Efeito do alopurinol sobre a morfologia do testículo do rato submetido a isquemia, pela torção do cordão espermático seguida de reperfusão

Effect of allopurinol on rat testicles morfology, submited to ischaemia for spermatic cord torsion followed by reperfusion

13 - ARTIGO ORIGINAL

Efeito do alopurinol sobre a morfologia do testículo do rato submetido a isquemia, pela torção do cordão espermático seguida de reperfusão¹

Effect of allopurinol on rat testicles morfology, submited to ischaemia for spermatic cord torsion followed by reperfusion

Andréia C. M. Brochado Antoniolli Silva^I; Valdemar Ortiz^II; Roberto Antoniolli da Silva^III; João Ricardo Tognini^IV

^IDoutora em medicina pela UNIFESP-EPM, professora adjunta do departamento de cirurgia da universidade Federal de Mato Grosso de Sul

^IIProfessor Adjunto da Disciplina de Urologia da UNIFESP-EPM

^IIIMédico Ortopedista, professor do programa de residência médica de Ortopedia e Traumatologia da UFMS, Doutor em Medicina pela Universidade Federal de São Paulo

^IVProfessor titular do departamento de cirurgia da Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, Doutor em medicina pela Universidade Federal de São Paulo

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

OBJETIVO: Estudar o efeito do alopurinol no fenômeno de isquemia-reperfusão em testículos de ratos.

MÉTODOS: Foram utilizados 80 ratos Wistar, adultos, distribuídos em 4 grupos: controle sem alopurinol, controle com alopurinol, torção do cordão espermático sem alopurinol e torção do cordão espermático com alopurinol. Os testículos foram retirados após 60 dias do ato operatório e processados para exame histológico à microscopia óptica, onde os túbulos seminíferos e as células espermatogênicas foram objeto de estudo.

RESULTADOS: A comparação entre os grupos demonstrou que houve atrofia dos testículos que foram submetidos à torção, inclusive o grupo que recebeu o alopurinol.

CONCLUSÃO: O alopurinol não protegeu as gônadas dos efeitos da isquemia reperfusão.

Descritores: Torsão do Cordão Espermático. Testículo. Alopurinol. Ratos.

ABSTRACT

PURPOSE: In this investigation has been studied the effect of the alopurinol on the reperfusion injury phenomenon in testicles of rats.

METHODS: Eighty adults Wistar rats were divided in 4 groups: sham without alopurinol, sham with alopurinol, rigth testicular torsion for one hour without alopurinol and rigth testicular torsion for one hour with alopurinol. Bilateral orchiectomy was performed 60 days of the experiment and the testis were precessed for optical microscopy, and edamined to asses the seminiferous ducts and the spermatogenic cells.

RESULTS: There was significant atrophy and histological damage of the rigth testis.

CONCLUSION: Alopurinol did not protected the testis against the effects of the reperfusion injury.

Key words: Spermatic Cord Torsion. Testis. Allopurinol. Rats.

Introdução

A torção do cordão espermático (TCE) é uma entidade clínica freqüente em jovens, caracterizando uma das emergências mais comuns na cirurgia pediátrica, afetando 1 em cada 160 homens até os 25 anos¹. Além de ser uma afecção freqüente, se não diagnosticada e tratada precocemente, leva à graves consequências chegando até à orquiectomia em 50 à 70% dos casos. Trabalhos recentes² têm demonstrado que não só a isquemia do órgão causa lesão celular, mas o restabelecimento do fluxo sanguíneo após uma situação de diminuição do aporte sanguíneo arterial cria uma situação denominada fenômeno de isquemia- reperfusão. Durante o período de hipóxia, o catabolismo de adenosina trifosfato (ATP) leva à um acúmulo de metabólito das purinas, ou seja, as xantinas e as hipoxantinas.Nesse período a xantino desidrogenase é convertida em xantino oxidase. Com a destorção do cordão, ocorre a reperfusão, com grande aporte de oxigênio, que é o substrato requerido para que ocorra a oxidação das purinas. Ou seja, a hipoxantina é transformada em xantina e esta em ácido úrico, e como subprodutos dessa reação, aparecem uratos e superóxido radical, o qual gera, secundariamente, um radical hidrixil muito tóxico³. Esses radicais livres de oxigênio, a liberação de agentes quimiotáxicos e a agregação de leucócitos, induzem á peroxidação de lipídeos com desintegração de membranas e a perda da integridade endotelial, resultando em aumento da permeabilidade vascular, morte celular e dano tecidual³. Então, na presença de um fenômeno de isquemia-reperfusão, há algumas estratégias para tentar impedir ou diminuir o efeito do mesmo. Isso pode ser feito inibindo a formação de radicais livres ou eliminando-os depois que eles forem formados³. O alopurinol tem uma estrutura análoga à da hipoxantina e compete com ela inibindo a xantino oxidase, com subsequente formaçao de oxipurinol, o qual forma um complexo estável com a xantino oxidase, prevenindo futura atividade enzimática. Dessa forma, o alopurinol é usado para impedir que os RLO sejam formados, evitando sua ação nociva nas células3. Experimentos realizados com isquemia e reperfusão em outros órgãos, mostram resultados controversos sobre a capacidade do alopurinol em proteger as células dos efeitos dos RLO⁴. Devido à essa controvérsia de resultados, a intenção desse trabalho é examinar o efeito do alopurinol no testículo submetido à isquemia reperfusão. O objetivo deste trabalho foi a avaliação morfológica dos testículos de ratos submetidos à isquemia e reperfusão, sob ação do alopurinol.

Métodos

Foram utilizados 80 ratos albinos, machos, da linhagem WISTAR (Rattus norvergicus albinus), variedade EPM, com peso médio de 223.5 gramas. Foram estudados quatro grupos de ratos, com 20 animais em cada grupo:

GI - grupo sham sem alopurinol

GII - grupo sham com alopurinol

GIII - grupo experimento (torção) sem alopurinol

GIV - grupo experimento (torção) com alopurinol

Todos os grupos foram examinados com 60 dias de pós operatório.

Procedimentos

No momento do experimento os animais foram pesados e anestesiados com pentobarbital sódico, na dose de 30 miligramas (mg) por quilo (Kg) de peso, injetados na cavidade peritonial. A via de acesso foi feita por incisão transverssa de aproximadamente 1,5 centímetros (cm), em região inguinal direita, com abertura por planos até a exposição do testículo direito, que era exteriorizado. À seguir, o procedimento variou conforme cada grupo:

GI – o testículo direito era exteriorizado e colocado em recipiente com solução salina à 0,9% , em temperatura ambiente por um período de 1 hora. Após esse período o testículo era reposicionado no escroto, e a incisão suturada com poliamida 4-0 de forma contínua, em plano único. GII – o mesmo procedimento feito em GI foi aplicado nesse grupo, porém, quinze minutos antes de reposicionar o testículo era feito alopurinol, na dose de 100mg/kg de peso, via intraperitonial. GIII – o testículo direito era exteriorizado e o cordão espermático era torcido à 720°, e mantido dessa forma em recipiente com solução salina à 0,9%, em temperatura ambiente, pelo período de 1 hora, quando o cordão era destorcido e o testículo reposicionado no escroto. A incisão era suturada em plano único, de forma contínua com poliamida 4-0. GIV – o mesmo procedimento feito no GIII foi aplicado nesse grupo, porém, quinze minutos antes de destorcer o cordão espermático e reposicionar o testículo, era injetado intraperitonealmente, 100mg/Kg de peso de alopurinol.

Após cada experimento os animais eram marcados e recolocados nas gaiolas, em grupos de seis ratos, com água e ração à vontade. Após 60 dias do experimento, os animais foram novamente anestesiados com pentobarbital sódico na dose de 30mg/Kg, por via intraperitonial. Procedia-se então à incisão inguinal primeiramente à direita, com exteriorização do respectivo testículo e exérese do mesmo. Logo à seguir, procedia-se da mesma forma à orquiectomia esquerda. Os testículos retirados eram imediatamente pesados e identificados, e armazenados individualmente em recipiente com formalina à 10%. Essas peças foram submetidas à processamento histológico e coradas pelo método de Hematoxilina e Eosina (HE). Após a retirada de ambos os testículos, os animais eram submetidos à eutanásia com uma superdosagem de pentobarbital sódico.

Estudo histológico

Cada lâmina foi observada à microscopia óptica, inicialmente no aumento de 25 vezes, e posteriormente no aumento de 100 vezes. Dez campos foram observados em cada lâmina, onde se procurava saber se havia lesão nos túbulos seminíferos e/ou no seu conteúdo, ou seja, nas células espermatogênicas, células de Sertoli e membrana basal dos túbulos. Foi observado também se havia dano às células interstíciais ou de Leydig. Foi considerado presença de lesão quando nos 10 campos observados, a maioria dos túbulos, ou seja mais de 50%, tinha alterações histológicas. Alterações isoladas não foram consideradas.

Resultados

Não houve diferença significativa no peso dos animais comparando os quatro grupos, e a amostra foi considerada homogênea no que diz respeito ao peso (Tabela 1).

Quando se estudou a presença ou não de lesão em cada grupo e em ambos os testículos, não houve diferença significtiva entre os grupos estudo, ou seja onde foi realizado torção, com e sem droga. Porém, houve diferença significativa entre os testículos direito, os quais foram submetidos à torção, e os testículos esquerdos, que não sofreram torção (Tabela 2).

1. Estudo da presença de lesão nos grupos GIII e GIV

   Teste do Qui quadrado

   X2 = 0.417 x2 = (1gl;5%) = 3.841

2. Estudo da presença de lesão nos grupos GII e GIV

   Teste de Fisher

   P = 0.004158

3. Estudo da presença ou não de lesão nos grupos GI e GIII

   Teste de Fisher

   P = 0.000614

Quando se estudou o número de óbitos que ocorreram nos diversos grupos, observou-se que em GII e GIV, ou seja nos grupos onde se usou o alopurinol , o número de óbitos foi significantemente superior (Tabela 3).

Discussão

O tema isquemia testicular tem sido amplamente estudado sob diversos aspectos, como o efeito da própria isquemia sobre o parênquima testicular submetido à hipóxia, o dano no testículo contralateral, os efeitos do fenômeno isquemia-reperfusão e os meios de evitar ou diminuir esses efeitos. Os trabalhos revisados na literatura mostram uma metodologia bastante variada, o que teve como consequência, resultados diversos e conflitantes. Fatores como o tipo e a espécie do animal, a sua idade, o modo de se produzir a isquemia, o tempo de duração da isquemia e os tipos de avaliações, dificultam a análise e comparação dos trabalhos⁵. O modelo animal mais utilizado é o rato adulto⁶. Outros autores^7,8 mostraram que os ratos de até 35 dias de vida poderiam ser comparados à fase pré-puberal humana. Hoffman, citado por Harrison e Oettlé⁹, observou que a espermatogênese dos ratos só se inicia quando eles alcançam cerca de 130 gramas de peso. Baseados nas pesquisas da maioria dos autores que trabalharam com isquemia testicular^10,11 como, que utilizaram ratos adultos, e pelo fato de pretendermos estudar apenas as alterações da espermatogênese causadas pelo fenômeno isquemia-reperfusão, realizamos o experimento em animais adultos jovens. O modo de se promover a isquemia no testículo é também muito diverso e vai desde a ligadura da artéria espermática a vários graus de torção do cordão espermático^12,13, demonstraram que, no rato, cordão espermático torcido a 720º por uma ou duas horas, causa lesão testicular que não melhora após 60 dias, apesar doretorno do fluxo sanguíneo. Becker e col.¹⁴, também mostraram que após uma hora de torção do cordão a 720º, já existe dano testicular. Cosentino e col.¹⁵ estabeleceram que a torção do cordão a 720º, por 5 horas é suficiente para causar dano testicular irreversível. Dessa forma, adotamos a torção do cordão espermático a 720º. O tempo em que o testículo fica submetido à isquemia é muito importante. O fenômeno de isquemia-reperfusão foi estudado¹⁶, com períodos de 3 e 6 horas, e não encontraram diferenças entre os grupos. Isso pode ser explicado pelo fato de a hipóxia ter sido tão intensa a ponto de levar a um desaparecimento permanente da espermatogênese. A isquemia tem que ser suficiente para induzir o dano tecidual. Turner e Brown¹⁷ mostraram que o tempo para se iniciar uma terapêutica antioxidante fica em torno de 1 hora, que é o tempo mínimo para se induzir o dano tecidual. Uma ampla pesquisa com antioxidante e isquemia testicular, e tiveram resultados favoráveis nos grupos com apenas uma hora de isquemia, enquanto o mesmo não se observou nos grupos submetidos a mais de uma hora de hipóxia³. Diante dessas evidências, foi adotado o tempo de uma hora de isquemia. Becker e col.¹⁸ observaram que a hipóxia do ducto deferene leva a imobilidade dos espermatozóides, e isso pode dar uma aparente elevação da quantidade de espermatozóides. Sessenta dias após a torção, esses espermatozóides imobilizados são degradados completamente. Por essa razão, o nosso tempo de observação foi de 60 dias. O mais utilizado método de avaliação da isquemia testicular é a histologia com o uso da microscopia óptica, adotada em quase todos os trabalhos. Por meio dela, podemos estudar com facilidade e clareza os túbulos seminíferos, assim como as células espermatogênicas, de Sertoli, e também as células de Leydig. Outro método de avaliação testicular, é a passagem dos testículos, que serve como parâmetro de atrofia da gônada, alguns autores^14,18 demonstraram em seus estudos, uma alta porcentagem de atrofia dos testículos submetidos à ligadura da artéria e torção por uma hora ou mais, respectivamente. Quando os testículos foram retirados, no 60º dia de pós operatório, procurou-se observar macroscópicamente se havia alteração de volume dos testículos direito e esquerdo e se havia diferença entre eles. A maioria dos testículos cujo cordão foi torcido (grupos III e IV), apresentou-se com diminuição do volume em relação ao contralateral. Estudo com isquemia-reperfusão em diversos órgãos têm sido feitos. Reylly e col.⁶ definiram que o dano pela isquemia-reperfusão é uma combinação do componente isquêmico e do componente reperfusão. Em órgãos intolerantes à isquemia global o dano devido ao próprio componente isquêmico pode ser tão grande que torna sem efeito o dano pela reperfusão. Os mecanismos anti radicais livres de oxigênio são eficientes quando a porção principal do dano é causada pela reperfusão e não pela isquemia. Estudaram-se o dano por reperfusão e mecanismos antioxidantes no miocárdio canino, avaliaram o efeito da superóxido dismutase³, um antioxidante, em retalhos de pele. Ambos demonstraram resultados positivos com o uso de antioxidantes nesses tecidos submetidos à reperfusão. Foi estudado o efeito do alopurinol na isquemia mesentérica em ratas. Concluíram que essa droga é capaz de proteger o mesentério dos efeitos da reperfusão. Os órgãos variam na tolerância com a isquemia. Em órgãos como o coração e a pele os mecanismos anti radicais livres são efetivos prevenindo o dano de reperfusão após uma isquemia global. Tentou-se prevenir o dano de reperfusão em testículos depois de 60 ou 100 minutos de ligadura da artéria espermática, e observaram que os inibidores de radicais livres não protegeram o órgão do dano de reperfusão¹⁹. Para esses autores, a resposta do testículo para a isquemia-reperfusão pode ser diferente de outros órgãos. O efeito da superóxido dismutase na isquemia-reperfusão de testículos de ratos, foi observado por meio da ligadura da artéria testicular, por 60 minutos, e não se obteve efeito protetor dos antioxidantes no fenômeno de reperfusão. A isquemia-reperfusão em testículos de ratos por meio de torção do cordão espermático foi avaliada⁴, e observou-se que com uma a duas horas de torção e em seguida, ao desfazer a torção, ocorrem os efeitos da reperfusão, enquanto nos animais com períodos maiores de isquemia, não observou-se os efeitos da reperfusão, mas só da isquemia. Avaliarando-se o polietilenoglicol e a superóxido dismutase como antioxidantes na torção do cordão espermático de ratos com duração de 3 horas, não se encontrou diferença significativa entre o grupo controle e o grupo experimento. Estudos demontram o efeito do alopurinol em isquemia-reperfusão testicular, sendo que a isquemia foi produzida por pinçamento (com clampes vasculares) do cordão espermático por uma hora. O alopurinol foi administrado por via oral, durante os três dias que antecederam o experimento, na dose de 50mg/kg/dia. Concluiu-se que o alopurinol não foi capaz de proteger o testículo do rato contra os efeitos da reperfusão. Trabalho com torção do cordão espermático por 1, 3 e 5 horas¹⁰, a 720º, e alopurinol via intraperitonial, na dose de 100mg/kg, feitos 30 minutos antes de desfazer a torção demonstrou que o pré-tratamento com alopurinol previne o dano pela isquemia-reperfusão e esse achado não coincide com o resultado do presente trabalho. Esses autores, utilizaram método bioquímico para determinar a concentração do ácido tiobarbitúrico reativo, que é um produto da peroxidação dos lipídeos. Prillaman e col.⁴ estudaram a torção do cordão espermático em ratos, com grupos de 1 e 2 horas de torção, a 720º, e testaram algumas drogas antioxidantes, quais sejam: superóxido dismutase, catalase, alopurinol e verapamil. Todas as drogas foram administradas pela via intravenosa, 15 minutos antes de desfazer a torção. O alopurinol foi utilizado na dose de 25mg/ml, sendo 0,8ml por hora de infusão, durante 75 minutos, ou seja, 15 minutos antes de desfazer a torção do cordão e até 60 minutos após, no período de reperfusão. Concluíram que o uso de antioxidantes no fenômeno de reperfusão tem um efeito benéfico apenas nos casos em que o período de torção durou apenas uma hora. Estes pesquisadores utilizaram em seu estudo além do peso dos testículos, a medida da produção diária de espermatozóides e a medida da concentração venosa de testosterona, no 60º dia de pós operatório. Neste experimento, foi usado a torção do cordão espermático, a 720º, pelo período de uma hora, e o alopurinol foi usado por via intraperitonial, na dose de 100mg/kg de peso, 15 minutos antes de se desfazer a torção. Na avaliação histológica realizada não foi encontrada diferença entre o grupo controle e o grupo tratado com alopurinol, apesar de se ter usado, como sugere a maioria dos trabalhos, um tempo de torção apenas o suficiente para induzir o dano tecidual. Um dano muito importante que surgiu na evolução do experimento, é que houve uma significativa mortalidade nos grupos tratados com alopurinol, quando comparados com os grupos sem a droga, indicando uma possível toxicidade da mesma. Os resultados das pesquisas com isquemia-reperfusão e antioxidantes, têm apresentado resultados diferentes e conflitantes. Dessa forma esse assunto ainda necessita de uma ampla investigação, pelo fato de que seus resultados, poderão ter aplicação clínica para um importante e frequente problema da clínica pediátrica.

Conclusão

O alopurinol não apresentou efeito protetor sobre o testículo do rato submetido a isquemia, pela torção do cordão espermático, seguida de reperfusão.

Recebimento: 20/05/2005

Revisão: 21/06/2005

Aprovação: 19/07/2005

Conflito de interesse: nenhum

Fonte de financiamento: nenhuma

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1

. Tese de Mestrado apresentada no Programa de Pós-Graduação em Técnica Operatória e Cirurgia Experimental da Universidade Federal de São Paulo-Escola Paulista de Medicina (UNIFESP-EPM).

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  08 Nov 2005
• Data do Fascículo
  Dez 2005

Histórico

• Aceito
  19 Jul 2005
• Revisado
  21 Jun 2005
• Recebido
  20 Maio 2005