Proteínas morfogenéticas ósseas: terapêutica molecular no processo de reparo tecidual

Bone morphogenetic proteins: molecular approaches to tissue repair

Patologia

Proteínas morfogenéticas ósseas: terapêutica molecular no processo de reparo tecidual

Bone morphogenetic proteins: molecular approaches to tissue repair

Evelyn Almeida Lucas GONÇALVES ^*

Sérgio Augusto Catanzaro GUIMARÃES ^***

Roberto Brandão GARCIA^**

GONÇALVES, E.A.L.; GUIMARÃES, S.A.C.; GARCIA, R.B. Proteínas morfogenéticas ósseas: terapêutica molecular no processo de reparo tecidual. Rev Odontol Univ São Paulo, v. 12, n. 3, p. 299-304, jul./set. 1998.

As pesquisas biomoleculares sobre o desenvolvimento e a reparação óssea permitiram a descoberta de uma nova família de proteínas reguladoras da formação óssea e cartilaginosa in vivo. Capazes de iniciar a neoformação óssea quando implantadas em sítios extra-ósseos, estas proteínas são denominadas de proteínas ósseas morfogenéticas ou BMPs. A purificação e a caracterização das BMPs contribuíram para a fundamentação do conhecimento molecular e celular do processo de reparo ósseo. A resposta tecidual ao implante de BMPs ocorre de modo similar ao desenvolvimento ósseo embriológico, possibilitando a formação e o desenvolvimento da reparação na osteogênese pós-natal. A origem e a função das BMPs, entretanto, não estão limitadas ao tecido ósseo, sugerindo novos sítios de intervenções terapêuticas. O estádio atual de isolamento, as características, bem como as diversas possibilidades de aplicações clínicas das BMPs são relatados, analisando-se sua atuação.

UNITERMOS: Regeneração óssea; Dentina; Polpa dentária; Proteínas morfogenéticas ósseas.

INTRODUÇÃO

A reconstrução tecidual de lesões amplas, causadas por traumas, processos infecciosos, neoplasias ou anomalias de desenvolvimento, representa um desafio em cirurgias ósseas maxilofaciais. O resultado de tratamentos utilizados mostra-se muitas vezes imprevisível, demandando investigações continuadas sobre a natureza da osteogênese e métodos de controlá-la e estimulá-la.

Diversas substâncias demonstraram propriedades de acelerar ou iniciar o processo de reparo, induzindo a osteogênese. As matrizes óssea^1,6,9,17,21 e dentinária^4,8,10, utilizadas como material de implante osteoindutor, apresentam potencial osteogênico e quimiotático, sendo esta propriedade atribuída à presença de proteínas ósseas morfogenéticas, presentes nestes tecidos^2,3,4,8,15.

Desde os relatos iniciais de Marshall Urist²¹, demonstrando a presença de fatores protéicos morfogenéticos, muitos estudos foram conduzidos visando o isolamento e a purificação destes fatores^{1,11,13,14,15,16,18, 21}.

As diferentes sinonímias encontradas na literatura para as proteínas morfogenéticas devem-se ao envolvimento de vários laboratórios de engenharia genética interessados em sua comercialização¹. A expressão de diferentes BMPs durante o desenvolvimento sugere novas estratégias de intervenção terapêutica em sítios extra-ósseos. A aplicação clínica de BMPs, como se demonstrou, não está limitada à aceleração e indução à osteogênese. De grande importância na odontologia tem sido a indução de dentinogênese por BMPs após a exposição pulpar, bem como a aplicação local de BMPs em tecidos periodontais, visando o reparo destes tecidos.

Este artigo visa apresentar uma revisão concisa e atual sobre BMPs, enfocando sua atuação e aplicação clínica em procedimentos terapêuticos para o reparo tecidual.

IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO

A história da identificação e purificação da BMP iniciou-se em 1965, quando URIST²¹ induziu a neoformação óssea em sítios ectópicos (tecido subcutâneo e intramuscular), implantados com fragmentos de osso desmineralizado, no período de duas semanas. Embora não fosse possível determinar se o componente ativo no extrato ósseo era composto por uma ou mais moléculas, este foi identificado como sendo de origem protéica e denominado por URIST²¹ de proteína morfogenética óssea^1,18.

Devido à pequena quantidade de proteínas existente e a sua firme adesão aos componentes orgânicos e inorgânicos da matriz, o isolamento e a purificação das moléculas responsáveis pela atividade de formação óssea demonstrou ser um processo difícil de ser realizado. A matriz desmineralizada, extraída e inativada com agentes caotrópicos, apresenta atividade morfogenética restituída adicionando-se frações protéicas solubilizadas¹⁵, confirmando a existência de proteínas morfogenéticas.

Somente na última década, por meio de técnicas moleculares, identificou-se uma família de proteínas morfogenéticas estruturalmente relacionadas, contendo seqüências de aminoácidos homólogas às proteínas do Fator de Crescimento Transformador-beta (TGF-beta)^1,17,18.

As proteínas da superfamília do TGF-beta incluem mais de 25 fatores moleculares, contando as BMPs, sendo representadas não só em humanos, como também em outros animais vertebrados e invertebrados. A conservação evolucionária extraordinária de BMPs indica sua atuação crítica no desenvolvimento normal em animais. Membros desta família de proteínas morfogenéticas, possivelmente derivados de um gene ancestral comum, compartilham posições homólogas de pelo menos sete resíduos de cisteína⁵.

Um exemplo relatado de proteínas morfogenéticas entre os vertebrados é o produto do gene Vg-1 do Xenopus laevis, e, representando os invertebrados, encontra-se a proteína decapentaplégica (dpp) e produto do gene 60-A da Drosophila melanogaster^1,17,18, atuantes na determinação do mesoderma e ectoderma embrionário.

Utilizando testes in vivo de formação óssea ectópica, uma família de nove BMPs¹⁷ já foi identificada. Nestes testes, uma amostra de proteínas a ser testada, associada a um carreador inerte, é liofilizada e implantada no tecido subcutâneo de camundongos. Após um período determinado, as amostras são recolhidas e processadas, avaliando-se a atividade osteoindutora^1,14,15,17.

A análise da identidade das BMPs permite sua divisão em várias subfamílias. O exame da seqüência de aminoácidos das proteínas morfogenéticas demonstrou serem as proteínas BMP-2 e BMP-4 constituintes do subgrupo mais relacionado. Estas proteínas apresentam 86% de seqüências de aminoácidos idênticas entre si, e idênticos em 33-35% com o TGF-beta. Devido à homologia entre este subgrupo e às regiões substanciais de seqüências idênticas, estes são considerados como prováveis homólogos em mamíferos do peptídeo da Drosophilla^{1,14,16,18,21}.

O segundo subgrupo, formado por BMP-5, BMP-6 (Vgr-1), BMP-7 (OP-1) e BMP-8 (OP-2), exibe cerca de 73-83% de aminoácidos similares entre si, e são provavelmente homólogos do gene Vgr/60 A¹⁷. A BMP-6 humana apresenta 91% de seqüência de aminoácidos idêntica com o Vgr-1, um peptídio derivado da hibridização cruzada de aminoácidos do embrião de camundongo com Vg-1, uma proteína envolvida com o desenvolvimento, localizada no hemisfério vegetal em ovos de Xenopus laevis. Por esta razão, considera-se o Vgr-1 como o homólogo nos roedores da BMP-6 humana¹⁵.

A BMP-3, ou osteogenina, como a proteína morfogenética mais distinta, forma por si só o terceiro grupo, com 45% de seqüências idênticas ao BMP-2¹⁷. A BMP-1 diferencia-se das demais BMPs por não apresentar atividade morfogenética e não pertencer à família do TGF-beta, sendo hoje considerada como um procolágeno C-proteinase¹⁷.

Uma subfamília de proteínas similares a BMP, importantes na formação óssea, clonada mais recentemente, foi denominada de fator de crescimento e diferenciação 5 (GDF-5) ou proteína morfogenética derivada de cartilagem 1 (CDMP-1), GDF-6 ou CDMP-2, e GDF-7 ou BMP-12. Estas são homólogas em 80-86% entre si, e 46-57% idênticas de BMP-2 até o BMP-8¹⁷.

Embora a função exata e a inter-relação de cada BMP não estejam ainda completamente esclarecidas, evidências indicam sua atuação como parte de uma cascata complexa de fatores reguladores de diferenciação celular, aumentando a expressão de condroblastos e osteoblastos em sítios ósseos lesados¹⁵. A possível conservação evolucionária estrutural e funcional dos genes de BMPs sugere funções críticas regulatórias no processo de diferenciação¹⁵ durante o desenvolvimento.

ORIGEM E OBTENÇÃO

Produto do metabolismo de osteoblastos, odontoblastos e de várias células tumorais, BMPs são armazenadas em forma concentrada em osso, dentina e em células neoplásicas do osteossarcoma

¹⁵.

BMPs originadas de osso, dentina e tecido em reparo de alvéolos dentários de coelhos 14 dias após a exodontia demonstraram potencial de atividade osteoindutora similar

³. BMPs óssea e a dentinária, quando implantadas em tecido muscular de ratos, apresentam atividades e propriedades semelhantes, estimulando a neoformação óssea.

A extração de BMPs foi obtida de vários animais, como bois, porcos, ratos, camundongos, cães e coelhos, bem como de humanos

^2,3,12,17,21. A atuação de BMPs originadas de diversos animais foi comparada, efetuando-se sua implantação em músculo de ratos

². Independentemente da espécie animal de onde foi extraída, a BMP promoveu osteoindução.

O uso de BMP bovina (bBPM) tem sido mais freqüentemente relatado em pesquisas devido à maior disponibilidade de ossos destes animais, bem como as amplas dimensões apresentadas por estes ossos, possibilitando a obtenção de quantidades superiores de matriz óssea e, conseqüentemente, de BMPs

⁶.

Em humanos, WOZNEY et al^.

22, no ano de 1988, descreveram pela primeira vez e caracterizaram extensivamente várias espécies de BMP (hBMP), relatando seqüências inteiras de aminoácidos da BMP-1, BMP-2 e BMP-3. BMPs em humanos estão associadas com duas outras moléculas de baixo peso molecular que podem ser removidas sem perda de atividade morfogenética. Os principais fatores impedindo testes em ampla escala de implantes de hBMP têm sido a quantidade limitada deste material em ossos (é necessária uma tonelada de pó de osso para extrair um grama de BMP), a dificuldade para extraí-lo e o processo extremamente dispendioso.

Os genes produtores de BMPs, identificados por técnicas de DNA recombinante, têm sido utilizados para sintetizar BMP recombinante (rBMP) em culturas de células de mamíferos, produzindo proteínas altamente ativas e potencialmente disponíveis, bem como maiores frações do que era anteriormente possível

¹⁷.

A hibridização in situ de várias espécies de embriões tem mostrado atividade de BMPs junto aos tecidos em formação. Mais recentemente, as BMPs foram detectadas em órgãos em desenvolvimento, como rins, pulmões, cérebro e coração, demonstrando serem suas funções não exclusivamente relacionadas ao desenvolvimento do esqueleto, mas também ao de outros órgãos

¹.

OP-1 (BMP-7) está expresso em altos níveis nos rins e BMP-3 nos pulmões, sugerindo uma participação endócrina na homeostasia dos tecidos ósseos. BMP-2 e BMP-4 foram demonstrados no desenvolvimento do germe dentário, na camada odontoblástica, palato e em outros sítios cranio-faciais

15. Os maiores níveis de RNAm para BMP-2, entretanto, são encontrados em células ósseas subperiosteais, demonstrando o papel destas moléculas na formação óssea

²².

ATUAÇÃO E IMPLICAÇÕES TERAPÊUTICAS

BMPs são pleiotrópicos e influenciam várias funções, incluindo a iniciação e promoção da formação óssea e cartilaginosa in vivo, e a estimulação de células da polpa dentária num fenótipo odontoblástico¹⁴.

Os efeitos das proteínas morfogenéticas ósseas podem ser observados em células fonte-mesenquimais geradoras de clones celulares osteogênicos, tanto in vivo como in vitro ^{2,8,14,15,16,17,18}. A resposta celular, descrita após a aplicação de BMPs em tecidos ectópicos, consiste na quimiotaxia, promovendo a migração de células mesenquimais indiferenciadas e monócitos para o local de implante; proliferação celular e diferenciação em condroblastos e osteoblastos; síntese dos componentes da matriz; maturação; mineralização e remodelação, resultando na formação de um ossículo^{1,14,16,18,21}.

Por causa de sua atividade no desenvolvimento e capacidade de induzir a formação óssea ectópica, as BMPs podem ser consideradas fatores de diferenciação ou morfogenéticos, representando uma classe distinta de fatores de crescimento. Fatores de crescimento, como o TGF-beta, estimulam a proliferação celular, podendo também ser encontrados em ossos de adultos e associados ao reparo tecidual, mas não apresentam propriedade osteoindutora¹⁴.

A capacidade de BMPs iniciarem uma cascata programada de eventos celulares, resultando na indução óssea, um processo utilizado na embriogênese e recapitulado na osteogênese pós-natal, pode ser explorado na iniciação terapêutica da formação óssea.

O uso de BMPs em procedimentos reconstrutores para a indução da osteogênese representa uma alternativa para enxertos ósseos autógenos e aloimplantes, diminuindo o risco de complicações associadas às cirurgias e limitações do doador. BMPs recombinantes humanas (BMP-2 e BMP-7) usadas em calvária, ossos longos, mandíbula e maxila de animais induziram o reparo ósseo de defeitos de tamanho crítico^5,17, ou seja, de defeitos com dimensões demasiadamente amplas, que impossibilitam a neoformação óssea, resultando em formação de tecido fibroso cicatricial.

A aplicação de BMP em polpa dentária vem sendo pesquisada desde 1990 por NAKASHIMA^11,12,13. A BMP implantada em polpa dentária, segundo este autor, dissolve-se nos fluidos teciduais num período de duas semanas após a sua aplicação, estimulando a mitose de células migratórias mesenquimais e diferenciação direta destas células em odontoblastos, ou em osteodentinoblastos. Para ocorrer a diferenciação celular, entretanto, o uso de BMP deve estar associado com um carreador adequado. A matriz dentinária, sugere o autor, pode prover uma superfície adequada para a fixação de células mesenquimais indiferenciadas, propiciando a sua diferenciação.

Experiências in vitro, utilizando extratos crus de BMPs em cultura de células pulpares, demonstraram estimular a formação de dentina. In vivo, a aplicação de BMP-4 e BMP-7 recombinante humana sobre a polpa de cães determinou a formação de dentina. Após o período de 2 meses, a área correspondente à polpa amputada estava preenchida com dentina tubular, na área inferior, e osteodentina, na área superior¹¹. Estes achados, segundo NAKASHIMA^11,12,13, indicam o uso de BMPs como agentes capeadores bioativos, induzindo a dentinogênese.

A formação de dentina reparadora, em dentes de macacos, foi similarmente observada administrando-se a BMP-7 (OP-1) associada a uma matriz de colágeno inativa, cujas proteínas osteogênicas e fatores de crescimento foram removidos¹⁹. No período de seis semanas, notou-se a formação de dentina reparadora, substituindo o material de implante aplicado¹⁹.

A indução à osteogênese e à cementogênese representa um problema central no reparo de tecidos lesados por doença periodontal. A aplicação de BMP bovina em defeitos de furca classe II, em babuínos, resultou em 70% de recuperação óssea em altura e inserção dentro da furca¹⁵. A orientação do ligamento periodontal, bem como a cementogênese, também é influenciada por BMPs. Em defeitos periodontais de cães²⁰, o uso local de rhBMP-2 induziu a reparação do osso alveolar, resultando na recuperação em altura de 95%.

Várias pesquisas concentram-se no desenvolvimento do melhor substrato carreador, permitindo o uso clínico da BMP com atividade osteogênica intacta. Para um efeito osteoindutor efetivo, as proteínas morfogenéticas, por serem rapidamente difusíveis e solúveis em água, precisam ser implantadas com um carreador apropriado. Entre os biomateriais testados como carreador incluem-se os vários componentes da matriz extracelular isolados ou combinados (colágeno, fibronectina, glicosaminoglicanas), hidróxido de cálcio e fosfato de cálcio¹⁸.

A identificação de BMPs em osteossarcomas, expressando altos níveis de BMP-2 e BMP-4, levanta alguns questionamentos. Poderiam estas proteínas morfogenéticas também atuar como agentes oncogênicos? A aplicação de BMPs poderia estimular a oncogênese? O uso de BMPs, porém, não demonstrou elicitar respostas oncológicas. Os eventos oncológicos provavelmente aumentaram a expressão de BMPs, ativas não somente na diferenciação celular, mas também na angiogênese. A vida média curta das BMPs também contribui para que a indução de neoplasias pelo uso de BMPs mostre-se improvável¹⁵.

PERSPECTIVAS TERAPÊUTICAS FUTURAS

O desenvolvimento de pesquisas centradas na formulação de sistemas carreadores para as BMPs mostra-se necessário sob uma perspectiva terapêutica. O uso de colágeno e sistemas carreadores associados ao colágeno, embora amplamente difundido, está associado a algumas desvantagens. Entre estas estão incluídas a fraca estabilidade mecânica, a resposta imunogênica e o potencial de transmissão de antígenos virais. O substrato carreador ideal preencheria os seguintes requisitos: (1) relativa insolubilidade em condições fisiológicas; (2) ser biodegradável; (3) proteger contra atividades proteolíticas; (4) funcionar como substrato para a adesão e proliferação celular; (5) ser inerte imunologicamente; (6) obter a liberação vagarosa de BMP através da degradação biológica controlada; (7) ter estabilidade mecânica para unir defeitos ósseos⁶.

O significado biológico da presença de múltiplas formas de BMPs demanda novos estudos, podendo determinar a escolha do fator mais apropriado em procedimentos terapêuticos. O desenvolvimento do perfil estrutural e funcional entre os diferentes membros da família de proteínas morfogenéticas possibilitará o direcionamento de novas técnicas.

A disponibilidade de BMPs recombinantes humanas, obtidas por meio de técnicas de clonagem molecular, fornece novos desafios e oportunidades para adquirir-se conhecimentos nos mecanismos de controle do reparo tecidual. A exploração de técnicas de biologia molecular, buscando a revelação dos fatores responsáveis pela programação do DNA, possibilitará direcionar as células à produção de novos tecidos.

Por representarem um grupo distinto de fatores indutores, capazes de estimular a diferenciação de células fonte-mesenquimais em células especializadas, induzindo a neoformação óssea, o reparo de tecidos periodontais e a formação de dentina reparadora, as BMPs apresentam diversas possibilidades de aplicação em odontologia. As indicações para o uso de BMPs estão associadas principalmente a grandes perdas ósseas, decorrentes de anomalias de desenvolvimento e neoplasias, bem como de doenças infecciosas e inflamatórias, como doenças periodontais. Outras indicações possíveis para seu uso incluem a elevação do rebordo alveolar; como auxiliar da osteointegração na superfície de implantes; em fraturas extensas com perda tecidual, impossibilitando a coaptação dos segmentos; e na indução à formação de dentina reparadora.

A avaliação definitiva do uso clínico de BMPs será possível após a elucidação de todos os diferentes fatores influentes na determinação do reparo tecidual e na atividade do implante, bem como após o desenvolvimento de um sistema carreador apropriado. A caracterização completa das BMPs e a compreensão de sua atuação nos diferentes estádios de neoformação óssea e dentinária possibilitarão a formulação de tratamentos mais adequados, estimulando-se os próprios tecidos ao processo de reparo.

GONÇALVES, E.A.L.; GUIMARÃES, S.A.C.; GARCIA, R.B. Bone morphogenetic proteins: molecular approaches to tissue repair. Rev Odontol Univ São Paulo, v. 12, n. 3, p. 299-304, jul./set. 1998.

Research into the molecular initiators of bone development and repair has culminated in the identification of an entirely new family of proteins that regulate bone and cartilage formation in vivo. These proteins are known as bone morphogenetic proteins or BMPs and are capable of inducing bone formation when implanted into ectopic sites. The purification and characterization of BMPs, until recently an elusive goal, have laid the foundation for the cellular and molecular dissection of bone development and regeneration. BMPs, critical in the normal development of animals, may play multiple roles, not exclusively pertinent to bone tissue. This review aims to present a concise perspective of BMPs, and their potential role and application for regenerative procedures.

UNITERMS: Bone regeneration; Dentin; Dental pulp; Bone morphogenetic proteins.

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Recebido para publicação em 17/12/97

Reformulado em 06/05/98

Aceito para publicação em 29/05/98

• ²
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*

Profa. Assistente de Patologia da Universidade Estadual de Maringá.

**

Prof. Doutor da Disciplina de Endodontia da FOB - USP.

***

Prof. Titular do Departamento de Patologia Bucal da FOB - USP.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  10 Nov 1999
• Data do Fascículo
  Jul 1998

Histórico

• Aceito
  29 Maio 1998
• Revisado
  06 Maio 1998
• Recebido
  17 Dez 1997