Pele de Rana Catesbeiana como curativo biológico oclusivo no tratamento de feridas cutâneas produzidas em cães: Alterações macroscópicas e microscópicas resultantes da interação desses tecidos. Estudo preliminar

Resumos

Objetivo: Investigar o efeito da pele de rã como curativo oclusivo em feridas cutâneas. Métodos: Quinze cães mestiços, de ambos os sexos, pesando 9,45 ± 2,62kg, sob anestesia geral, foram submetidos a 34 lesões cutâneas quadradas, com 400mm² de área, localizadas nas regiões toracodorsal direita e esquerda. Nas 17 lesões da região toracodorsal direita, após descongelamento, peles de Rana catesbeiana preservadas em solução de NaCl e glicerol sob temperatura de --4ºC foram empregadas como curativo oclusivo (Grupo Teste). As 17 lesões da região toracodorsal esquerda foram tratadas com gaze umedecida em solução de NaCl a 0,9% (Grupo Controle). As freqüências de feridas cicatrizadas (FC) e não cicatrizadas (FNC) e a incidência de destruição de peles de rã foram analisadas. Cinco séries de amostras de peles de rã foram examinadas histologicamente até o aparecimento de destruição. Características histológicas do processo inflamatório das feridas foram avaliadas através dos percentuais de intensidade de Polimorfonucleares (PPMN), Mononucleares (PM) e Infiltrado Linforreticular (PIL). O testes t de Student bicaudal e qui-quadrado (chi²) foram aplicados quando indicados. Resultados: 1) Não houve diferenças significativas nas freqüências de FC e FNC entre os Grupos estudados; 2) Houve incidência de destruição de peles de 31,00%, limitada à área de contato com a ferida; tendência para aumento da incidência de destruição durante o período de estudo foi sugerida; 3) As alterações histológicas das peles de rã, caracterizadas por infiltrado constituído sobretudo por mononucleares, bem como por destruição das camadas de Malpighi e subjacentes, foram observadas na área de contato com a ferida canina; 4) Os valores do PPMN não foram estatisticamente diferentes entre os grupos. Prevalência do PM e exclusividade do PIL no Grupo Teste foram verificadas. Conclusão: A pele de rã não é efetiva no tratamento de feridas caninas e a rejeição foi sugerida como um fator causal.

Curativos biológicos; Pele; Cicatrização de feridas; Cães

Objective: To study the effect of frog skin as occlusive dressing on cutaneous wounds. Methods: Fifteen mongrel dogs, of both sexes, weighing 9.45 ± 2.62 kg, under general anesthesia, were submitted to 34 square shaped skin lesions, with 400 mm² of area, on both right and left thoracodorsal surfaces. After defrosting, Rana catesbeiana skins preserved in a ClNa and glycerol solution at --4ºC were used as biological occlusive dressing on 17 lesion located in the right thoracodorsal region (Test Group). The 17 lesions on the left thoracodorsal side were treated with gauze moistened in a 0.9% ClNa solution (Control Group). The frequency of healed (HW) and non-healed wounds (NHW), and the incidence of frog skin destruction, were analyzed. Five sequences of frog skin samples were histologically examined till tissue destruction started to appear. Inflammatory histological findings were evaluated by percentage of intensity of Polymorphonuclear cells (PPMNC), Mononuclear cells (PMC), and lymphoreticular infiltration (PLI). Two tailed Student's t test and chi square test (chi²) were used as indicated. Results: 1) There was no significant difference in HW and NHW between Groups; 2) There was a 31.00% incidence of frog skin destruction limited to the surface in contact with dog wounds. An increased tendency of destruction was perceived during the studied period; 3) Histological changes of frog skin, characterized by tissue infiltration mainly from mononuclear cells, and by destruction of Malpighi and subjacent layers, were observed at the surface, limited to the wound contact area; 4) PPMNC values attained were not statistically different between groups. In the Test Group PM prevailed and PLI was exclusively seen. Conclusion: Frog skin is ineffective in treatment of canine cutaneous wounds and rejection was suggested as a causative factor.

Biological dressings; Skin; Wound healing; Dogs

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¾ ARTIGO ORIGINAL

PELE DE RANA CATESBEIANA COMO CURATIVO BIOLÓGICO OCLUSIVO NO TRATAMENTO DE FERIDAS CUTÂNEAS PRODUZIDAS EM CÃES. ALTERAÇÕES MACROSCÓPICAS E MICROSCÓPICAS RESULTANTES DA INTERAÇÃO DESSES TECIDOS. ESTUDO PRELIMINAR

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Suyiene Cordeiro Falcão²

Silvia Limongi Lopes³

Antônio Roberto de Barros Coelho⁴

Edvaldo Lopes de Almeida⁵

Falcão SC, Lopes SL, Coelho ARB, Almeida EL. Pele de Rana catesbeiana como curativo biológico oclusivo no tratamento de feridas cutâneas produzidas em cães: alterações macroscópicas e microscópicas resultantes da interação desses tecidos. Estudo preliminar. Acta Cir Bras [serial online] 2002 Maio-Jun;17(3). Disponível em URL: http://www.scielo.br/acb.

RESUMO ¾ Objetivo: Investigar o efeito da pele de rã como curativo oclusivo em feridas cutâneas. Métodos: Quinze cães mestiços, de ambos os sexos, pesando 9,45 ± 2,62kg, sob anestesia geral, foram submetidos a 34 lesões cutâneas quadradas, com 400mm² de área, localizadas nas regiões toracodorsal direita e esquerda. Nas 17 lesões da região toracodorsal direita, após descongelamento, peles de Rana catesbeiana preservadas em solução de NaCl e glicerol sob temperatura de ¾4ºC foram empregadas como curativo oclusivo (Grupo Teste). As 17 lesões da região toracodorsal esquerda foram tratadas com gaze umedecida em solução de NaCl a 0,9% (Grupo Controle). As freqüências de feridas cicatrizadas (FC) e não cicatrizadas (FNC) e a incidência de destruição de peles de rã foram analisadas. Cinco séries de amostras de peles de rã foram examinadas histologicamente até o aparecimento de destruição. Características histológicas do processo inflamatório das feridas foram avaliadas através dos percentuais de intensidade de Polimorfonucleares (PPMN), Mononucleares (PM) e Infiltrado Linforreticular (PIL). O testes t de Student bicaudal e qui-quadrado (c²) foram aplicados quando indicados. Resultados: 1) Não houve diferenças significativas nas freqüências de FC e FNC entre os Grupos estudados; 2) Houve incidência de destruição de peles de 31,00%, limitada à área de contato com a ferida; tendência para aumento da incidência de destruição durante o período de estudo foi sugerida; 3) As alterações histológicas das peles de rã, caracterizadas por infiltrado constituído sobretudo por mononucleares, bem como por destruição das camadas de Malpighi e subjacentes, foram observadas na área de contato com a ferida canina; 4) Os valores do PPMN não foram estatisticamente diferentes entre os grupos. Prevalência do PM e exclusividade do PIL no Grupo Teste foram verificadas. Conclusão: A pele de rã não é efetiva no tratamento de feridas caninas e a rejeição foi sugerida como um fator causal.

DESCRITORES ¾ Curativos biológicos. Pele. Cicatrização de feridas. Cães.

INTRODUÇÃO

Elementos existentes na Natureza podem constituir materiais alternativos para o tratamento local das feridas devido aos custos elevados dos curativos oclusivos, sintéticos ou biossintéticos¹.

Materiais biológicos, empregados como curativo oclusivo, têm sido recomendados por vários investigadores por possuírem propriedades antibacteriana e analgésica, acelerarem a formação de tecido de granulação e epitelização, propiciarem barreira à invasão bacteriana, assim como promoverem retenção do exsudato, características admitidas como benéficas para a cicatrização^2,3.

Tecidos biológicos de origem animal, como membrana amniótica humana e eqüina^{1,4,5,6,7,8,9}, pele de cadáver humano^10,11,12,13, pele de cão¹⁴, pele de cobaia¹⁵, pele de porco⁶, placenta humana⁷, pericárdio bovino^16,17 e eqüino¹⁸, membrana de queratinócitos humanos autólogos cultivados^16,19, pele de anfíbio^3,20,21 e camada submucosa de intestino delgado de porco², têm sido empregados como curativo biológico oclusivo em feridas cutâneas.

No entanto, os tecidos de origem biológica obtidos a partir de animais da mesma espécie ou de espécies diferentes comportam-se, do ponto de vista imunológico, respectivamente, como materiais alogênicos e xenogênicos, podendo induzir rejeição, constituindo assim fator que restringe a eficácia e o tempo de uso como curativo ou enxerto^{10,11,15,16,22,23,24}.

O presente trabalho, etapa de uma linha de pesquisa, tem como objetivo o estudo do efeito da pele de Rana catesbeiana, usada como curativo biológico oclusivo, sobre a cicatrização de feridas produzidas em cães. Algumas alterações macroscópicas e microscópicas decorrentes da interação entre peles de rã dessa espécie e as superfícies cruentas das feridas caninas constituíram também objeto de estudo e observação.

MÉTODOS

Foram utilizados 15 cães adultos, mestiços, sendo oito fêmeas e sete machos, pesando 9,45 ± 2,62kg. Como medicação pré-anestésica foi administrado sulfato de atropina a 0,25%, na dose 0,044mg/kg. A anestesia foi induzida com xilazina na dose 1mg/kg, por via intramuscular. A manutenção anestésica foi obtida com cetamina na dose de 2,0 a 4,0mg/kg por via intravenosa²⁵. Durante os experimentos, os animais receberam 250ml de solução de NaCl a 0,9% por via intravenosa.

Modelo experimental e grupos estudados

A exérese do retalho de pele total dos cães foi realizada em local previamente demarcado com lápis dermográfico em torno de moldes quadrados de película de RX, medindo 20mm de lado. Desse modo, em 14 animais obteve-se uma ferida de cada lado da região toracodorsal com área de 400mm², distando 8cm da coluna vertebral. Em um animal as lesões tegumentares, em número de três, foram produzidas de cada lado da região toracodorsal, distando 10cm entre si e 8cm da coluna vertebral.

Assim, foram estudadas 17 lesões cutâneas produzidas na região toracodorsal direita e 17 na região toracodorsal esquerda. As feridas toracodorsais direitas foram recobertas com retalho de pele de rã de tamanho tal que ultrapassasse as margens da lesão em aproximadamente 1cm (Grupo Teste), enquanto as feridas toracodorsais esquerdas foram tratadas com gaze umedecida em solução de NaCl a 0,9% (Grupo Controle). Ambos os curativos foram sucessivamente recobertos por gaze seca esterilizada, fixadas com esparadrapo, envoltos por faixa de crepom n^o 10 e, finalmente, contidos com vestimenta tubular de malha de algodão. Em todos os animais foram empregados colares elizabetanos. Nos dois grupos, a troca de curativos ocorreu em prazo de 24 horas em 18 feridas (nove de cada Grupo) e de 48 horas em 16 lesões (oito de cada Grupo). Os curativos eram observados diariamente.

Obtenção, acondicionamento e preservação das peles de rã

As peles de rã foram colhidas durante abate em ranário. Em seguida procedia-se à limpeza da pele, observando-se os padrões de assepsia, através de lavagem exaustiva com solução fisiológica e retirada de restos de tecidos não pertencentes à camada cutânea com gaze. Retalhos de pele dorsal e ventral foram acondicionados em recipientes de vidro esterilizados, imersos numa solução composta de 85% de cloreto de sódio a 0,9% e de 15% de glicerol a 99,5%, estocados à temperatura de -4ºC, durante três meses. Para utilização da pele, procedeu-se ao descongelamento rápido em banho-maria à temperatura de 60ºC.

Parâmetros avaliados e observados

Cicatrização das feridas

As freqüências de Feridas Cicatrizadas (FC) e Não Cicatrizadas (FNC) foram comparadas entre os Grupos estudados, ao final de 28 dias, atendendo-se ao conceito de que a cicatrização de feridas cutâneas planas completa-se por combinação dos processos de contração e epitelização.

Características macroscópicas da pele de rã

As características macroscópicas dos curativos de pele de rã, constituídas por atributos denominados de Integridade do Curativo^* e Destruição do Curativo^** foram avaliadas nos períodos de zero ao 7^o DPO (1^o Período), do 7^o ao 14^o DPO (2^o Período) e do 14^o ao 28^o DPO (3^o Período).

Observações microscópicas do processo de destruição da pele de rã

Um retalho de pele de rã normal preservada, não utilizada como curativo, foi submetido a exame microscópico. Em cinco cães (Animais n^os 8, 9, 10, 11 e 14), seqüências de retalhos de pele de rã entre o 1^o e o 5^o DPO, até o aparecimento dos primeiros sinais macroscópicos de adelgaçamento ou destruição, foram submetidos a exames histológicos. Observações microscópicas foram também realizadas em retalho de pele de rã, no 28⁰ DPO. Adotou-se a hematoxilina-eosina (HE) como meio de coloração e microscopia óptica como técnica de leitura.

Características microscópicas do processo inflamatório nas feridas

Foram realizadas biópsias das feridas incluindo-se a transição entre a pele normal e a área cruenta, no 7^o, 14^o e 28^o DPO. Após processamento, as lâminas foram coradas pela hematoxilina-eosina (HE), para estudo através de microscopia óptica. As características histológicas do processo inflamatório nas feridas dos Grupos Teste e Controle foram avaliadas, semiquantitativamente, por escores, e posteriormente transformados em valores de Percentuais de Intensidade de Polimorfonucleares (PPMN), de Mononucleares (PM) e de Infiltrado Linforreticular (PIL), adotando-se o seguinte critério: (-) = 0%; (+) = 25%; (++) = 50%; (+++) = 75%; e (++++) = 100%. Realizou-se estudo comparativo em períodos correspondentes e ao final de 28 dias de observação, entre os Grupos Teste e Controle.

Análise estatística

Para análise estatística dos dados de freqüência de cicatrização das feridas e de destruição da pele de rã foi aplicado o teste do qui-quadrado (c²), com probabilidade de erro pretendida de p £ 0,05. Para análise estatística dos valores dos percentuais de intensidade de Polimorfonucleares (PPMN), Mononucleares (PM) e Infiltrado Linforreticular (PIL) na ferida, foi utilizado o teste t de Student bicaudal, com probabilidade de erro pretendida de p £ 0,05.

Os experimentos foram conduzidos de acordo com recomendações contidas no International Principles for Biomedical Research Involving Animal²⁶. Após 28 dias, oito animais foram doados, enquanto sete foram mantidos com finalidade de estudos imunológicos posteriores.

RESULTADOS

Estudo da cicatrização das feridas

Constatou-se não haver diferenças significativas nas freqüências de Feridas Cicatrizadas (FC) e Não Cicatrizadas (FNC), durante 28 dias (Figura 1).

Estudo das características macroscópicas da pele de rã

A destruição incompleta (adelgaçamento) ou completa (perfuração) dos retalhos de pele de rã, restrita à área de contato com a superfície cruenta da ferida produzida nos cães, ocorreu em 31,00% de 171 retalhos que não se deslocaram totalmente do local da ferida (Tabela 1) (Figura 2-A).

Em apenas dois animais dentre 15 (cães n^os 1 e 4) não se observou destruição da pele de rã ao longo do período de observação. O episódio mais precoce de destruição ocorreu no 3^o DPO (Cão n^o 13), enquanto o episódio mais tardio foi detectado no 8^o DPO (Cão n^o 12). Nos animais em que se observou destruição da pele de rã, houve reprodução desse fenômeno em até 11 oportunidades (Cão n^o 15), durante o período de avaliação. Em um caso, a pele de rã apresentou três áreas distintas de destruição, tendo o retalho sofrido deslocamento parcial, permitindo que houvesse locais diversos de exposição da pele de rã à superfície da ferida (Cão n^o 9, 12^o DPO) (Figura 2-B).

Em nove feridas produzidas no Grupo Teste, os episódios de destruição da pele de rã ocorreram em tempo inferior a 24 horas, em número de 42, enquanto em oito feridas tais episódios aconteceram entre 24 e 48 horas, em número de 11.

Observou-se, ainda, incidência de destruição de 22,35% no 1^o Período, de 34,48% no 2^o Período e de 50% no 3^o Período de observação (Tabela 1). Não foram constatadas diferenças estatisticamente significativas entre os valores das freqüências de Destruição do Curativo nas comparações realizadas entre o 1^o e o 2^o Períodos e entre o 2^o e o 3^o Períodos programados para estudo (Tabela 1). No entanto, verificou-se que os valores das freqüências de destruição da pele de rã foram significativamente maiores no 3^o do que no 1^o Período (Tabela 1).

Observações das características microscópicas do processo de destruição da pele de rã

Os exames microscópicos de uma série de peles de rã, iniciados por um exemplar de pele íntegra normal, não usada como curativo oclusivo (Figura 3), assim como por uma seqüência dessas peles, trocadas a cada 24h (1^o ao 5^o DPO), compreendida entre o primeiro contato com as feridas produzidas nos cães (animais n^os 8, 9, 10, 11 e 14) e os indícios macroscópicos de destruição (adelgaçamento ou ruptura), revelaram alterações constituídas por infiltração de polimorfonucleares e de mononucleares nas camadas dérmica e epidérmica, bem como por desintegração das camadas malpighiana e subjacente, de evolução progressiva, até a ruptura completa da pele dessa espécie de anfíbio (Figura 4A, B, C e D). Nessa série, as áreas de pele do ranídeo circunvizinhas à ferida e em contato com a pele íntegra do cão apresentaram processo inflamatório discreto e conservação da estrutura tecidual satisfatória (Figura 5). Achados equivalentes foram observados na pele de rã usada no cão n^o 3 no 28^o DPO (Figura 6A e B).

Estudo das características microscópicas do processo inflamatório nas feridas

Quando os percentuais de intensidade de polimorfonucleares nas feridas (PPMN) foram comparados em períodos correspondentes e no total de dias estudados, entre as lesões do Grupo Teste e do Grupo Controle, não houve diferenças estatisticamente significativas (Figuras 7 e 8). Constatou-se que os percentuais de intensidade de mononucleares (PM) nas feridas do Grupo Teste foram significativamente maiores que aqueles verificados nas feridas do Grupo Controle, no 1^o e 3^o Períodos e no total de dias estudados (Figuras 7 e 8). Embora não tenha havido diferença estatisticamente significativa em relação ao Grupo Controle, a presença de Infiltrado Linforreticular (PIL) na hipoderme das feridas dos cães foi detectada exclusivamente no Grupo Teste, nos períodos programados para estudo e no total de dias estudados (Figuras 7 e 8).

DISCUSSÃO

A inexistência de diferenças significantes entre freqüências de FC e FNC nos Grupos Teste e Controle (Figura 1) poderia refletir a influência do processo de destruição da pele de rã, tornando essa cobertura biológica pouco eficaz.

Na literatura consultada, foram encontrados apenas dois estudos experimentais sobre emprego de pele de anfíbios, como curativo biológico oclusivo, em lesões cutâneas. No primeiro, pele de Rana tigrina foi testada em feridas cutâneas produzidas cirurgicamente em ratos Wistar³. No segundo, pele de Rana catesbeiana foi usada em lesões cutâneas produzidas por queimadura em ratos dessa mesma linhagem²⁰. Em ambos os relatos houve cicatrização mais acelerada nas feridas tratadas com pele de rã, sem ocorrência de destruição desse tecido. Nesses estudos não foram referidos pré-tratamento da pele do ranídeo com objetivo de desvitalização tecidual ou atenuação antigênica. Por outro lado, não foi mencionado o emprego de processos para indução de tolerância por depleção linfocitária, pela administração de soro antilinfocítico ou por uso de drogas imunossupressoras^27,28, nos animais da linhagem estudada.

Na presente pesquisa, a relação entre a pele de rã utilizada como cobertura temporária e a área da ferida poderia ser considerada como uma interação entre tecidos viáveis de espécies diferentes, desde que nenhum processo que modificasse deliberadamente a estrutura da pele anfíbia foi empregado. O uso de glicerol a 15% na conservação da pele anfíbia teve como objetivo a proteção das células contra a hipotermia²⁹. Peles viáveis de Rana catesbeiana secretam um peptídeo (ranalexina) com propriedades antimicrobianas³⁰. A viabilidade do tecido poderia ser ainda inferida a partir da ação inibitória contra S. aureus e S. b-hemolítico observada, in vitro, em testes previamente realizados por nós, com discos de pele de Rana catesbeiana fresca ou conservada em solução contendo 85% de NaCl a 0,9% e 15% de glicerol a 99,5% em temperaturas de ¾4ºC e ¾196ºC³¹.

A ocorrência de destruição da pele de rã, de intensidade substancial (31,00%), caráter precoce, repetitivo e eventualmente múltiplo, restrita à área de contato com a ferida cutânea, presenciada na maioria dos animais (13 em 15) (Figura 2, A e B), cujo estudo estatístico sugeriu tendências de aumento ao longo do período de 28 dias (Tabela 1), poderia significar fenômeno relacionado com a interação imunológica entre tecidos biologicamente ativos. Observações relevantes, caracterizadas pelo aparecimento das primeiras destruições da pele de rã em intervalo de três a oito dias após contato com as feridas e de reprodução freqüente do fenômeno, poderiam significar processo de estimulação de anticorpos naturais preexistentes ou de prévia sensibilização dos cães por tecido viável entranho, constituindo, desse modo, fenômeno sugestivo de rejeição.

De modo geral, numa interação xenogênica, o reconhecimento de uma espécie por outra, através de anticorpos naturais (ACN) (preformados) ou induzidos (pré-sensibilização), guarda uma relação diretamente proporcional à distância filogenética existente entre as mesmas, permitindo assim a identificação de espécies discordantes em maior ou menor grau. Recentemente, vários autores têm admitido a necessidade da presença de células apresentadoras de antígenos (CAA) do receptor para o reconhecimento efetivo de xenoantígenos^28,32. Assim, o fenômeno de rejeição xenogênica poderia ser classificado como agudo, do tipo humoral ou celular.

Nos mamíferos, as células de Langerhans (CL), provavelmente oriundas de monócitos da medula óssea, localizadas no epitélio estratificado da pele, pertencentes ao grupo de células apresentadoras de antígeno (CAA), têm função de processar e apresentar moléculas antigênicas do complexo principal de histocompatibilidade (CPH) da classe II do tecido estranho aos linfócitos do receptor, dando início a resposta imunológica celular ou humoral, sendo tais células consideradas o componente mais periférico da via aferente do sistema imunológico^33,34. Essas células, também migram pela via aferente linfática até a paracortex dos linfonodos regionais, onde se interdigitam com diversos linfócitos T, simultaneamente, apresentando os antígenos trazidos da pele³⁵. Esses dados permitem inferir que a pele de mamíferos encontra-se habilitada para iniciar vários tipos de resposta imunológica. Tendo como base o distanciamento filogenético entre cães e rãs, podendo constituir uma relação discordante de grau provavelmente avançado, assim como a capacitação da pele de mamíferos em iniciar resposta imunológica humoral e celular, poder-se-ia cogitar que a destruição da pele anfíbia fosse conseqüência de rejeição xenogênica, circunstância esta não referida em outras espécies com relação discordante de grau presumivelmente menor^3,20.

Inicialmente, nos transplantes de pele, quando ainda não se encontra estabelecida a vascularização do enxerto, o tecido transplantado permanece em íntimo contato com os capilares linfáticos do tecido subjacente do receptor. Os linfócitos não sensibilizados para o processo de rejeição, trazidos pelo sangue do hospedeiro, encontram-se com moléculas antigênicas na interface do enxerto e a ferida, tornando-se sensibilizados após processamento nos gânglios linfáticos regionais, quando então retornam, por via sanguínea, como células efetoras, invadindo e proliferando no enxerto. Devido principalmente ao envolvimento do enxerto e dos linfonodos regionais, o processo é denominado de via de sensibilização periférica³⁴. Tal processo poderia também ocorrer em enxerto não vascularizado, como no caso dos curativos biológicos oclusivos de origem xenogênica, tendo em vista a presença de intenso infiltrado de células mononucleares, do receptor encontrado nas camadas dérmica e epidérmica da pele de rã, assim como pela desintegração dessas estruturas.

Durante o uso de pele de Rana catesbeiana como cobertura temporária de feridas produzidas por queimadura grave em humanos, conservada por congelamento, sem a preocupação de manter a viabilidade desse tecido, não foram relatados fenômenos de rejeição²¹. Por outro lado, a depressão imunológica encontrada em pacientes portadores de queimaduras extensas também poderia concorrer para o aumento de tolerância aos enxertos^36,37.

Vários tecidos de origem alogênica^11,12 ou xenogênica^{1,15,23,24,38},quando usados como curativo biológico ou mesmo como enxerto, são susceptíveis de desintegração por processo de rejeição. Nesses casos, para obter-se tolerância, o pré-tratamento desses materiais biológicos com glicerol a 85%^11,12, glutaraldeído²¹ ou hipotermia profunda (¾80 a ¾196^oC)¹⁵, assim como pela administração de drogas imunossupressoras como malononitrilamidas ou ciclosporina aos receptores^23,24, têm sido preconizados. O estado de imunodepressão adquirida do hospedeiro permite alongamento da sobrevida de enxertos cutâneos³⁹.

Outras estruturas biológicas como membrana amniótica humana e eqüina^4,8, por não possuírem células epiteliais que expressem moléculas antigênicas, não induzem rejeição. Recentemente, submucosa de intestino de porco, por constituir estrutura acelular, formada essencialmente de colágeno tipo I, tem sido empregada experimentalmente como curativo biológico, sem que fenômeno de rejeição tenha sido observado².

As alterações histológicas de destruição em comparação com a pele anfíbia normal (Figura 3) foram constituídas por infiltração de polimorfonucleares e de mononucleares nas camadas dérmica e epidérmica da pele de rã, bem como por desintegração dessas estruturas, de evolução progressiva (Figura 4A, B, C e D) e em correspondência com a área cruenta da ferida. Por outro lado, fora da área cruenta, constituída pela pele íntegra do cão, houve conservação satisfatória da estrutura original da pele de rã (Figura 5). Esses achados foram também observados no 28^o DPO (Figura 6A e B). Portanto, parece que interface formada pela pele de rã e o tecido desprovido de tegumento constitui condição primordial para o estabelecimento do fenômeno de destruição.

Quando os percentuais de intensidade de polimorfonucleares nas feridas (PPMN), em períodos correspondentes e no total de dias estudados, foram comparados entre as feridas do Grupo Teste e do Grupo Controle, não foram constatadas diferenças estatisticamente significativas (Figuras 7 e 8). Os polimorfonucleares não demonstram especificidade pelo antígeno, porém desempenham papel importante no processo inflamatório³⁵. Para justificar esses resultados, sugere-se ocorrência de processo inflamatório inicial não específico, decorrente do trauma, da fase inicial da cicatrização e da presença das peles de rã ou da gaze nas feridas dos cães, como tecidos estranhos.

A presença de intensa quantidade de mononucleares nas feridas, traduzidas pela constatação de percentuais de intensidade de mononucleares (PM) significativamente maiores nas feridas do Grupo Teste, no 1^o e 3^o Períodos e no total de dias estudados (Figuras 7 e 8), poderia caracterizar atividade imunológica. Os monócitos sanguíneos, quando transferidos para o tecido, transformam-se em macrófagos e são considerados como células assessoras da resposta imune, pertencentes ao sistema mononuclear fagocitário (SMF) e que realizam funções de fagocitose e processamento, bem como apresentação de moléculas antigênicas aos linfócitos T (resposta celular) e B (resposta humoral)⁴⁰. Como os macrófagos, os monócitos teciduais são também considerados células apresentadoras de antígenos (CAA) (HLA ¾ Classe II)³⁵.

A presença exclusiva de infiltrado linforreticular na hipoderme das feridas tratadas com pele de rã reforçaria a hipótese de imunorreatividade (Figuras 7 e 8).

Desse modo, poder-se-ia cogitar que a maior intensidade de mononucleares e a exclusividade de infiltrado linforreticular, nas feridas tratadas com pele de rã, poderiam significar atividade inflamatória de caráter imune.

Em virtude de o microambiente úmido propiciado pelos curativos oclusivos ser essencialmente proteolítico, além da ação estimuladora das proteinases sobre formas latentes de fatores de crescimento, bem como de sua atuação na quebra do tecido conectivo com objetivo de gerar peptídeos quimiotáxicos¹⁶, seria admissível supor que essas enzimas pudessem também desempenhar ação proteolítica sobre a cobertura constituída por tecido biológico. No entanto, o microambiente proteolítico é característico do fluido exsudativo das feridas nos estágios precoces da cicatrização¹⁶ e, neste caso, poderia não justificar a ocorrência de destruição total ou parcial da pele de rã, presenciada desde o 3^o até o 28^o DPO, ou seja, ocorrendo nos três períodos programados para estudo e, aparentemente, de caráter progressivo (Tabela 1).

Ação destrutiva sobre o tecido biológico usado como curativo poderia também ser exercida através de enzimas proteolíticas de origem bacteriana³⁸. Contudo, nos exames microscópicos realizados, não foram observadas colônias de bactérias nas peles de rã e nas feridas cutâneas dos cães, capazes de ser detectadas pelo método de leitura microscópica empregado.

Finalmente, a comprovação de processo de rejeição dependeria da realização de provas cruzadas de histocompatibilidade pós-sensibilização⁴¹ ou de exames imunohistoquímicos, não programados para esta etapa da pesquisa.

A elucidação da causa do processo de destruição mencionado faz parte de projetos a serem desenvolvidos com propósito de estabelecer o modo mais eficaz de utilização da pele de Rana catesbeiana, como curativo biológico oclusivo, em feridas cutâneas excisionais produzidas em animais da espécie canina.

CONCLUSÃO

Não houve benefícios no uso de pele de rã, como curativo biológico, sobre a cicatrização de feridas tegumentares produzidas em cães.

Falcão SC, Lopes SL, Coelho ARB, Almeida EL. Rana catesbeiana skin as occlusive biological dressing in the treatment of skin wounds caused in dogs. Macroscopic and microscopic changes resulting from the interaction of these tissues. Preliminary study. Acta Cir Bras [serial online] 2002 May-Jun;17(3). Available from URL: http://www.scielo.br/acb.

ABSTRACT ¾ Objective: To study the effect of frog skin as occlusive dressing on cutaneous wounds. Methods: Fifteen mongrel dogs, of both sexes, weighing 9.45 ± 2.62 kg, under general anesthesia, were submitted to 34 square shaped skin lesions, with 400 mm² of area, on both right and left thoracodorsal surfaces. After defrosting, Rana catesbeiana skins preserved in a ClNa and glycerol solution at ¾4ºC were used as biological occlusive dressing on 17 lesion located in the right thoracodorsal region (Test Group). The 17 lesions on the left thoracodorsal side were treated with gauze moistened in a 0.9% ClNa solution (Control Group). The frequency of healed (HW) and non-healed wounds (NHW), and the incidence of frog skin destruction, were analyzed. Five sequences of frog skin samples were histologically examined till tissue destruction started to appear. Inflammatory histological findings were evaluated by percentage of intensity of Polymorphonuclear cells (PPMNC), Mononuclear cells (PMC), and lymphoreticular infiltration (PLI). Two tailed Student's t test and chi square test (c²) were used as indicated. Results: 1) There was no significant difference in HW and NHW between Groups; 2) There was a 31.00% incidence of frog skin destruction limited to the surface in contact with dog wounds. An increased tendency of destruction was perceived during the studied period; 3) Histological changes of frog skin, characterized by tissue infiltration mainly from mononuclear cells, and by destruction of Malpighi and subjacent layers, were observed at the surface, limited to the wound contact area; 4) PPMNC values attained were not statistically different between groups. In the Test Group PM prevailed and PLI was exclusively seen. Conclusion: Frog skin is ineffective in treatment of canine cutaneous wounds and rejection was suggested as a causative factor.

KEY WORDS ¾ Biological dressings. Skin. Wound healing. Dogs.

Conflito de interesses: nenhum

Fontes de financiamento: nenhuma

Endereço para correspondência:

Prof. Antônio Roberto de Barros Coelho

Rua Galvão Raposo, 234

50610-330 ¾ Recife ¾ PE

Tel./Fax: [phone]

e-mail: [e-mail]

Data do recebimento: 24/10/2001

Data da revisão: 12/12/2001

Data da aprovação: 11/01/2002

^** Quando a pele de rã, permanecendo sobre a ferida, sofreu destruição parcial (adelgaçamento) ou total (ruptura) em área correspondente à superfície cruenta da lesão.

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1

. Trabalho realizado no Departamento de Medicina Veterinária UFRPE, no Núcleo de Cirurgia Experimental do Departamento de Cirurgia e no Departamento de Patologia UFPE.

2

. Mestre em Medicina Veterinária pela UFRPE.

3

. Professor Adjunto, Doutor ¾ Departamento de Patologia UFPE.

4

. Professor Adjunto, Doutor. Coordenador do Núcleo de Cirurgia Experimental ¾ Departamento de Cirurgia UFPE.

5

. Professor Adjunto, Doutor ¾ Departamento de Medicina Veterinária UFRPE.

^*

Quando a pele de rã permaneceu íntegra sobre a ferida.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  01 Jul 2002
• Data do Fascículo
  Maio 2002

Histórico

• Aceito
  11 Jan 2002
• Revisado
  12 Dez 2001
• Recebido
  24 Out 2001