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Acta Cirurgica Brasileira

Print version ISSN 0102-8650On-line version ISSN 1678-2674

Acta Cir. Bras. vol.17 no.4 São Paulo July/Aug. 2002

http://dx.doi.org/10.1590/S0102-86502002000400008 

7 – ARTIGO ORIGINAL

ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DE  OSSOS DE CÃES CONSERVADOS POR LONGO PERÍODO DE TEMPO NA GLICERINA A 98% À TEMPERATURA AMBIENTE, OBJETIVANDO A EXTERTIA ÓSSEA1

 

Marco Antonio Gioso2
Nilson Roberti Benites3
Gabriela Kämpf4

 

 

Gioso MA, Benites NR, Kampf G. Análise microbiológica de ossos de cães conservados por longo período de tempo na glicerina a 98% à temperatura ambiente, objetivando a enxertia óssea. Acta Cir Bras [serial online] 2002 Jul-Ago;17(4). Disponível em URL: http://www.scielo.br/acb.

RESUMO - Objetivo: Verificar crescimento de microorganismos em amostras de glicerina e ossos armazenados durante nove anos. Métodos: Realizou-se a análise microbiológica da epífise e da medula de ossos conservados na glicerina a 98%, bem como da própria glicerina que os contêm. Resultado: O crescimento microbiano observado não foi estatisticamente significante. Conclusão: A glicerina é um excelente meio para conservação de tecido ósseo por longo período de tempo.

DESCRITORES - Microorganismos. Glicerol. Ossos. Cão. Fratura. Medula. Epífise.

 

 

INTRODUÇÃO

A enxertia óssea de ossos homólogos na ortopedia veterinária é um meio seguro e de eleição na reposição de perdas e falhas ósseas em fraturas ou ressecções amplas. Para o procedimento cirúrgico de enxertia é necessário que os ossos para implante sejam previamente retirados do animal doador, sob rigorosa assepsia e preservados num meio adequado. Sabe-se que a glicerina é reconhecidamente um meio viável para esta finalidade, obtendo-se bons resultados na conservação de ossos e tecidos. Este trabalho visou pesquisar o crescimento de microorganismos no tecido ósseo e/ou na glicerina que o contém, armazenada durante um longo período de tempo, e identificá-los caso houvesse crescimento nos meios de cultura. Este estudo é fundamental para comprovar a viabilidade da implantação de bancos de ossos em hospitais veterinários, tendo em vista a enxertia óssea.

Fraturas de ossos em membros locomotores são freqüentes em pequenos animais. Fraturas cominutivas ou multifragmentares são os traumatismos que apresentam maior dificuldade de tratamento. Em geral, a osteossíntese nesses casos não apresenta boa evolução pós-operatória. No entanto, a enxertia óssea na ortopedia veterinária tem sido uma alternativa segura e de eleição na reposição de perdas e falhas ósseas1. Para isso torna-se necessário que os implantes homólogos sejam previamente retirados do animal doador e preservados em meio adequado2.

Porém, há uma série de fatores limitantes na obtenção dos implantes ósseos: devido à grande variação dos tamanhos dos esqueletos dos animais, as possibilidades de se encontrar um doador que seja compatível com a conformação física do animal receptor diminui consideravelmente2,3; também é difícil obter ossos de cães doadores imediatamente para a cirurgia de enxertia, pois é necessária a remoção total de periósteo e restos teciduais aderidos ao osso para que não haja rejeição ao implante4, procedimento que atrasaria consideravelmente o início da cirurgia. Além disso, é preciso que o método de preservação seja viável, de fácil utilização, baixo custo e que seja acessível a clínicas e ambulatórios cirúrgicos de pequenos animais4.

As cirurgias oncológicas, devido às suas ressecções amplas, freqüentemente tornam necessário o uso de osso para transplantação. O transplante autólogo poderia ser substituído por osso conservado, o que condiciona o cirurgião a previamente armazenar o osso preservado e transplantável, sendo a glicerina pura um bom método de manutenção deste tecido. Porém, não se sabia ainda se era possível manter durante longo período de tempo os ossos conservados na glicerina, e além disso não se sabiam quais microorganismos eventualmente poderiam desenvolver-se nas amostras armazenadas por longos períodos de tempo 2,3.

Diversas técnicas têm sido desenvolvidas no intuito de se tornar possível a conservação dos tecidos ósseos por longos períodos de tempo. Dentre estas, a conservação em glicerina tem merecido destaque pois, além de ser um método acessível economicamente, não é necessário empregar a autoclavagem e tampouco o congelamento, técnicas que causam danos ao tecido ósseo, e prejudicam a formação de calo ósseo no pós-cirúrgico; além disso, não foi observada diferença considerável quanto ao crescimento de microorganismos na glicerina a 98% autoclavada e "in natura", num período igual ou menor a 24 meses4, tampouco rejeição do organismo ao meio conservante na evolução pós-operatória.

 

OBJETIVO

Verificar o crescimento bacteriano e fúngico das epífises e da medula de ossos conservados na glicerina a 98%, bem como da própria glicerina que os contêm. Fazer a identificação dos microorganismos eventualmente encontrados em cada amostra. Analisar a viabilidade da implantação de um banco de ossos de cães conservados na glicerina à temperatura ambiente.

 

MÉTODOS

Amostra

Metacarpos (MC) e metatarsos (MT) de cães clinicamente sadios, removidos cirurgicamente de modo totalmente asséptico, estocados em frascos estéreis e preenchidos com solução de glicerina a 98%, conservados à temperatura ambiente e em ambiente fresco e seco, durante o período de nove anos. Os tubos de ensaio contendo os ossos estavam armazenados em recipiente cirúrgico de alumínio, e dispostos em 24 tubos contendo um osso cada, preenchidos com glicerina de modo que o osso esteja totalmente coberto, tampados com algodão; três tubos totalmente preenchidos com glicerina, sem nenhuma amostra de osso (pois foram utilizados em casos cirúrgicos), tampados com algodão; e três tubos contendo pequena quantidade de glicerina, não tampados com algodão (os ossos foram utilizados em casos cirúrgicos).

Há que se ressaltar que o algodão utilizado não era hidrofóbico, o que permitiu que parte da glicerina fosse absorvida por ele; isto permitiu maior contato com o meio externo e possibilitou, em tese, a contaminação das amostras.

Para referir-se a cada um dos grupos, foram utilizadas as seguintes siglas: Tgo (tubos fechados contendo fragmentos ósseos preservados na glicerina); Tg (tubos fechados preenchidos com glicerina que não contêm os fragmentos ósseos); Tgc (tubos preenchidos parcialmente pela glicerina e sujeitos à contaminação (abertos).

Análise Microbiológica

Três meios de cultura foram eleitos para se cultivar microorganismos: Agar-Sangue, Sabouraud e BHI. As placas de Ágar-Sangue foram divididas em dois grupos: o primeiro, cultivado em meio aeróbico, e o segundo, cultivado em meio anaeróbico. As placas de ambos os procedimentos foram semeadas de forma semelhante.

Todas as placas que sofreram os procedimentos aeróbico e anaeróbico permaneceram na estufa a 37º C. As placas que sofreram procedimento anaeróbico foram dispostas em jarra de anaerobiose, com sachê gerador anaerobiose, cujo conteúdo reage com o oxigênio do meio produzindo água e tornando conseqüentemente a atmosfera anaeróbica. Somente as placas de Sabouraud permaneceram à temperatura ambiente, não foram à estufa. A leitura das placas e de seus respectivos meios de enriquecimento foi feita a cada 24 horas, por até cinco leituras consecutivas. A cada leitura, a jarra foi aberta e o gerador de anaerobiose substituído.

 

RESULTADOS

Ossos – Medula e Epífise

Ágar-Sangue em aerobiose: Medula: detectou-se crescimento de colônias bacterianas em duas das 24 placas: tgo2 e tgo11. As duas amostras foram ressemeadas. Não houve crescimento de bactérias após a ressemeadura em ambas as amostras. A amostra tgo11 foi ressemeada mais uma vez, e novamente microorganismos não foram identificados. Epífise: houve crescimento bacteriano em uma das 24 placas; uma colônia de Staphylococcus na placa tgo3 foi identificada por Gram. Ágar Sangue em anaerobiose: Não foi verificado crescimento microbiano em medula, epífise e glicerina. BHI: Não foi verificada a turvação do meio em amostras de medula, epífise e glicerina. Sabouraud: Não foi verificado crescimento de colônias de fungos em medula, epífise e glicerina.

Glicerina

Ágar-Sangue em aerobiose: Foi observado crescimento de nove colônias puntiformes, brilhantes e amarelas em placa Tgc 29; como de costume, realizou-se o procedimento de Gram, constatando-se a presença de bacilos gram positivos. Cabe dizer que este tubo encontrava-se aberto, sem fragmento ósseo, com glicerina em pouca quantidade e portanto sujeito à contaminação. Ágar-Sangue em anaerobiose: Não foi verificado crescimento microbiano em medula, epífise e glicerina. BHI: Não foi verificada a turvação do meio em amostras de medula, epífise e glicerina. Sabouraud: Não foi verificado crescimento de colônias de fungos em medula, epífise e glicerina.

Cálculos

Calculou-se a porcentagem de placas que continham microorganismos sobre o número total de placas, conforme mostra a Tabela 1.

 

 

Onde

n = número considerado de amostras

n'= número de amostras onde houve isolamento microbiano

% = porcentagem (n'/n)

Estes resultados demonstram que não há diferença estatisticamente significativa para P<0,05.

Para a quantidade total de amostras (n=24) foi calculado o índice de concordância Kappa5:

 

 

 

 

 

 

É preciso salientar que o cálculo de concordância através do índice Kappa foi calculado baseando-se no número de amostras de glicerina que continham osso (n=24). As amostras sem osso (n=6) foram semeadas com a finalidade de comparação com as amostras que continham ossos, e portanto não foram consideradas no cálculo.

 

DISCUSSÃO

Os índices de concordância Kappa mostram-nos que a concordância é ótima para todos os grupos de comparação. Este é um excelente resultado, visto que somente com a semeadura da glicerina já é possível avaliar-se a viabilidade do tecido ósseo. Isto significa que se o osso não estiver contaminado quando de sua estocagem, pode-se utilizar somente a cultura da glicerina para se avaliar a presença de microorganismos em medula e epífise, poupando-nos do trabalhoso procedimento de coleta de material de epífise e serragem do osso para coleta de medula óssea. Sobretudo, a simples manipulação dos ossos, por mais cuidadosa que seja, sempre introduz microorganismos contaminantes nas amostras. Questionou-se quais microorganismos desenvolver-se-iam eventualmente nas amostras conservadas por longo período de tempo6; pelo presente trabalho soube-se que o crescimento de microorganismos nas amostras conservadas há nove anos não é estatisticamente significante.

Em 1951, foram realizados experimentos com um banco de ossos preservados em solução aquosa de Timerosal, afirmando ser este um método de preservação simples, barato e asséptico1; cremos, todavia, que a glicerina também é um meio de preservação simples, barato e asséptico, tal como o Timerosal o era, e o substitui com sucesso. É possível armazenar o banco de ossos imersos em glicerina à temperatura ambiente, não sendo necessário o congelamento e outros métodos lesivos7,8,9; esta é outra vantagem da utilização da glicerina, pois armazenando-se à temperatura ambiente não há formação de cristais intra e extracelulares, além de alterações eletrolíticas deletérias às células e potencialmente destrutivas à matriz óssea. Seu efeito asséptico na conservação de tecido ósseo deve-se particularmente às suas propriedades físicas10, e portanto não há problema quanto ao fenômeno da resistência bacteriana, assim como ocorre atualmente com o Timerosal.

A esterilização permanece como o maior problema na enxertia, sendo freqüente a contaminação bacteriana, fúngica e viral3; devido a este fato diversos autores estudaram a viabilidade do óxido de etileno como meio de conservação de fragmentos ósseos 4,11,12,13,14,15. Porém, sua viabilidade é questionável após 32 semanas de estocagem13, sendo que o período máximo de estocagem aceitável é de seis a 18 meses2,3. Pelo presente trabalho pôde-se constatar que a glicerina é capaz de conservar o tecido ósseo por um prazo de nove anos de armazenamento (108 meses aproximadamente), superando o óxido de etileno neste aspecto. Levando-se em consideração que o número de amostras positivas para crescimento microbiano é estatisticamente muito pequeno em comparação com as amostras negativas, deve-se considerar, portanto, a glicerina como um excelente meio de conservação de tecido ósseo, mantendo o tecido isento de microorganismos por um período de até nove anos.

Em 1991 foi verificada a desidratação do implante conservado no óxido de etileno, levando à perda de suas propriedades mecânicas12; no presente trabalho, verificou-se que glicerina estocada por nove anos impediu o ressecamento da medula contida no osso, o que nos leva a crer que a glicerina realmente possui propriedade protetora das células como também atua como um meio impermeável à evaporação da água, desde que não esteja em contato direto com o tecido medular.

A utilização de fragmentos esterilizados por raios ionizantes é muito onerosa16; cremos desta forma que a glicerina é muito acessível economicamente, e pode ser utilizada facilmente por hospitais e clínicas veterinárias com a finalidade de se montar um banco de ossos.

Excelentes resultados na reparação de fraturas com fragmentos ósseos conservados na glicerina a 98% foram obtidos2. Nosso trabalho confirmou a viabilidade da utilização da glicerina por longo período de tempo, fato que vem acrescentar mais uma vantagem à utilização da glicerina em detrimento das outras técnicas de conservação de ossos.

Cabe comentar que os ossos continham suas medulas ósseas ainda íntegras, após nove anos de armazenamento na glicerina, e que estas preenchiam todo o canal medular do osso. A coloração era rósea-pálida e não houve ressecamento, sendo possível aspirar seu conteúdo por vácuo com seringa descartável.

Um achado curioso ocorreu nas placas de Ágar-Sangue semeadas com conteúdo de medula óssea: a descoloração circunscrita à área semeada, causada por lise de hemácias do meio de cultura de Agar-Sangue por substância constituinte da medula óssea.

Tomando-se por base os dados finais, após nove anos de estocagem de ossos em glicerina, pode-se observar que não houve diferença significante (P<0,05) para isolamento de microorganismos. Portanto, consideram-se as amostras como sendo estéreis, e a glicerina um excelente meio de armazenamento de tecido ósseo.

 

CONCLUSÃO

Pelo presente trabalho pudemos comprovar que a glicerina é um excelente meio de conservação de tecido ósseo, viabilizando a implantação de um banco de ossos de cães pelo período de até nove anos de armazenamento.

 

AGRADECIMENTOS

Priscilla Anne Melville, Médica Veterinária responsável pelo Laboratório de Doenças Infecciosas, Bacteriologia e Micologia da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da USP.

À FAPESP, pelo auxílio financeiro e bolsa concedida.

 

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Gioso MA, Benites NR, Kämpf G. Microbiology analysis of dog bones stocked for long period of time on glycerin 98% at room temperature, aiming allograft bone surgery. Acta Cir Bras [serial online] 2002 Jul-Aug;17(4). Available from URL: http://www.scielo.br/acb.

ABSTRACT - Objective: verify the microorganism growth in bone plus glycerin samples stocked for at least nine years. Methods: microbiology analisys of epiphisis and bone marrow stocked at glycerin 98% was done. Results: No statistically significant growth was verified. Conclusion: This result means that glycerin is an excellent bone conservation substance for long periods of stockage.

KEY WORDS - Microorganism. Glycerol. Bones. Dog. Fracture. Marrow. Epiphisis.

 

 

Conflito de interesse: nenhum
Fonte de financiamento: FAPESP

Endereço para correspondência:
Marco Antonio Gioso
Rua Prof. Dr. Orlando Marques de Paiva, 87
05508-900 São Paulo - SP
Tel.: (11) 3091-1205
Fax: (11) 3091-1211

maggioso@usp.br

Data do recebimento: 16/04/2002
Data da revisão: 03/05/2002
Data da aprovação: 28/05/2002

 

 

 

1. Departamento de Cirurgia- Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da USP.
2
. Professor Doutor MS-3 da Fac. Med. Veter. Zootec. USP.
3
. Professor Doutor MS-3 da Fac. Med. Veter. Zootec. USP-Depto. de Med. Veter. Preventiva e Saúde Animal.
4
. Aluna de graduação da Fac. Med.Veter.Zootec.USP, vinculada ao programa de Iniciação Científica do Depto. de Cirurgia da FMVZ-USP.

Bolsa FAPESP n. 00/07175-0.

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