presença de cálcio em concentração fisiológica (0,1 a 1,0µM) sofrem intumescimento que pode ser acompanhado pela diminuição da DO em 520nm. Ocorre alteração da permeabilidade da membrana interna para moléculas, tais como sacarose e glicose, que são acompanhadas por água, ao mesmo tempo que é afetado o movimento de íons através da membrana. Essas variações de volume da matriz provocadas pela presença de cálcio são inibidas competitivamente pelo íon magnésio. Em concentrações suprafisiológicas, o cálcio afeta a integridade da membrana mitocondrial, permitindo a passagem de solutos com peso molecular abaixo de 1000, entre esses solutos, encontram-se os nucleotídeos. Para se diferenciar variações de DO devidas a alterações reversíveis daquelas devidas à lesão irreversível podem ser feitas dosagens de NAD+ e NADH+H+ no meio de incubação das mitocôndrias (1, 2, 5). A mitocôndria não possui transportador para NAD ou NADH+H. Assim, quando ocorre abertura de poros na sua membrana e perda destes nucleotídeos, isso indica um tipo de lesão irreversível. Assim, fica claro a necessidade de se estudar um processo que seja reversível.

No estudo de condições de isquemia, faz-se necessário compreender as alterações reversíveis da permeabilidade da membrana mitocondrial interna, pois as lesões irreversíveis estão diretamente associadas ao processo de morte celular, onde não há possibilidade de intervenção terapêutica. Os processos mitocondriais que estariam associados com a formação do poro cálcio-dependente e com o estabelecimento da lesão irreversível, não foram considerados nesta revisão.

No presente estudo procurou-se destacar alterações funcionais possivelmente reversíveis e nesse sentido foi empregado o ensaio mitocondrial de swelling energizado espontaneamente reversível e que não foi inibido por ciclosporina 2µM, em contraposição a outros fenômenos, tais como a transição de permeabilidade mitocondrial, inibível por 1µM de ciclosporina A, cálcio- dependente.

Métodos: Animais - Foram utilizados 32 gatos (Catus felis) adultos jovens sem raça definida pesando, em média, 2Kg, fornecidos pelo Biotério Central do Campus de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. Durante todo o experimento foram respeitadas as normas preconizadas pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal, visando manter sempre um procedimento ético em todas as etapas da pesquisa(7, 8).

Formação dos Grupos Experimentais e Delineamento da Pesquisa - Os gatos foram divididos em quatro grupos: Grupo I - 10 animais foram submetidos a oclusão da artéria cerebral média direita por 15 minutos. Grupo II - 10 animais foram submetidos a oclusão da artéria cerebral média direita por 30 minutos. Grupo III - 10 animais foram submetidos a oclusão da artéria cerebral média direita por 60 minutos. Em cada animal dos grupos I, II e III foi retirado o parênquima do território irrigado pela artéria cerebral média tanto no lado isquemiado quanto no lado não manipulado. Grupo IV – Em 2 animais que não foram submetidos à oclusão da artéria cerebral média, foi retirado parênquima do território irrigado pela artéria cerebral média bilateralmente. Após a retirada de dois blocos do parênquima cerebral medindo 3,0x1,0x1,0 cm no território irrigado pela artéria cerebral média em cada um dos hemisférios, os animais foram sacrificados com dose endovenosa de Nembutal. Foram retirados ainda amostras de músculo esquelético, músculo cardíaco, rim e fígado de gatos aleatoriamente para estudo comparativo da função mitocondrial em relação ao tecido cerebral. O processamento do material visou à obtenção de mitocôndrias purificadas para análise do swelling mitocondrial.

Avaliação do Swelling Mitocondrial - Após a homogeneização de cada amostra cerebral obtida (parênquima isquêmico e controle), a purificação das mitocôndrias passou a ser feita de maneira específica, apropriada à avaliação do swelling mitocondrial. Cada homogeneizado obtido foi centrifugado por 3 minutos a 700xg em centrifuga refrigerada. O sobrenadante foi centrifugado por 10 minutos a 15.000xg. O precipitado obtido foi ressuspendido com dedo de gelo em 0,5ml de sacarose e o volume completado para 10ml de sacarose 0,25M, sendo então novamente centrifugado por 10 minutos a 15.000xg. Cada precipitado obtido foi ressuspendido com dedo de gelo em 0,5ml de sacarose e o volume completado para 1ml de sacarose a 0,25M. A dosagem protéica da suspensão mitocondrial foi realizada usando-se soroalbumina bovina com padrão e procedendo-se à leitura 660nm durante 20 minutos após a adição do reativo de Follin. Procedeu-se à determinação da avaliação do volume mitocondrial na temperatura ambiente em um expectrofotômetro Hitachi U-2000, tendo sido determinada a absorbância a 520nM durante 1.200 segundos(9). O sistema continha sacarose: 0,1M; MOPS: 0,01M; Acetato de Sódio 5mM e Acetato de Potássio 50mM. Registrou-se o swelling em presença de succinato 7,5mM. O ensaio foi preparado em um volume total de 500ml previamente agitado para mistura dos componentes em aeração. Deste volume retirou-se: uma alíquota imediatamente antes do succinato (amostra inicial) e uma alíquota após 1.200seg de swelling (amostra final). Também foi realizado processamento de amostras obtidas de outros órgãos (fígado, rim, músculo cardíaco e esquelético) dos animais, que foram analisadas visando uma comparação do swelling mitocondrial. Este processamento foi feito de uma maneira apropriada para cada tipo de tecido. Todavia, o meio de swelling energizado utilizado foi basicamente o mesmo para todas as amostras obtidas. Esse meio foi o mesmo descrito anteriormente.

Resultados e Discussão: De acordo com os resultados obtidos nas curvas de swelling foi possível chegar-se a várias conclusões.

O swelling funciona como um indicador de diferenciação mitocondrial entre diversos tecidos. Em frações mitocondriais preparadas com controle de qualidade (RCR superior a valor crítico pré-estabelecido) foi realizado o entumescimento osmótico em condições de energização. A mitocôndria que apresenta a maior variação de absorbância neste ensaio é a do músculo esquelético. A mitocôndria do SNC ao contrário apresenta ausência quase total de variação nesta escala. Isto pode representar um reflexo de uma adaptação evolutiva do tecido cerebral que se encontra restrito volumetricamente no interior da caixa craniana.

 

 

Sensibilidade relativa da mitocondria do cérebro em relação às dos outros tecidos, quando expostas ao efeito da Alameticina. A Alameticina é um polipeptídeo com 18 resíduos de aminoácidos, com estrutura em anel, tendo na superfície interna deste anel, dois resíduos basculantes de glutamina 6 e 18 que transportam cátions monovalentes entre duas faces de membrana. Para realizar este transporte, seis ou mais moléculas de Alameticina são necessárias, o que sugere a dependência de um mecanismo baseado na formação de túnel por empilhamento (stacking) das moléculas da Alameticina (10). A mitocôndria do SNC requer 10 vezes mais Alameticina para apresentar o swelling que a mitocôndria dos tecidos comparados. A razão mais provável neste caso parece ser que a membrana mitocondrial do SNC também é muito mais rica em ligações C=C insaturadas que dificultariam a mobilidade da molécula dentro do plano da membrana, dificultando a formação do canal.

 

 

A mitocôndria do cérebro isquêmico 60 minutos, torna-se mais sensível a Alameticina. Este achado pode significar aumento da fluidez da membrana mitocondrial interna, decorrente do efeito da própria isquemia. Esta característica também pode afetar a membrana externa da mitocôndria do SNC. Assim, em situações normais a hexoquinase encontra-se parcialmente inserida na membrana externa da mitocôndria. Com o aumento da fluidez da membrana ela poderia se desprender, prejudicando o mecanismo controlador da glicólise (11, 12, 13, 14). A sensibilidade da etapa de reversão do swelling à Alameticina indica que se trata de um fenômeno biológico dependente de assimetria iônica nos dois lados da membrana e não um fenômeno óptico genérico. Variações de absorbância causadas por alterações conformacionais de macromoléculas não se mostrariam sensíveis à ação da alameticina.

As mitocôndrias do cérebro apresentam uma instalação extremamente rápida da reversão do swelling. O experimento no qual foi reduzida a concentração de succinato à metade, serviu para caracterizar nas mitocôndrias do cérebro a instalação muito rápida do swelling seguida de rápida reversão. Na concentração usual com a técnica empregada apenas a reversão pode ser medida.

 

 

 

 

 

Abstract: Cerebral ischemia has been extensively studied in order to obtain effective therapeutic measures that might minimize its effects, since a large number of clinical or surgical patients frequently suffer irreversible consequences of this condition.

The choice of a satisfactory experimental model to be used in research on neuroprotective agents has been the basis of these studies.

In the present investigation, the cat was chosen as an experimental model of ischemia and the condition was evaluated on the basis of two parameters, i.e., mitochondrial respiration and swelling.

The animals used in the experiment (N = 32) were divided into four groups; three groups of 10 animals each were submitted to progressively increasing periods of ischemia (15, 30 and 60 minutes), and the last group (N = 2) was not submitted to ischemia.

Clear changes in the curves of energized mitochondrial swelling were observed in the animals submitted to 60 minutes of ischemia when the ischemic side was compared to the control, and this occurrence was even clearer when the antibiotic alameticin was added during the laboratory assays of swelling.

It is possible to find these conclusions: swelling is an indicator of mitochondrial differentiation between tissues; brain mitochondrion when exposed to effects of alameticin presents a different sensibility if is comparison to other tissues; brain mitochondria submitted to ischemia during 60 minutes became more sensibility to alameticin; and finally, brain mitochondria have an extremely fast installation of reversion swelling.

 

 

Referências

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1 Trabalho realizado nos Laboratórios de Cirurgia Experimental e de Bioquímica dos Departamentos de Cirurgia e Anatomia e Bioquímica e Imunologia da FMRP-USP.
2
Aluno de Pós-graduação junto ao Departamento de Cirurgia e Anatomia da FMRP-USP.
3
Professor Associado do Departamento de Bioquímica e Imunologia da FMRP-USP.
4
Professor Titular do Departamento de Cirurgia e Anatomia da FMRP-USP.

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