Ascite neoplásica: efeito da solução aquosa de fenol, ácido acético e glicerina sobre o tumor ascítico de Ehrlich

Neoplasic ascite: effects of phenol, glycerin and acetic in Ehrlich ascite tumor

ARTIGO ORIGINAL

Ascite neoplásica: efeito da solução aquosa de fenol, ácido acético e glicerina sobre o tumor ascítico de Ehrlich¹

Neoplasic ascite: effects of phenol, glycerin and acetic in Ehrlich ascite tumor

Rogério Saad-Hossne^I; Willian Saad-Hossne^II; Renê Gamberini Prado^I

^IProfessor Doutor de Cirurgia e Ortopedia – FM, Botucatu – UNESP

^IIProfessor Emérito do Departamento de Cirurgia e Ortopedia – FM, Botucatu – UNESP

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

OBJETIVO: Verificar o efeito da solução composta por fenol, ácido acético e glicerina sobre o tumor ascítico de Ehrlich.

MÉTODOS: Utilizou-se 283 camundongos divididos em 2 protocolos (animais portadores e não portadores de tumor) procedendo-se a injeção de 0,25 ml, 0,10 ml e 0,05 ml da solução teste e 0,25 ml de solução salina, o sacrifício foi realizado após 3 e 6 dias do tratamento, analisando, a seguir, a contagem diferencial de células presentes no líquido ascítico.

RESULTADOS: Observou-se que nos animais portadores de tumor houve uma redução significante do número de células tumorais e aumento do número de células inflamatórias, nos animais sem tumor observou-se influxo de células inflamatórias para a cavidade peritoneal.

CONCLUSÃO: A solução proposta causa, in vivo, a diminuição do número de células tumorais e aumento do número de células inflamatórias no líquido ascítico.

Descritores: Carcinoma de Ehrlich. Terapia combinada. Ascite.

ABSTRACT

PURPOSE: To analyze the effects of phenol, glycerin and aceter acid in Ehrlich ascite tumor.

METHODS: For this 283 mouse were used and divided into 2 protocols (with and whithout tumor) wich were treated with 0,25 ml, 0,10 ml, 0,05 ml of the test solution and with 0,25 ml of saline solution. The sacrifice occurred after 3 and 6 days of treatment; the effects of these solutions were analysed through diferential cell scoring in the ascite liquid.

RESULTS: It was observed that in the animals with tumor, the number of tumoral cells dicresead and the number of inflamatory cells increased, while in the animals without tumor the solution cause an increase in the number of inflamatory cells.

CONCLUSION: This solution cause an increase of inflammatory cells and decrease os tumoral cells in ascite fluid.

Key Words: Carcinoma, Ehrlich Tumor. Combined modality therapy. Ascites.

Introdução

Em trabalho experimental anterior¹ , observamos que a solução composta por fenol, ácido acético, glicerina e água destilada ocasiona, in vitro, a destruição (inviabilidade) de células tumorais em suspensão do tumor ascitico de Ehrlich. Este efeito, imediato e dose dependente decorria da destruição de estruturas citoplasmaticas e nucleares.

Com base em tais resultados, nos propusemos a estudar o efeito da infiltração dessa solução em camundongos portadores do tumor ascitico de Ehrlich, tendo em vista a necessidade de desenvolvimento de novas drogas e substâncias no tratamento da ascite de origem neoplásica. Estima-se que 10% de todos os casos de ascite, são de origem neoplasica, sendo a maioria destas provenientes de tumores gastrointestinais e ovarianos.

Quanto ao tratamento da ascite neoplásica, as principais modalidades terapêuticas já consagradas são a paracentese, o uso de diuréticos e a quimioterapia sistêmica, a qual vem sendo progressivamente substituída pela via intraperitoneal; os resultados, infelizmente são de modo geral, pouco satisfatórios.

Neste sentido, diversas substâncias vem sendo estudadas (colóides radioativos, imunoestimuladores, inibidores de matriz de metaloproteases e novas drogas quimioterapicas), o que demonstra a importância no desenvolvimento de novas métodos no sentido de enfrentar o desafio no tratamento da ascite neoplasica.

Por outro lado, os dados da literatura demonstram a importância da relação entre o influxo de células inflamatórias e o crescimento tumoral^2,3, bem como a presença de infiltrado inflamatório (macrófagos e polimorfonucleraes) no estroma e na periferia de tecidos neoplasicos, como fator prognóstico, reforçando a dependência entre inflamação e crescimento tumoral.

Assim, frente a estes aspectos até aqui levantados, surgiu-nos a idéia de utilizar um modelo experimental de ascite tumoral, tumor de Ehrlich, para estudar os possíveis efeitos da solução esclerosante tanto nas células tumorais como nas inflamatórias.

Buscamos desta forma responder as seguintes perguntas: a) nos animais portadores de ascite neoplasica, a solução proposta reduz o número de células tumorais? b) injeção intraperitoneal da solução em animais sadios causa influxo de células inflamatórias ?

Escolhemos como modelo o tumor ascitico de Ehrlich e como métrica a citologia do liquido ascitico, realizando a contagem de células inflamatórias e tumorais.

Métodos

Utilizou-se como modeloexperimental o tumor ascítico de Ehrlich (TAE) em camundongos; a manutenção do tumor in vivo tem sido feita pela injeção intraperitoneal de 10⁷ células a cada sete dias em camundongos receptores.

A técnica para a manutenção tumoral, já descrita em trabalho anterior¹, é a técnica clássica e amplamente utilizada.

Foram utilizados 283 camundongos machos da linhagem Swiss, com quatro a seis semanas de vida, pesando entre vinte e trinta gramas, fornecidos pelo Biotério Central da Universidade Estadual Paulista (Unesp) Campus de Botucatu. Após o tratamento experimental foram alimentados com ração industrializada; no dia do tratamento experimental, os animais foram submetidos a jejum de seis horas, recebendo água ad libitum, permanecendo depois em caixas metálicas (dez animais em cada uma); a temperatura foi mantida entre 20^oC a 25^oC, a umidade relativa variável entre 40% a 60% e o tempo de exposição à luz foi de 12 horas.

A solução testada é composta de fenol (0,6 g), ácido acético (0,6 g), glicerina (1,2 g) e água bidestilada (28,0 ml), preparada no Laboratório de Cirurgia Experimental do Departamento de Cirurgia e Ortopedia (Fac. Med. Botucatu).

A partir do líquido ascítico de cada animal sacrificado, foi realizada a contagem total e diferencial de células (células tumorais, polimorfonucleares e mononucleares). A contagem total foi feita em câmara de Neubauer e a contagem diferencial (contagem de cem células) após processamento da suspensão peritoneal em citocentrífuga e coloração pelo método de Giemsa.

Protocolo 1

Este protocolo foi delineado com o objetivo de verificar o efeito in vivo da solução em animais com tumor; como métrica, utilizou-se a celularidade presente no líquido ascítico.

Foram criados oito grupos experimentais com vinte animais em cada grupo. A quantidade de suspensão tumoral injetada foi de 10⁴ células/ml, o volume da solução teste (S.T.) foi de 0,25 ml, 0,10 ml ou 0,05 ml e o de salina (S.S.) foi de 0,25 ml; em todos os casos, a injeção foi feita três dias após a inoculação da suspensão tumoral. O sacrifício ocorreu após três e seis dias da injeção das soluções (seis e nove dias da inoculação tumoral). Para a contagem global e de células tumorais, considerou-se o grupo de vinte animais; para a contagem de células inflamatórias, utilizaram-se dez animais por grupo.

Protocolo 2

Com a finalidade de avaliar os efeitos da solução teste em animais não portadores do tumor de Ehrlich (sadios), foram criados 8 grupos experimentais, com cinco animais em cada, e procedeu-se a injeção de 0,25 ml, 0,10 ml e 0,05 ml da solução teste e 0,25 ml de solução salina, realizou-se o sacrifício três e seis dias após a injeção da solução, sendo determinada a contagem global das células nas amostras do líquido ascítico.

Foi realizada análise de variância da contagem total e diferencial das células (tumorais e inflamatórias) no líquido ascítico, considerando quatro tratamentos e dois momentos. A comparação de médias foi feita pelo teste de Tukey.

A mortalidade, nos diferentes grupos, foi analisada pela freqüência relativa (porcentagem).

Adotou-se, como nível de significância, o índice igual a ou menor que 5% (p < 0,05). Nas tabelas, as médias seguidas de mesma letra maiúscula na vertical e minúscula na horizontal não diferem entre si, pelo teste de Tukey, ao nível de 5 % de significância.

Resultados

Protocolo 1 - Animais com tumor

1.1. Mortalidade nos grupos (Tabela 1)

1.2. Contagem total de células (Tabelas 2 e 3 e Figura 1)

1.3. Contagem diferencial

A análise diferencial foi realizada contando-se o número de células tumorais e de células inflamatórias (polimorfonucleares e mononucleares).

1.3.1. Células tumorais

1.3.2. Contagem de células inflamatórias (polimorfonucleares e mononucleares)

As Figuras 5 a 8 (esfregaços do líquido ascítico) ilustram nitidamente os efeitos da solução teste em animais com tumor.

A Figura 5 refere-se ao esfregaço do líquido ascítico de camundongo tratado com 0,25 ml de S.S. e sacrificado após seis dias de tratamento ; pode-se notar que a quase totalidade de células é de origem tumoral (caracterizadas pelo citoplasma reduzido e o núcleo volumoso), sendo escassas as células inflamatórias.

A Figura 6 corresponde ao esfregaço do líquido ascítico de camundongo pertencente ao grupo tratado com 0,05 ml de S.T. e sacrificado após seis dias de tratamento; pode-se notar que houve nítida redução da quantidade de células tumorais (T) e aumento de células inflamatórias: polimorfonucleares (P) e mononucleares (M).

A Figura 7 refere-se ao esfregaço do líquido ascítico de camundongo tratado com 0,10 ml de S.T. e sacrifícado após seis dias de evolução; nota-se a presença de intenso infiltrado inflamatório com predomínio de mononucleares e a escassez de células tumorais. Quando se compara com a Figura 1 (controle), a diferença fica bem evidente, demonstrando o efeito da S.T.

A Figura 8 corresponde ao esfregaço do líquido ascítico de camundongo tratado com 0,25 ml de S.T. e sacrificado após seis dias de tratamento; pode-se notar, também, o predomínio de células inflamatórias, mononucleares, em detrimento da pequena quantidade de células tumorais.

Vale salientar, com relação aos mononucleares, que em todas as lâminas estudadas a quase totalidade das células era composta de macrófagos, com muito poucos linfócitos.

Protocolo 2 - Animais sem tumor. Celularidade do líquido ascítico (contagem total)

2.1. Mortalidade nos grupos (Tabela 10)

2.2. Contagem total (Tabelas 11 e 12 e Figura 9)

Discussão

A solução testada é composta de fenol (0,6 g), ácido acético (0,6 g), glicerina (1,2 g) e água bidestilada (28 ml). O fenol é uma substância que tem poder bacteriostático (solução a 0,02% a 1%), bactericida, germicida e histotóxico. O ácido acético glacial tem efeito bactericida a 5%, e bacteriostático a 1% , além de apresentar capacidade cáustica e antifúngica⁴.

A glicerina é um álcool triidroxilado, amplamente empregado como veículo para muitas drogas aplicadas na pele, quando administrada por via oral, pode ser usada no tratamento do edema cerebral e na diminuição da tensão ocular no glaucoma⁴.

Esses dados evidenciam efeito bactericida do fenol e do ácido acético, indicando a possibilidade de atuação lítica das duas substâncias, agora empregadas em associação; esta solução, rotulada como "esclerosante" foi utilizada empiricamente, para o tratamento da hiperplasia prostática, no início deste século e nas décadas de 1960 e 1970 ⁵.

Em nosso meio, Camara⁵ estudou os efeitos da injeção da solução na próstata de cães, tendo observado ocorrência de necrose do tecido, seguida de fibrose.

Revendo a literatura, não encontramos referências ao uso dessa solução no tumor ascítico de Ehrlich ou na ascite neoplásica, justificando-se, assim a nosso ver, a oportunidade da investigação proposta em nosso trabalho.

Tendo em vista os resultados obtidos no trabalho anterior (in vitro) , optamos por utilizar as doses de 0,25 ml, 0,10 ml e 0,05 ml da solução teste.

A eficácia de uma droga antitumoral é, em geral, avaliada pela sua capacidade de reduzir a quantidade de células tumorais; contudo, ressalta-se a importância da relação da resposta imune do hospedeiro frente ao tumor, refletida pela presença de células inflamatórias no local da neoplasia. Associado a isto, vale enfatizar que o tumor ascítico de Ehrlich inibe o influxo das células inflamatórias para a cavidade peritoneal, justificando-se asssim, a contagem diferencial das células.

Quando avaliamos as características dos grupos como um todo, notamos que houve grande aumento do número de células tumorais, do 3^o para o 6^o dia, no grupo controle (0,25 ml de S.S.); aliás, o número de células tumorais foi significativamente maior no grupo-controle do que nos grupos tratados, em todos os momentos. Na avaliação do grupo controle, nos dois momentos, notamos aumento estatisticamente significante no número das células tumorais; o mesmo acontecendo nos grupos de 0,25 ml e de 0,05 ml de S.T., fato não ocorrido no grupo de 0,10 ml de S.T. em que não houve diferença entre os dois momentos (Tabela 7).

Isto sugere que a droga inibiu o crescimento tumoral em todos os momentos, sendo a ação mais efetiva no primeiro momento, na dose de 0,25 ml de S.T. e, no segundo momento, na dose de 0,10 ml de S.T.

Esta inibição, com redução do crescimento tumoral, também foi observada por alguns autores que utilizaram a via intraperitoneal para teste de outras drogas: com a dopamina⁶; com o fator de necrose tumoral e interleucina 2 combinados com administração oral de indometacina⁷, com antagonista do fator ativador de plaquetas ⁸, com a cisplatina⁹, com hipertemia associada à cisplatina¹⁰; com Plumbago rosea¹¹ (planta medicinal indiana); com antígenos capsulares de Klebsiella¹²; e com a deoxiadenosina¹³.

Outros autores obtiveram resultados semelhantes, empregando outras drogas, utilizando, porém, outras vias: via oral, com a indometacina⁷, com kifir¹⁴ (produto do leite fermentado do Cáucaso); via subcutânea: com a estriquinopentamina¹⁵, e com a cisteína¹⁶; via intravenosa: com o 5-fluorouracil¹⁷, utilizando o azul de metileno¹⁸, com a vitamina A¹⁹, com a lisozima²⁰, com o haloperidol²¹, com a bleomicina e dolomite²², com a cefarantina e a adriamicina²³, com o uso de dipiridamole²⁴, com a cisplatina²⁵ e com a carboplatina associada a hipertermia²⁶.

Ao avaliarmos a contagem de polimorfonucleares e mononucleares (macrófagos, em sua quase totalidade) em conjunto, notamos que, no primeiro momento, em todos os grupos tratados com S.T. o número de células inflamatórias foi superior ao encontrado no grupo-controle. Nos grupos tratados com S.T. houve elevação inicial do número de polimorfonucleares, ocorrendo diminuição gradativa para o segundo momento; já o número de mononucleares também se iniciou com valores bem mais altos em relação ao grupo-controle apresentando, ainda, tendência de aumento no segundo momento (6º dia), havendo diferença significante nos dois momentos, em relação ao controle.

Isto sugere que, inicialmente, os polimorfonucleares atuam conjuntamente com os mononucleares (1º momento); a seguir, há diminuição de polimorfonucleares e tendência ao aumento de mononucleares, que seriam responsáveis pela inibição tardia (posterior) no crescimento tumoral, como sugerem os resultados da análise estatística.

O estudo das células inflamatórias nos processos tumorais, como enfatiza Fecchio ⁸, tem grande importância, dada a relação entre o crescimento tumoral e o infiltrado inflamatório de polimorfonucleares e, principalmente, de mononucleares. O resultado por nós obtido justifica o prosseguimento da pesquisa no sentido de se avaliar o estado funcional dos macrófagos.

Por outro lado, Fecchio ⁸ chama a atenção para o fato de que muitos pesquisadores demonstram a ocorrência de ação antiinflamatória por parte das células neoplásicas, o que ressalta a importância dos nossos achados.

Frente a estes achados, tornou-se importante avaliar os eventuais efeitos da solução teste sobre o influxo de células inflamatórias (polimorfonucleares e mononucleares) para a cavidade peritoneal, em animais livres de tumor; neste sentido foi criado o Protocolo 2.

A análise de variância demonstra que há diferença significante entre tratamentos e interação tratamento/momento.

O grupo controle (S.S.) apresentou no 3^o dia maior quantidade de células que os grupos de 0,05 ml e de 0,25 ml de S.T. e inferior ao grupo de 0,10 ml de S.T.; no segundo momento, continuou superior a do grupo de 0,05 ml de S.T. e, agora, também à do grupo de 0,10 ml de S.T., porém inferior à do grupo de 0,25 ml de S.T.

Há diferença entre os grupos tratados, esta diferença ocorre no primeiro momento (3^o dia) no grupo de 0,10 ml de S.T. e, no segundo momento (6^odia), no grupo de 0,25 ml de S.T.. Isto sugere que, inicialmente, a reação do peritônio à droga é mais intensa no grupo de 0,10 de ml S.T. e, com o passar dos dias, torna-se mais intensa no grupo que recebeu maior dose (0,25 ml de S.T).

Os resultados indicam, pois, que a solução-teste estimula o influxo de células para a cavidade peritoneal.

Conclusão

A partir das observações experimentais podemos concluir que a solução testada no modelo experimental de tumor ascítico de Ehrlich reduz o número de células tumorais e eleva do número de células inflamatórias em suspensão no líquido ascítico e que nos animais sem tumor determina o influxo de células em suspensão na cavidade peritoneal.

Data do recebimento: 15/08/2003

Data da revisão: 02/09/2003

Data da aprovação: 25/09/2003

Conflito de interesse: nenhum

Fonte de financiamento: nenhuma

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1

Trabalho realizado no Laboratório de Cirurgia e Cirurgia Experimental "William Saad Hossne" – FM, Botucatu - UNESP.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  19 Abr 2007
• Data do Fascículo
  Dez 2003

Histórico

• Aceito
  25 Set 2003
• Revisado
  02 Set 2003
• Recebido
  15 Ago 2003