ANTÍGENO NUCLEAR DE PROLIFERAÇÃO CELULAR (PCNA) EM CARCINOMA DE CÉLULAS TRANSICIONAIS DE BEXIGA

PROLIFERATIVE NUCLEAR CELL ANTIGEN (PCNA) EXPRESSION IN THE URINARY TRANSITIONAL CELL CARCINOMA

ANTÍGENO NUCLEAR DE PROLIFERAÇÃO CELULAR (PCNA) EM CARCINOMA DE CÉLULAS TRANSICIONAIS DE BEXIGA¹

PROLIFERATIVE NUCLEAR CELL ANTIGEN (PCNA) EXPRESSION IN THE URINARY TRANSITIONAL CELL CARCINOMA

Neto J. A. D.², Martins A. C. P.³, Maggione G.⁴,

Tucci Jr S.³, Cologna A. J.³, Suaid H. J.³

Resumo: O antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA) foi descrito como marcador da atividade proliferativa. Correlacionamos a marcação do PCNA com a evolução dos pacientes com carcinoma de células transicionais de bexiga.

Revisamos 90 pacientes do HC-FMRP-USP de 1980-2000; com idade variando de 29 a 93 anos e média de 71 anos; sendo 77,8% homens e 22,2% mulheres; seguimento médio de 55 meses (2-231 meses). Constatamos 50% de tumores grau I, (32,2%) grau II e 17,8% grau III; estadiados em pTA-60%, pT1-8,9% e >pT1 31,1%.

Utilizamos o anticorpo primário Monoclonal Mouse Anti-Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA) Clone PC10 (DAKO). Foram contadas 500 células (X400), e utilizado ponto de corte de 50%.

A análise estatística foi realizada com o teste de Mann-Whitney. Kaplan-Meier e Logrank

Oitenta e sete tumores (96,66%) expressaram PCNA (mediana 72.5%, média 60,16%).

Observamos diferença não significativa (P=0,39) na imunomarcação do PCNA entre tumores pT2-4 e pTA-1. A comparação de medias entre G1 e G2 (P=0,087), G1 e G3 (P=0,11) e entre G2 e G3 (P=0,66) não mostraram significado estatístico,assim como entre tumores com recidiva e sem recidiva (P=0,84).

Os indivíduos PCNA positivos não tiveram intervalo livre de doença significativamente diferente (P=0,86); entretanto foi significativa a diferença nas curvas de sobrevida (P=0,003) e nas curvas de intervalos livres de metástase (P=0,01).

A expressão imunohistoquímica do PCNA não foi efetiva para diferenciar os tumores mais avançados e agressivos, assim como para predizer recidivas. Desta forma, apesar da correlação com o tempo livre de metástase e a sobrevida, não mostrou utilidade prática.

Descritores: PCNA, Bexiga, Células transicionais, Carcinoma

Key Words: PCNA, Bladder, Transitional cell, Carcinoma

1. Introdução: O carcinoma de células transicionais de bexiga (CCT) é um tumor agressivo e de comportamento individual que não pode ser previsto com segurança com base em exames histopatológicas convencionais⁵. Devido às diversas opções terapêuticas com potenciais variados de cura, assim como de causar efeitos colaterais, é importante selecionar os pacientes em termos de risco de recorrência, invasão, metástase e morte pelo câncer. Para isso teríamos de contar com outros marcadores tumorais dotados de previsão de risco mais preciso. Alguns marcadores moleculares têm sido estudados com esse objetivo. Dentre eles pode-se mencionar o antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA) que é uma proteína de 36 kD associada à atividade proliferativa¹⁵, sintetizada durante a interfase e que desaparece no final da mitose¹.

Nosso objetivo é testar a hipótese de que o índice proliferativo dos tumores de bexiga, medido com a expressão do PCNA, fornece informações adicionais aos critérios patológicos convencionais na determinação da evolução do CCT.

2. Métodos: POPULAÇÃO DE PACIENTES: Foram estudados 90 pacientes, sendo 70 (77,8%) do sexo masculino e 20 (22,2%) do sexo feminino, com idade média de 71 anos e que variou de 29 a 93 anos, operados no HC-FMRP-USP no período de 1980-2000. Em 62 pacientes os tumores eram superficiais e foram tratados com ressecção transuretral. Nos tumores superficiais multifocais e/ou de médio e alto grau associou-se BCG tópico (50mg/semana por três semanas). Nos tumores invasivos localizados o tratamento consistiu em cistectomia radical com derivação urinária, e nos disseminados o tratamento paliativo foi feito com quimioterapia associada ou não à radioterapia. O tempo de seguimento médio foi de 55 meses (2-231 meses). Constatamos 45 (50%) tumores com grau I (G1), 29 (32,2%) com grau II (G2) e 16 (17,8%) com grau III (G3). Os estádios iniciais dos tumores foram: pTa - 54 (60%), pT1 - 8 (8,9%) e maiores que pT1 - 28 (31,1%).

Imunohistoquímica: As lâminas das peças cirúrgicas foram revistas na coloração hematoxilina-eosina para seleção das áreas de melhor representatividade tumoral com seus respectivos blocos de parafina arquivados no Departamento de Patologia do HC-FMRP-USP. Secções de 4µm foram desparafinizados com xilol e rehidratadas em álcoois decrescentes. Após recuperação antigênica com tampão citrato e aquecimento em "steamer" fez-se inativação da peroxidase endógena com água oxigenada (H₂0₂ a 3%), os cortes foram incubados com soro normal de cavalo na temperatura ambiente por 20 minutos, com anticorpo primário anti-PCNA (Clone PC10 - DAKO) na diluição 1/200 por 2 horas, depois com o anticorpo secundário anti-camundongo (DAKO) na diluição 1/200 por 30 minutos e subseqüentemente com streptavidin (Dako) diluição 1/100 por 30 minutos. Finalmente, utilizamos a diaminobenzidina como cromógeno e contracoramos com hematoxilina de Harris por 30s. Utilizamos sempre lavagens com salina fosfato tamponada (PBS, PH7,4) entre os passos.

Contagem de células marcadas: Todas as lâminas foram examinadas por dois observadores, simultaneamente, utilizando aumento de 400X, e pelo menos 500 células foram contadas em campos bem preservados de tumores, sem conhecimento prévio de suas características. O grau de expressão do PCNA foi calculado como porcentagem de células marcadas com o anticorpo entre as células contadas.

Análise estatística: A expressão do PCNA e os parâmetros clínico-patológicos foram comparados entre todos os pacientes. Distribuições de freqüência foram testados com o teste não paramétrico de Mann-Whitney. Intervalos livres de doença, livre de metástase e de sobrevida foram definidos como o tempo entre o diagnóstico e a data da recorrência, metástase e morte devido ao câncer, respectivamente, e o ponto final para os demais pacientes foi a data da última cistoscopia. O método de Kaplan-Meier (21) foi utilizado para comparar estes eventos relacionados com o tempo, e o teste log-rank (18) para comparar as curvas calculadas através de computador. Para construir as curvas de intervalo livre de doença, livre de metástase, e tempo de sobrevida usamos como ponto de corte o nível de 50% de células marcadas, conforme recomendação da literatura^3,10,22.

3. Resultados: A expressão do PCNA variou de zero a >80% das células (mediana 72,5%, média 60,1%±24,4), sendo 87 tumores (96,6%) PCNA-positivos.

Observamos diferença não significativa (P=0,39) na imunomarcação do PCNA entre tumores invasivos (Tabela 1). Também não houve associação significativa entre o PCNA e o grau dos tumores. A comparação das médias de marcação entre os tumores G₁ e G₂ (P=0,087), G₁ e G₃ (P=0,11) e entre G₂ e G₃ (P=0,66) não mostrou diferença significante. Tumores que recidivaram mostraram expressão do PCNA semelhante à daqueles sem recidiva (P=0,84).

A incidência de recorrência dos tumores superficiais após a ressecção transuretral (Figura 1) foi independente da expressão do PCNA (p=0,6).

A proporção de pacientes PCNA-positivos que evoluíram para metástases (Figura 2) foi significativamente maior que nos pacientes PCNA-negativos (p = 0,01).

A sobrevida dos pacientes PCNA-negativos (Figura 3) foi significativamente maior que a daqueles com tumores positivos (P=0,003).

Discussão: O alto índice de positividade encontrado nos tumores aqui estudados, também foi descrito por outros autores^2,3,8,10, e foi considerado causa de baixa sensibilidade para pesquisar índice de proliferação, quando comparado a outros marcadores^3,10.

Apesar de vários autores terem demostrado correlação positiva entre a marcação com PCNA e estadio^2,6,7,22 ou grau^{2,6,7,10,14,20,22}, em nosso trabalho e em outros da literatura, tal associação não foi encontrada^3,8,10,11,23.

A grande maioria dos estudos não mostrou diferença significativa na marcação com PCNA entre os tumores superficiais que recidivaram daqueles que não recidivaram^2,4,6,22,23. Poucos trabalhos mostraram tal correlação⁷.

A correlação estatisticamente significativa entre a taxa de sobrevida^{2,4,6,9,11,12,13,20} e o tempo livre de metástase^4,12,13 encontrada aqui, está bem descrita na literatura.

Shiina et al.²⁰ demonstraram que a marcação com PCNA, em CCT, é um fator preditivo de sobrevida independentemente, muito embora tenha correlação positiva com grau e com a progressão da doença. Inagaki et al.⁶ estudaram 128 pacientes e também encontraram correlação entre a marcação do PCNA e o grau, o estádio e a sobrevida, mas não com a recorrência. Chen et al.² observaram 95,8% de marcação entre 48 tumores e demostraram as mesmas correlações (estadio, grau, sobrevida), sem significado para recorrência. Lavezzi et al.¹¹ compararam o índice de marcação do PCNA em 177 tumores pT1 e não acharam correlação com o grau, mas obtiveram boa correlação com a sobrevida. Ioakim et al.⁷ encontraram correlação com grau, estádio e taxa de recorrência em 70 pacientes. Hattori et al.⁴ pesquisaram 56 pacientes, e observaram que o PCNA elevado prediz menor sobrevida e maior índice de metástase, e ao contrário não diferenciou os tumores que recidivaram. Sumiyoshi et al.²² demonstraram correlação com estádio e grau, exceto com recorrência.

As diferenças observadas entre as diversas pesquisas podem resultar de variações metodológicas, estado de conservação das peças ou da amostragem.

Conclusões: A expressão imuno-histoquímica do PCNA não mostrou relação com o grau, estádio local (pT) e índice de recorrência de tumores superficiais. Já os CTT, com mais de 50% das células marcadas, apresentaram agressividade maior, medida em termos de progressão para metástases e óbito, tanto em tumores superficiais quanto para o conjunto de pacientes com tumores superficiais ou invasivos.

Abstract: Proliferating cell nuclear antigen (PCNA) expression was described as marker of the proliferative activity in urothelial tumors. We compared the PCNA immunostaining index with the outcome of patients with bladder cancer. We revised 90 patients, with age varying from 29 to 93 years (mean 71 yrs), being 77.8% men and 22.2% women; mean follow-up of 55 months (2-231 months). Fifty per cent of tumors were grade I; 32.2% grade II and 17.8% grade III. Primary tumor stage was: invasive (> >pT1=31.1% and superficial (pTA-1=68.9%). Eighty-seven tumors (96.6%) expressed PCNA (median 72.5%, mean 60.1%). The mean PCNA index was not different (p = 0.39) in superficial or invasive tumors. The comparison of immunostaining mean values between G1/G2 (p = 0.087), /G1/G3 (p = 0.11) and G2//g3 (p = 0.66) was not statistically significant, as well among recurring and non-recurring tumors (p = 0.84) but PCNA expression correlated with survival rate (p = 0.003) and metastases free intervals (p = 0.01) but not with recurrent free intervals (p = 0.86). In conclusion, PCNA over expression correlated with survival and metastasis free intervals, but was not significant to differentiate invasive stages, agressive grades and recurring tumors.

• 1. Celis JE, Celis A. Cell cycle-dependent variations in the distribution of nuclear cyclin proliferating cell nuclear antigen in cultured cells: Subdivision of S phase. Proc Natl Acad Sci 1985;82:3262-6.
• 2. Chen G, Lin MS, Li RC. Expression and prognostic value of proliferating cell nuclear antigen in transitional cell carcinoma of the urinary bladder. Urol Res. 1997;25(1):25-30.
• 3. Cohen MB, Waldman FM, Carroll PR, Kerschmann R, Chew K, Mayall BH. Comparison of five histopathologic methods to assess cellular proliferation in transitional cell carcinoma of the urinary bladder. Hum Pathol 1993 Jul;24(7):772-8.
• 4. Hattori K, Uchida K, Akaza H, Koiso K, Nemoto R, Harada M. Proliferating cell nuclear antigen cyclin in human transitional cell carcinoma. J Urol 1995 Feb;75(2):162-6.
• 5. Heney NM, Ahmed S, Flanagan MJ, et al. Superficial bladder cancer: progression and recurrence. J Urol 1983;130:1083-6.
• 6. Inagaki T, Ebisuno S, Uekado Y, et al. PCNA and p53 in urinary bladder cancer: correlation with histological findings and prognosis. Int J Urol. 1997;4(2):172-7.
• 7. Ioakim-Liossi AG, Karakitsos PJ, Pantazopoulos D, Aroni KG, Athanossiadou P. Image cytometric DNA analysis and proliferating cell nuclear antigen (PCNA) expression in transitional cell carcinoma of the bladder. Cancer Detect Prev 1999;23(5):401-7.
• 8. Knuechel R, Burgau M, Rueschoff J, Hofstaedter F. Proliferating cell nuclear antigen in normal urothelium and urothelial lesions of the urinary bladder: a quantitative assessment using a true color image analysis system. Virchows Arch B Cell Pathol Incl Mol Pathol 1993;64(3):137-44.
• 9. Korkolopoulou P, Christodoulou P, Kapralos P, Exarchakos M, Bisbiroula A, Hadjiyannakis M, Georgountzos C, Thomas-Tsagli E. The role of p53, MDM2 and c-erb B-2 oncoproteins, epidermal growth factor receptor and proliferation markers in the prognosis of urinary bladder cancer. Pathol Res Pract. 1997;193(11-12):767-75.
• 10. Kruger S, Muller H. Correlation of morphometry, nucleolar organizer regions, proliferating cell nuclear antigen and Ki67 antigen expression with grading and staging in urinary bladder carcinomas. Br J Urol 1995;75(4):480-4.
• 11. Lavezzi AM, Terni L, Matturri L. PCNA immunostaining as a valid alternative to tritiated thymidine-autoradiography to detect proliferative cell fraction in transitional cell bladder carcinomas. In Vivo 2000 May-Jun;14(3):447-51.
• 12. Lipponen PK, Eskelinen MJ. Cell proliferation of transitional cell bladder tumours determined by PCNA/cyclin immunostaining and its prognostic value. Br J Cancer 1992;66(1):171-6.
• 13. Lipponen PK, Eskelinen MJ. Cell proliferation of transitional cell bladder cancer determined by PCNA/cyclin immunostaining. A histopathological description. Anticancer Res 1992 Mar-Apr;12(2):577-83.
• 14. Malmstrom PU, Wester K, Vasko J, Busch C. Expression of proliferative cell nuclear antigen (PCNA) in urinary bladder carcinoma. Evaluation of antigen retrieval methods. APMIS 1992;100(11):988-92.
• 15. Miayachi K, Fritzler MJ, Tan EM. Autoantibody to a nuclear antigen in proliferating cells. J Immunol 1978;121:2228-34.
• 16. Mulder AH, Van Hootegen JCSP, Sylvester R, et al. Prognostic factors in bladder carcinoma: Histologic parameters and expression of a cell cycle related nuclear antigen (Ki-67). J Pathol 1992;166:37-43.
• 17. Okamura K, Miyake K, Koshikawa T, et al. Growth fractions of the transitional cell carcinomas of the bladder defined by the monoclonal antibody Ki-67. J Urol 1990;144:875-8.
• 18. Peto R, Pike MC, Armitage P, Breslow NE, Cox DR, et al. Design and analysis of randomized clinical trials requiring prolonged observation of each patient. II. Analysis and examples. Br J Cancer 1977;35:1-39.
• 19. Rudolph P, Peters J, Lorenz D, et al. Correlation between mitotic and Ki-67 labelling indices in paraffin embedded carcinoma specimens. Hum Pathol 1998;29:1216-22.
• 20. Shiina H, Igawa M, Nagami H, Yagi H, et al. Immunohistochemical analysis of proliferating cell nuclear antigen, p53 protein and nm23 protein, and nuclear DNA content in transitional cell carcinoma of the bladder. Cancer 1996;78(8):1762-74.
• 21. Simon RM. Design and conduct of clinical trials. In: DeVita VT Jr., Hellman S, Rosemberg SA. Cancer principles and pratice of oncology. Volume 1. 3^rd edition. Philadelphia: Lippincott, 1989:396-420.
• 22. Sumiyoshi Y, Inoue Y, Akiyama M.[Immunohistochemical investigation of proliferating cell nuclear antigen in bladder cancer].Nippon Hinyokika Gakkai Zasshi 1993;84(9):1643-8.
• 23. Wada T, Shimabukuro T, Kurisu H, Shameem IA, Yoshihiro S, Matsuyama H, Naito K, Hashimoto O, Tanaka K. [Expression of proliferating cell nuclear antigen in superficial bladder cancerapplication to paraffin-embedded tissue sections]. Hinyokika Kiyo 1993;39(4):313-9.

1

Trabalho realizado na Divisão de Urologia, Departamento de Cirurgia e Anatomia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (FMRP-USP)

2

Médico Residente do Departamento de Cirurgia e Anatomia da FMRP-USP

3

Professores junto à Divisão de Urologia do Departamento de Cirurgia e Anatomia da FMRP-USP

4

Médico Assistente do Hospital das Clínicas da FMRP-USP

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  11 Jun 2002
• Data do Fascículo
  2001