Translocação de bactérias marcadas com Tc99 na icterícia obstrutiva em ratos

Bacterial translocation labeled with Tc99 in obstructive jaundice in rats

TRANSLOCAÇÃO DE BACTÉRIAS MARCADAS COM Tc⁹⁹ NA ICTERÍCIA OBSTRUTIVA EM RATOS

Suelene Suassuna Silvestre de Alencar¹

Aldo da Cunha Medeiros ²

Carlos Teixeira Brandt ³

José Lamartine de Andrade Aguiar ⁴

Keyla Borges Ferreira Rocha ⁵

Marli Pinheiro da Silva ⁶

Alencar SSS, Medeiros AC, Brandt CT, Aguiar JLA, Rocha KBF, Silva MP. Translocação de bactérias marcadas com Tc⁹⁹ na icterícia obstrutiva em ratos. Acta Cir Bras 2001; 17 (supl. 1):35-38.

RESUMO

Estudo realizado com o objetivo de avaliar a translocação bacteriana (TB) do tubo gastrointestinal para órgãos viscerais na icterícia obstrutiva. Quatro grupos de ratos foram estudados: grupo I (n=10) ligadura do colédoco, grupo II (n=10) controle ou "sham operation", grupo III (n=12) ligadura do colédoco e gavagem com ^99mTc-Escherichia coli e grupo IV (n=5) controle ou "sham operation" e gavagem com ^99mTc-E.coli. Usando técnica asséptica e sob anestesia com pentobarbital sódico (20mg/kg), os animais foram submetidos à laparotomia e nos ratos dos grupos I e III foi realizada ligadura do colédoco com fio de seda nº 000. Nos ratos dos grupos II e IV foi feita apenas a manipulação do colédoco com pinça de Adison. Após sete dias, os animais dos grupos I e II foram mortos e ressecados fígado, baço, linfonodos mesentéricos e pulmões para exame microbiológico (meios Agar-sangue e Agar Mac Conkey) e exame histopatológico (coloração H.E. e Tricrômico de Masson) por análise morfométrica. Nos animais dos grupos III e IV, após sete dias, foi administrada por via oral (gavagem) ^99mTc-E.coli e após 24h, os ratos de ambos os grupos foram mortos e seus órgãos retirados para contagem da radioatividade em cintilador automático Gama, modelo ANSR (ABBOT). O nível médio de bilirrubina, nos grupos ictéricos, foi significantemente maior do que o do grupo controle. O estudo microbiológico revelou maior incidência de bactérias translocadas no grupo I, comparada ao controle (p< 0,05). Os resultados não mostraram diferença significante na captação da ^99mTc-E.coli entre os dois grupos. Porém, a análise das interações grupo x órgão mostrou diferença entre os grupos ictérico e controle para os órgãos: fígado e pulmão. Os dados permitem concluir que em ratos ictéricos por ligadura do colédoco ocorreu TB detectável por exame microbiológico. Não ocorreu TB com ^99mTc-E. coli no modelo proposto.

DESCRITORES: Translocação bacteriana. Icterícia obstrutiva. Tecnécio⁹⁹. Ratos.

Alencar SSS, Medeiros AC, Brandt CT, Aguiar JLA, Rocha KBF, Silva MP. Bacterial translocation labeled with Tc⁹⁹ in obstructive jaundice in rats. Acta Cir Bras 2001; 17 (supl. 1):35-38.

SUMMARY

This study was designed to evaluate the bacterial translocation (TB) from the gastrointestinal tract to visceral organs in rats submitted to laparotomy and common bile duct ligation (CBDL). Four groups of rats were studied: group I (n=10) CBDL; group II (n=10) control or "sham operation"; group III (n=12) CBDL and ^99mTc-E.coli and group IV (n=5) control or "sham operation" e ^99mTc-E.coli. All the animals were operated with aseptic technic under intraperitoneal anesthesia with pentobarbital sodium (20mg/kg). On 7^th postoperative day the animals of groups I and II were killed with a letal dosis of anesthetic and the liver, spleen, mesenteric lynphnodes and lungs were ressecated to microbiological (Agar-blood and Agar-Mac Conkey) and histological examination (H.E. and Masson Trichromic) through morphometric analysis. On 7^th postoperative day the animals of III and IV groups were labeled with ^99mTc-E.coli gavage and after 24hr they were killed and their organs were ressected. After that, the bacterial radioactivity was measured through an Automatic count of Gama Radioative - model ANSR (Abott Laboratories). The mean bilirrubin levels of the jaundiced rats were significantly higher as compared with the control group. The incidence of bacterial translocation was higher in group I compared with control group (p< 0.05). The results showed no significant statistic differences of ^99mTc-E.coli distribution between the two groups (p<0.05). However the interactive analyses groups x organs showed significant differences among the jaundiced and control groups to the liver and lungs. The data allow to conclude that in jaundiced rat with ligated bile duct occurred bacterial translocation detectable through microbiological analyses. The model proposed showed no bacterial translocation by the labeled ^99mTc technic.

SUBJECT HEADINGS: Bacterial translocation. Obstructive jaundice. Technecium⁹⁹. Rats.

INTRODUÇÃO

A translocação bacteriana (TB) é o mecanismo de passagem de bactérias e endotoxinas do intestino para linfonodos mesentéricos ou órgãos distantes¹. Os microorganismos, uma vez tenham atravessado a barreira epitelial, situam-se na cavidade peritoneal, dando origem à peritonite ou à metastatização para outros órgãos, promovendo a sepse de origem intestinal². Este fenômeno tem sido avaliado em modelos experimentais, onde a quantificação de bactérias nos nódulos linfáticos mesentéricos (NLM), fígado, baço e pulmões é determinada principalmente por técnicas de cultura microbiana. Os principais microorganismos nesses órgãos são os gram-negativos aeróbicos e anaeróbicos facultativos, sendo a E. coli, a bactéria mais encontrada³.

Estudos com partículas, como microagregados de albumina, carbono coloidal e sulfeto coloidal, marcadas com ^99mTc, foram realizados para avaliar o sistema mononuclear fagocitário, baseados tanto na depuração sanguínea dessas partículas quanto na captação das mesmas pelos NLM, fígado, baço e pulmões^4,5. A TB do intestino tem sido relatada por ocorrer sobre várias condições⁶.

Ocorre passagem de endotoxinas da luz intestinal para a circulação portal em indivíduos ictéricos, bem como de bactérias através da barreira mucosa para fígado, baço, pâncreas, NLM e rins¹. Apesar do aprimoramento da técnica operatória e do desenvolvimento de antibióticos, a infecção continua como a principal causa de mortalidade em pacientes com icterícia obstrutiva (IO).

Cultura de bile de pacientes submetidos à cirurgia mostrou que a incidência de bactérias foi de 30%, variando com a idade, tipo de cirurgia e a existência de obstrução biliar. A incidência de endotoxemia variou de 50 a 75% nos pacientes operados por IO⁷.

Berg e Garlington descreverem a TB, como a passagem de germes do tracto gastrointestinal para sítios extra-intestinais, tais como NLM, baço, fígado, rins, cavidade peritoneal e corrente sanguínea. Muitos destes germes são destruídos pelo sistema de defesa, após ultrapassarem a barreira mucosa¹.

A ausência de bile no intestino é responsável pelo aumento de endotoxina no sangue portal. Embora essa teoria seja aceita pelos autores, é consenso que a endotoxemia ocorre como resultado da falência do sistema fagocitário em eliminar a grande quantidade de endotoxina que migra do intestino para a circulação portal^8,11.

Deitch et al propuseram três mecanismos promotores da TB: 1) Disfunção da microflora intestinal nativa, resultando num aumento do crescimento de bacilos gram-negativos; 2) Injúria física na mucosa intestinal e 3) Perda da imunidade do hospedeiro².

Apesar do sistema portal ser considerado o principal sistema de drenagem de endotoxinas ou bactérias do intestino para o fígado, os NML atuam como rota alternativa de passagem destes¹⁰.

Tem sido observado evidências histológicas de injúria da mucosa intestinal, como edema subepitelial e descolamento do epitélio da lâmina própria envolvendo as vilosidades ileais².

Na IO a ação da endotoxina inclui efeito direto nos enterócitos, indução de citocinas como o fator de necrose tumoral (TNF) e inibição ou inativação da xantina dehidrogenase, ativação de radicais oxigenados que promovem lesão direta na mucosa intestinal⁸.

Outro fator na promoção da TB é a ausência da IgA secretória no intestino, que é importante na defesa imune da superfície mucosa, prevenindo a aderência de bactérias Gram negativas¹².

O componente da bile que influencia na TB é desconhecido. Sais biliares e IgA secretória são importantes⁹. A IgA secretória está reduzida no intestino com a ligadura do ducto biliar comum. A ausência de bile intra-luminal é a responsável pelos distúrbios da barreira intestinal, por aumentar a permeabilidade da mucosa².

Os sais biliares são detergentes, por formarem agregados micelares com moléculas de endotoxinas intraluminares. A ausência destes no lúmen intestinal em pacientes com IO, resulta no aumento da absorção de endotoxinas para a circulação portal^8,11.

A incidência de endotoxemia portal pode ser reduzida de 55 a 0% com a administração oral de ácido desoxicólico, mas o mesmo efeito não foi observado com o uso do ácido quenodesoxicólico⁸.

Baixo custo, alta disponibilidade, tempo de meia-vida curto, emissão de radiação gama e energia de radiação (140Kev), tornou o ^99mTc o isótopo eleito na marcação de radiofármacos¹³.

Com relação à utilização do ^99mTc em estudos com bactérias, destaca-se a P. aeruginosa, K. pneumoniae, E.coli e S. abortusovis¹⁴.

A marcação das bactérias é devido ao fato do ^99mTc ser um metal deficiente em elétrons e reagir com grupos doadores de elétrons. No caso específico das bactérias reage com estruturas protéicas, já que estas possuem grupos doadores de elétrons. Essa reação pode ocorrer com proteínas da parede celular das bactérias e/ou com as proteínas citoplasmáticas¹⁵.

Este estudo tem como objetivos: 1. analisar o fenômeno da TB para fígado, baço, NML e pulmões em modelo de ictecícia obstrutiva em ratos através de cultura microbiana; 2. avaliar a captação da E. coli marcada com ^99mTc pelos órgãos acima citados.

MÉTODOS

Animais de experimentação - Foram utilizados 37 ratos adultos Wistar pesando 310±25g. Os animais receberam água e dieta ad libitum e foram observados em gaiolas individuais, em ambiente com temperatura e iluminação controladas. A anestesia foi realizada com pentobarbital sódico na dose de 20mg/Kg e as operações com técnica asséptica.

Foram feitos quatro grupos: grupo I (n=10) foi submetido a laparotomia e ligadura do ducto biliar comum; grupo II (n=10) procedeu-se a laparotomia e apenas manipulação do ducto biliar comum "sham-operation"; grupo III (n=12) foi submetido a laparotomia com ligadura do ducto biliar comum e, após sete dias, receberam gavagem com E. coli marcadas com ^99mTc; e grupo IV (n=5) "sham-operation" foi submetido a gavagem com E. coli marcadas com ^99mTc.

Marcação das bactérias - O processo de marcação da E. coli foi realizado conforme método descrito por Diniz¹⁶.

Microbiologia e análise bioquímica - No sétimo dia os animais dos grupos I e II foram mortos com superdose do anestésico e relaparotomizados. Amostra de 3ml de sangue foi colhida para dosagens de bilirrubinas, AST, ALT e PAL. Em seguida, foram ressecados de cada animal fígado, baço, NML e pulmões, separando-se metade de cada órgão para exame microbiológico e a outra para análise histopatológica. Os fragmentos destinados ao exame microbiológico sofreram processo de homogeneização e foram semeados em meio de cultura Agar McConkey para detecção de Gram-negativos e, Agar-sangue para Gram-positivos. As amostras foram incubadas a 37ºc e examinadas após 24 e 48 horas.

Processamento das peças e análise histológica - Os fragmentos para exame histopatológico foram fixados em formaldeído a 10%, incluídos em parafina, cortados em secções de 4m de espessura e corados pela hematoxilina-eosina e pelo tricrômico de Masson. A análise morfométrica da resposta inflamatória e da fibrose intersticial foi realizada utilizando-se morfometria por imagem. As imagens histopatológicas foram analisadas e quantificadas através de analisador digital. Os campos microscópicos foram observados com objetiva 20X e ocular 10X cuja imagem foi capturada pela câmera e digitalizada pelo computador, que dividiu os campos microscópicos em unidades de imagem pixels. Após selecionada a resolução desejada, os impulsos ópticos foram digitalizados, resultando em uma imagem de cada campo medindo 640X480 pixels. Após quantificar os dados histopatológicos em unidades de densidade, os resultados foram expressos em mm² e feita a análise estatística.

Análise cintilográfica - Os animais dos grupos III e IV, que receberam por gavagem 0,2 ml de ^99mTc-E. coli (1,6 MBq), permaneceram em gaiolas com dieta e água ad libitum por 24h. Após a coleta de sangue foram mortos com superdose do anestésico, sendo ressecados fígado, baço, NML e pulmões. Um coágulo de 0,5 ml da veia cava inferior foi colhido. Os órgãos após retirados, foram lavados com água e pesados individualmente e colocados em tubos de contagem para a determinação da radioatividade em cintilador Ansr, Abbott. Os resultados foram expressos como porcentagem de captação de ^99mTc-E. coli porminuto (pcm/min)para cada órgão e o cálculo feito de acordo com a seguinte equação:

Para análise dos dados utilizaram-se as técnicas: análise descritiva e a prova não paramétrica de Kruskal - Wallis e paramétrica análise de variância. Para verificar o que foi observado na análise descritiva exploratória utilizou-se o teste não paramétrico, a prova de Kruskal - Wallis para amostras independentes. Para verificar o que foi observado nas análises descritivas utilizou-se a ferramenta estatística análise de variância -ANOVA.

RESULTADOS

Após 7 dias, os ratos do grupo I e grupo III submetidos à ligadura do DBP apresentavam-se francamente ictéricos. Os níveis séricos de bilirrubunas mostraram-se significativamente mais elevados em relação aos dos controles. Tabela 1).

AST, ALT e PAL apresentaram elevações significantes nos grupos ictéricos comparados com os controles (Tabela 2).

No grupo I, onde os ratos foram submetidos à ligadura do DBP, foi observada maior incidência de TB comparado ao grupo II.

Os NLM apresentaram maior incidência de culturas positivas de bactérias em relação aos demais órgãos. A bactéria cultivada mais encontrada foi a E. coli .

O exame histológico dos NLM não apresentou diferença entre os grupos I e II. Observou-se em ambos uma linfadenite crônica sem hiperplasia reativa. O mesmo foi observado em cortes de baço entre os dois grupos, que mostrou hiperplasia reativa da polpa branca, congestão da polpa vermelha e impregnação biliar discreta em macrófagos sinusoidais presentes em ambos. O exame dos cortes de fígado dos animais do grupo I apresentou alterações evidentes, caracterizadas por infiltrado inflamatório portal estendendo-se por vezes aos sinusóides (Fig.1), proliferação ductal portal, alterações degenerativas de hepatócitos, esteatose, alterações do volume nuclear e presença de figuras de mitose e nucléolos. Alterações das células de Kupffer também foram observadas. Os animais do grupo controle não apresentaram alterações histopatológicas importantes. Em relação aos pulmões, os animais do grupo I apresentaram áreas focais de espessamento dos septos alveolares, caracterizando uma pneunonite intersticial. A análise morfométrica do fígado dos animais ictéricos mostrou diferença estatisticamente significativa (p<0,05) em relação aos do grupo controle. Tab. 3 e 4.

O estudo realizado nos animais do grupo III e grupo IV, onde foi utilizada a gavagem com a E. coli marcada com ^99mTc e retirados os órgãos para a contagem da radioatividade, não apresentou diferença estatisticamente significante na contagem de bactérias nos órgãos entre os dois grupos. Tabela 5.

DISCUSSÃO

É certo que a TB está implicada na fisiopatologia das complicações associadas com a IO, como a sepse e a insuficiência renal.

Apesar dos avanços no que se refere a diagnóstico e terapêutica, a infecção e a endotoxemia continuam sendo as principais causas de morbidez e mortalidade em pacientes com IO.

A TB é definida como sendo a passagem de bactérias viáveis do trato gastointestinal para sítios extraintestinais estéreis, tais como, nódulos linfáticos mesentéricos, baço, fígado, rins, cavidade peritoneal e corrente sanguínea¹.

Fatores que promovem esse processo incluem: disfunção da microflora intestinal, perda da imunidade do hospedeiro e injúria física da mucosa intestinal².

A TB tem sido avaliada em modelos experimentais através de culturas bacterianas de órgãos, bactérias marcadas com radioisótopos, partículas não bacterianas marcadas com radioisótopos, dentre outros^1,2,5.

O emprego de bactérias marcadas com isótopo radioativo em estudos de TB e na avaliação do sistema mononuclear fagocitário apresenta vantagens em relação aos métodos convencionais por tratar-se de um método direto, confiável, rápido e de fácil execução.

Esse estudo teve por objetivo analisar a TB para o fígado, baço, NLM e pulmões através de culturas bacterianas e através da análise cintilográfica da captação de E. coli marcada com ^99mTc por esses órgãos em modelo experimental de IO em ratos.

Os estudos sobre a TB na icterícia obstrutiva em ratos utilizando culturas de bactérias encontram-se bem estabelecidos desde os trabalhos de Berg e Deitch demonstrando a ocorrência de TB para órgãos extra-intestinais^1,2.

Estudos empregando bactérias marcadas com radioisótopos foram realizados com a finalidade de demonstrar o fenômeno da TB em modelos experimentais de IO em ratos¹⁶. O presente experimento utilizando ^99mTc-E.coli foi possível empregando cultura de E. coli (ATCC-10536) marcada com tecnécio conforme técnica descrita por Diniz¹⁶. Os resultados mostraram diferença estatisticamente significante nas culturas de bactérias em órgãos nos ratos ictéricos em relação aos do grupo controle (p< 0,05). Esses resultados estão de acordo com os trabalhos publicados na literatura^1,2. A TB na IO ocorre devido a diversos fatores como; ausência de bile no lúmen intestinal, alterações na mucosa intestinal e perda da imunidade do hospedeiro². A ausência de bile no intestino resulta em endotoxemia¹⁷. Cahill et al mostraram que a incidência de endotoxemia foi reduzida de 55% para zero com a administração oral de desoxicolato em IO em ratos⁸.

No presente estudo os níveis séricos de bilirrubina foram significantemente elevados nos ratos submetidos à LDBC em relação ao do controle. As alterações histopatológicas foram mais evidentes no grupo ictérico, caracterizadas por infiltrado inflamatório portal a nível sinusoidal, proliferação ductal, alterações degenerativas de hepatócitos e alterações de células de Kupffer.

Segundo trabalhos de Clements et al¹⁷ após uma semana de ligadura do colédoco de ratos ocorre um aumento da endotoxemia para o fígado o que provoca uma estimulação das células de Kupffer, mas a longo prazo a obstrução causa depressão nessas células. Esses resultados foram posteriormente confirmados por Kimming et al, que mostraram depressão da função das células de Kupffer na IO em ratos¹⁸. Bactérias marcadas com radioisótopos têm sido usada por alguns autores para avaliar o clearence de bactérias circulantes e função do SRE em ratos¹⁸.

Os resultados desse estudo não mostraram diferença significante na captação da ^99mTc-E.coli pelos órgãos entre os grupos: ictérico e controle. No entanto, na análise interativa ocorreu diferença significante na captação da ^99mTc-E.coli pelo fígado e pulmões entre os dois grupos, o fígado no grupo ictérico obteve uma maior captação em relação ao controle enquanto que nos pulmões dos animais controle ocorreu uma maior captação comparada ao grupo ictérico. Essa observação sugere que os resultados estão de acordo com os de Clements et al¹⁷ que demonstram uma estimulação das células de Kupffer na primeira semana de icterícia.

Pode-se concluir que ocorreu translocação bacteriana para linfonodos, fígado, baço e pulmão verificado nas culturas bacterianas em ratos ictéricos.

A captação da E. Coli marcada com ^99mTc pelos órgãos não apresentou diferença significante entre os grupos ictéricos e controle, demonstrando que o método radioativo não é o melhor modelo no estudo da TB em animais com icterícia obstrutiva.

1. Mestre em Cirurgia - UFPE; Profa. Assistente de Cirurgia UFRN.

2. Doutor em Cirurgia, Prof. Adjunto de Clínica Cirúrgica UFRN.

3. Prof. Titular - Clínica Pediátrica Cirúrgica - CCS, UFPE.

4. Prof. Adjunto de Técnica Operatória - CCS, UFPE.

5. Prof^a Assistente Mestre em Patologia - UFRN.

6. Microbiologista da Faculdade de Farmácia - UFRN.

• 1. Berg AD, Garlington, AW Translocation of certain indigenous bacteria from the gastrointestinal tract to the mesenteric linphnodes and the other organs in a gnotobiotic mouse model Infect Immun 1979; 23: 403-11.
• 2. Deitch EA, Sitting K, Li M, Berg R, Specian RD. Obstructive jaundice promotes bacterial translocation from the gut. Am J Surg 1990; 159: 79-84.
• 3. Reynolds JV, Murchan P, Redmond HP, Watson RWG, Leonard N et al. Failure of macrophage activation in experimental obstructive jaundice: assocition with bacterial translocation. Brit J Surg 1995; 82: 534-538.
• 4. Tanaka N, Ryden L, Bergqvist L, Christensen P, Bengmark S. Reticulo-endotelial function in rats with obstructive jaundice. Br J Surg 1985; 72: 946-949.
• 5. Petroianu A, Simal CJR, Barbosa AJA. Impairment of Phagocytosis by mammalian splenic macrophages by 99mTc sulphur colloid. Med Sci Res 1992; 20: 847-849.
• 6. Deitch EA, Brodges RM. Effect of stress and trauma on bacterial translocation from the gut. J Surg Resech 1987; 42: 536-542.
• 7. Keyghley MRB et al. Antibiotic treatment of biliary sepsis. Surg Clin N Am 1975; 55: 1379 -1385.
• 8. Cahill CJ, Pain JA, Bailey ME. Bile salts, endotoxin and renal function in obstructive jaundice. Surg Gynecol Obstet. 1987; 165: 519-522.
• 9. Ding JW, Andersson R, Soltesz V, Willén R, Bengmark S. Obstructive jaundice impairs reticuloendothelial function and promotes bacterial translocation in the rat. J Surg Resch 1994; 57: 238-245.
• 10. Henttges DJ, Role of The intestinal microflora in host defenses against infection. In Human Intestinal microflora in health and disease. New York, Academic Press 1983; 311-332.
• 11. Kocksar LT, Bartok L. Effects of bile acids on the intestinal absorption of endotoxinas in rats. J Bacteriol 1969;100: 220-223.
• 12. Alverdy J, Aoys E. The effect of glucocorticoid administration on bacterial translocation. Ann Surg. 1991; 214: 719-723.
• 13.Arden WA, Yacko MA, Jay M, Beihn RM et al. Scintigraphic evalution of bacterial translocation during hemorrhagic shock. J Surg Res 1993; 54: 102-106.
• 14.Plotkowski MC, Beck G, Bernardo Filho M, Oliveira EF, Hinnrasky J, Puchelle E. Evaluation of the 99m-technetium labeling effect on Pseudomonas aeruginosa surface properties. Ann Inst Pasteur Microbiol 1987; 138: 415-426.
• 15. Bernardo Filho M, Pereira JA, Boasquevisque EM, Hasson-Voloch A. Technetium-99m distribution into Klebsiella pneumoniae. J Nucl Biol Méd 1991; 35: 162-166.
• 16. Diniz SOF, Resende BM. Nunan EA, Simal CJR, Cardoso VN. ^99mTechnetium labelled Escherichia coli Applied Radiation Isotopes 1999; 51: 33-36.
• 17. Clements WDB, Halliday MI, McCaigue MD and others. Effects of extrahepatic obstructive jaundice on Kupffer cell clearence capacity. Arch Surg 1993; 128: 200-205.
• 18. Kimmings AN, Deventer SJH, Obertop H, Rauws EAJ, Gouma DJ. Inflammatory and immunologic effects of obstructive jaundice: pathogenegis and treatment. J Am Coll Surg 1995;181: 567-581.
• 19.Slocum M M, Sittig K M, Specian R D, Deitch E A. Abscence of intestinal bile promotes bacterial translocation. Am Surg 1992; 58: 305-310.

NOTAS

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  24 Out 2002
• Data do Fascículo
  2002