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Revista Brasileira de Fisiologia Vegetal

versão impressa ISSN 0103-3131

Rev. Bras. Fisiol. Veg. v.13 n.2 Lavras  2001

http://dx.doi.org/10.1590/S0103-31312001000200005 

RELAÇÃO DA LEITURA DO CLOROFILÔMETRO COM OS TEORES DE CLOROFILA EXTRAÍVEL E DE NITROGÊNIO NA FOLHA DE MILHO1

 

GILBER ARGENTA2, PAULO REGIS FERREIRA DA SILVA2, CLAYTON GIANI BORTOLINI2, EVERTON LEONARDO FORSTHOFER, MÉRCIO LUIZ STRIEDER2

Departamento de Plantas de Lavoura, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, 91540-000

 

 

RESUMO - Os métodos utilizados para determinar a quantidade de clorofila na folha requerem destruição de amostras de tecido e muito trabalho no processo de sua obtenção. O recente desenvolvimento do medidor portátil de clorofila, que permite leituras instantâneas do teor relativo de clorofila na folha sem destruí-la, surgiu como uma nova técnica para estimar esse parâmetro. Com os objetivos de avaliar a relação entre leitura do clorofilômetro com os teores de clorofila extraível e de nitrogênio na folha em três estádios de desenvolvimento da planta de milho e de validar o uso do equipamento como parâmetro para estimar o teor relativo de clorofila na folha, conduziu-se um experimento no município de Eldorado do Sul, na região fisiográfica da Depressão Central do Estado do Rio Grande do Sul, no ano agrícola de 1999/2000. Os tratamentos constaram de dois híbridos de milho (Pioneer 32R21 e Premium) e de oito sistemas de manejo de nitrogênio em cobertura. As leituras com clorofilômetro, a extração de clorofila e a determinação do teor de nitrogênio da folha foram realizadas nos estádios de seis a sete folhas, 10 a 11 folhas e de espigamento do milho. Nos dois híbridos, as quantidades de clorofila total e das clorofilas a e b extraíveis foram significativamente relacionadas às leituras do clorofilômetro, nos três estádios de desenvolvimento avaliados. A leitura realizada com clorofilômetro estimou com boa precisão o teor relativo de clorofila na folha de milho, além de apresentar as vantagens de maior rapidez, menor custo e de não implicar em destruição de folhas. No entanto, o clorofilômetro não é muito preciso para avaliação do nível de N na planta nos estádios iniciais de desenvolvimento de milho (seis a sete folhas).
TERMOS ADICIONAIS PARA INDEXAÇÃO: Zea mays, leitura SPAD, estádios de desenvolvimento.

RELATIONSHIP OF READING OF PORTABLE CHLOROPHYLL METER WITH CONTENTS OF EXTRACTABLE CHLOROPHYLL AND LEAF NITROGEN IN MAIZE

ABSTRACT - The methods used to determine the amount of leaf chlorophyll require destruction of tissues samples and much work in the process of its attainment. The recnt development of the portable chlorophyll meter, that makes instantaneous readings of relative chlorophyll content in leaf, without necessity of leaf destruction, appears as a new technique to estimate this parameter. With the objectives to evaluate the relation between readings of portable chlorophyll meter with of extractable chlrophyll and nitrogen contents in the leaf in three development stages of plant maize and to validate the use of this equipment as a parameter to estimate chlorophyll relative content in leaf, an experiment was conducted in the state of Rio Grande do Sul, Brazil, in the 1999/2000 growing season. Treatments consisted of two maize simple hybrids (Pioneer 32R21 and Premium) and eight nitrogen management systems. The readings with portable chlorophyll meter and the chlorophyll extration and nitrogen content determination in leaf were taken in the stages 6 to 7 leaves, 10 to 11 leaves and silking. In the two hybrids, the amounts of total chlorophyll and chlorophylls a and b were significantly related to the readings of portable chlorophyll meter, in the three development stages evaluated. The readings carried out with portable chlorophyll meter estimated with good accuracy the relative chlorophyll content in maize leaf. In addition, this method present the advantages to have higher performance, minor cost and not implying in leaf destruction. However, portable chlorophyll meter is not very accurate to evaluate N level in plant in initial stages of plant development (6 to 7 leaves).
ADDITIONAL INDEX TERMS: Zea mays, SPAD reading, development stages.

 

 

INTRODUÇÃO

Os métodos tradicionais utilizados para determinar a quantidade de clorofila na folha requerem destruição de amostras de tecido e muito trabalho nos processos de extração e quantificação. O recnte desenvolvimento de um medidor portátil de clorofila, que permite medições instantâneas do valor correspondente ao seu teor na folha sem destruí-la, constitui uma alternativa para estimar o teor relativo desse pigmento na folha (Dwyer et al., 1991; Argenta et al., 2001).

A determinação do teor relativo de clorofila por meio do clorofilômetro está sendo utilizado para predizer a necessidade de adubação nitrogenada em várias culturas, dentre as principais: arroz (Turner e Jund, 1991; Peng et al., 1993; Stalin et al., 2000; Balasubramanian et al., 2000); trigo (Follet et al., 1992; Reeves et al., 1993; Fox et al., 1994; Bredemeier, 1999) e milho (Piekielek e Fox, 1992; Smeal e Zhang, 1994; Blackmer e Schepers, 1995; Waskom et al., 1996; Varvel et al., 1997; Argenta et al., 2001). O teor de clorofila na folha é utilizado para predizer o nível nutricional de nitrogênio (N) em plantas, devido ao fato de a quantidade desse pigmento correlacionar-se positivamente com teor de N na planta (Piekielek e Fox, 1992; Smeal e Zhang, 1994; Booij et al., 2000). Essa relação é atribuída, principalmente, ao fato de que 50 a 70 % do N total das folhas ser integrante de enzimas (Chapman e Barreto, 1997) que estão associadas aos cloroplastos (Stocking e Ongun, 1962).

A vantagem da medição do teor de clorofila é de não ser influenciada pelo consumo de luxo de N pela planta, sob forma de nitrato (Blackmer e Schepers, 1995). A baixa sensibilidade do medidor de clorofila ao consumo de luxo de N pelas plantas de milho é atribuída à forma com que esse nutriente se encontra na folha. Quando absorvido em excesso, acumula-se como nitrato. Nessa forma, o N não se associa à molécula de clorofila e, portanto, não pode ser detectado pelo medidor de clorofila (Dwyer et al., 1995). Por apresentar baixa sensibilidade ao consumo de luxo de N, a medição efetuada pelo medidor de clorofila está sendo considerada melhor indicadora do nível desse nutriente na planta do que seu próprio teor (Blackmer e Schepers, 1995).

As leituras efetuadas pelo medidor portátil de clorofila correspondem ao teor relativo de clorofila presente na folha da planta. Os valores são calculados pelo equipamento com base na quantidade de luz transmitida pela folha, em dois comprimentos de ondas, com diferentes absorbâncias da clorofila (Minolta, 1989). As regiões de picos de absorbância da clorofila são o azul e o vermelho. As de baixa absorbância situam-se na região do verde e as de absorbância extremamente baixa na região do infravermelho (Hendry, 1993). Em função disso, os comprimentos de ondas escolhidos para medição do teor de clorofila, ou do índice de esverdeamento

da folha, situam-se na faixa do vermelho, em que a absorbância pela clorofila é alta e não é afetada pelos carotenóides, e na do infravermelho, em que a absorbância é extremamente baixa.

O medidor de clorofila possui diodos que emitem luz a 650 nm (vermelho) e a 940 nm (infravermelho). A luz em 650 nm situa-se próxima dos dois comprimentos primários de ondas associados à atividade da clorofila (645 e 663 nm). O comprimento de onda de 940 nm serve como referência interna para compensar diferenças na espessura ou no conteúdo de água da folha ou que sejam devidas a outros ftores (Waskom, 996). A luz que passa através da amostra da folha atinge um receptor (fotodiodo de silicone) que converte a luz transmitida em sinais elétricos analógicos. Por meio do conversor A/D, esses sinais são amplificados e convertidos em sinais digitais (Minolta, 1989), sendo usados por um microprocessador para calcular os valores SPAD ("Soil plant analysis development"), que são mostrados num visor. Os valores obtidos são proporcionais ao teor de clorofila presente na folha.

Alguns pesquisadores têm demonstrado a existência de relação entre índice de esverdeamento e teor de clorofila na folha em várias espécies de planta (Marquard e Tipton, 1987; Dwyer et al., 1995). Porém, existem poucos trabalhos que determinam a relação entre clorofila extraível e leitura do clorofilômetro em diferentes estádios de desenvolvimento do milho. Com este trabalho objetivou-se avaliar a relação entre a leitura do clorofilômetro com os teores de clorofila extraível e de nitrogênio na folha em três estádios de desenvolvimento do milho e também validar o uso do equipamento como parâmetro para estimar o teor relativo de clorofila na folha.

 

MATERIAL E MÉTODOS

O experimento foi conduzido a campo na Estação Experimental Agronômica da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, localizada no município de Eldorado do Sul, região fisiográfica da Depressão Central, do Estado do Rio Grande do Sul, na estação de crescimento 1999/2000. O clima da região é classificado, segundo Köppen, como subtropical úmido, situado na transição entre os tipos fundamentais cfa1 (isoterma anual inferior a 18ºC) e cfa2 (isoterma anual superior a 18ºC) (Moreno, 1961). As temperaturas médias anual, máxima e mínima são de 19,6, 24,3 e 14,8 ºC, respectivamente (Ipagro, 1989). O solo da área experimental é classificado como ARGISSOLO VERMELHO Distrófico típico (EMBRAPA, 1999).

Os tratamentos constaram de dois híbridos simples de milho (Pioneer 32R21, ciclo superprecoce, e Premium, ciclo precoce) e de oito sistemas (S) de manejo de N em cobertura. Os sistemas de manejo S1 a S5 representam níveis de suprimento de N em cobertura correspondendo a aplicações de, respectivamente, 0, 70, 175, 350 e 525 kg ha-1. Utilizaram-se diferentes sistemas de manejo de N para criar variabilidade nos teores de clorofila e N na folha de milho, e também para avaliar os níveis adequados de N, em quatro estádios de desenvolvimento do milho, determinados com base em leituras efetuadas no clorofilômetro (ver Argenta, 2001). Os níveis de N foram aplicados em quatro épocas. No estádio de três a quatro folhas, foram aplicadas as doses de 10, 25, 50 e 75 kg ha-1, correspondendo, respectivamente, aos sistemas S2 a S5. O restante do N foi aplicado em três doses iguais, nos estádios de seis a sete folhas, 10 a 11 folhas expandidas e de espigamento. Outros três sistemas equivalentes, respectivamente, aos sistemas S3, S4 e S5, foram os tratamentos monitorados, em que as doses de N somente foram aplicadas quando as leituras obtidas no clorofilômetro eram inferiores ao estabelecido como adequado nos respectivos estádios de desenvolvimento da planta. As leituras no clorofilômetro correspondentes ao nível adequado de N utilizadas foram de 45,4, 52,1, 55,3 e 58,0, respectivamente, para os estádios de três a quatro folhas, seis a sete folhas, 10 a 11 folhas expandidas e de espigamento (ver Argenta, 2001).

Os híbridos de milho foram implantados no dia 18 de outubro de 1999, em sistema de semeadura direta em sucessão ao consórcio de aveia preta e ervilhaca comum, com espaçamento entre linhas de 0,7 m e densidade de 75.000 plantas ha-1. O delineamento experimental utilizado foi de blocos casualizados, dispostos em parcelas subdivididas, com quatro repetições. Os híbridos foram locados nas parcelas principais e os sistemas de manejo de N, nas subparcelas. Por ocasião da semeadura, foi realizada adubação em linha com 30 kg ha-1 de N, 120 kg ha-1 de P2O5 e 120 kg ha-1 de K2O.

As determinações realizadas foram: leitura correspondente ao teor de clorofila na folha com o clorofilômetro marca Minolta (modelo SPAD-502) e teores de clorofila extraível e de N total na folha. As determinações foram realizadas nos estádios de seis a sete folhas e de 10 a 11 folhas completamente desenvolvidas e no espigamento, utilizando-se cinco folhas por subparcela. Nos estádios vegetativos, as leituras com medidor de clorofila foram realizadas na 6ª e 9ª folhas totalmente expandidas, correspondendo, respectivamente, aos estádios de seis a sete folhas e 10 a 11 folhas expandidas. No estádio de espigamento, as leituras foram realizadas na folha-índice (primeira abaixo da espiga). Nos estádios de seis a sete folhas e de 10 a 11 folhas expandidas, os sistemas S3 a S5 não foram avaliados pelo fato de as leituras obtidas no clorofilômetro, nos tratamentos S3, S4 e S5 monitorados, serem inferiores ao estabelecido nesses estádios. Portanto, o nível de N aplicado nos sistemas S3 a S5 até esse estádio foi o mesmo em seus respectivos sistemas monitorados.

As leituras no medidor de clorofila (duas por folha) foram feitas em pontos situados na metade a dois terços do comprimento da folha amostrada, a partir da base, e a 2 cm de uma das margens da folha. Após a leitura, as folhas foram arrancadas para determinação dos teores de clorofila e de N. De cada folha (cinco por amostra), retirou-se um disco de 1,33 cm2 da região onde foram efetuadas as leituras com clorofilômetro. A extração de clorofila foi realizada com 20 ml de etanol 99,9% durante cinco dias. As concentrações de clorofila total e das clorofilas a e b (m g/ml de solução) na folha foram obtidas de acordo com as equações propostas por Knudson et al. (1977):

Clorofila a = (13,70)(Abs665 nm) – (5,76)(Abs649 nm) (1)

Clorofila b = (25,80)(Abs649 nm) – (7,60)(Abs665 nm) (2)

O restante das folhas em que foram realizadas as leituras e retirados os discos para extração de clorofila, foi seco em estufa a ± 60 ºC até atingir em peso constante. O teor de N foi determinado de acordo com metodologia descrita em Tedesco et al. (1995).

Os dados obtidos foram submetidos à análise de correlação linear simples. Fez-se análise de regressão entre leitura do clorofilômetro e clorofila extraível e entre leitura do clorofilômetro e teor de N no tecido.

 

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A análise de correlação simples evidenciou que, nos três estádios avaliados, as leituras do clorofilômetro correlacionaram-se positivamente com os teores de clorofila total e de clorofilas a e b extraíveis da folha (Tabela 1). Com relação à análise de correlação entre teor de N e clorofila extraível, verificou-se que apenas no estádio de seis a sete folhas o teor de N na folha não se correlacionou significativamente com os teores de clorofila total e de clorofilas a e b da folha. Nos estádios de 10 a 11 folhas expandidas e de espigamento, houve associação positiva entre essas variáveis. As leituras com o medidor portátil de clorofila correlacionaram-se positivamente com teor de N na folha nos três estádios avaliados. No entanto, apesar de significativa, a correlação foi menor no estádio de seis a sete folhas em relação aos outros dois estádios.

 

 

As quantidades de clorofila total e de clorofilas a e b extraíveis da folha foram significativamente relacionadas às leituras do clorofilômetro, nos três estádios de desenvolvimento e nos dois híbridos (Figs. 1a, 1b, 1c, 1d, 1e e ef). Os coeficientes de determinação variaram de 0,83 a 0,98, de 0,80 a 0,97 e de 0,72 a 0,98, respectivamente, para clorofila total e clorofilas a e b. A relação clorofila a/b não foi afetada nos dois híbridos pelos tratamentos com N nos três estádios de desenvolvimento do milho. Os valores médios dessa relação foram de 3,95 ± 0,09; 3,58 ± 0,09 e 3,64 ± 0,19, respectivamente, nos estádios de seis a sete folhas, 10 a 11 folhas e de espigamento.

 

 

A relação verificada entre leitura com medidor portátil de clorofila e teor de clorofila extraível evidencia que as leituras efetuadas com clorofilômetro estimam adequadamente o grau de esverdeamento da folha de milho, ou seja, o teor relativo de clorofila na folha, independente do estádio avaliado e do híbrido de milho.

 

 

Portanto, as leituras efetuadas pelo equipamento podem substituir, com boa precisão, as determinações tradicionais do teor de clorofila. Avaliações realizadas na cultura do milho (Dwyer et al, 1991) e em outras espécies (Yadava, 1986; Marquardt e Tipton, 1987; Tenga et al., 1989; Dwyer et al., 1995) também constataram relação significativa entre leitura do clorofilômetro e teor de clorofila extraível da folha.

 

 

A determinação do teor de clorofila pelo clorofilômetro apresenta algumas vantagens sobre o método de extração de clorofila. Dentre essas, destacam-se: a leitura pode ser realizada em poucos minutos; o aparelho tem custo mínimo de manutenção, ao contrário de outros testes que exigem compra sistemática de produtos químicos (Piekielek e Fox, 1992); não há necessidade de envio de amostras para laboratório, com economia de tempo e dinheiro, e podem ser realizadas quantas amostras forem necessárias, sem implicar em destruição de folhas (Malavolta et al., 1997).

Ao analisar a relação entre leitura do clorofilômetro e teor de N na folha de milho, constatou-se que, no estádio de seis a sete folhas, não houve relação entre as duas variáveis nos dois híbridos (Figs. 4A e 4B). Já nos estádios de 10 a 11 folhas e de espigamento, o teor de N na folha aumentou linearmente à medida que a leitura com clorofilômetro era maior (Figs. 5A, 5B, 6A e 6B).

 

 

 

 

Esses resultados confirmam os obtidos por outros pesquisadores (Schadchina e Dmitrieva, 1995; Booij et al., 2000). A falta de relação entre leitura com clorofilômetro e teor de N na folha (Figuras 4A e 4B) e de associação entre teor de N e clorofila extraível na folha (Tabela 1) em milho, no estádio de seis a sete folhas, indicam que boa parte do N absorvido nessa fase é provavelmente utilizado para produção de outras estruturas na planta e não para formação de clorofila, visto que a quantidade de nitrato presente deverá ser pequena, pois o mesmo é tóxico para a planta. Portanto, as leituras efetuadas com medidor portátil de clorofila, com objetivo de verificar o nível de N na planta, não são muito precisas nos estádios iniciais de desenvolvimento do milho.

Além da utilização no manejo de N em cereais, o clorofilômetro possui outras perspectivas de uso, como: integração de medidas de solo (teor de matéria orgânica, N disponível) com as leituras SPAD para refinar as recomendações de adubação nitrogenada (Waskom et al., 1996); nos modelos de simulação de crescimento (Peng et al., 1993) ou no monitoramento de mudanças no grau de esverdeamento da folha (Dwyer et al., 1991); verificação do nível de N em comunidade de plantas através de sensoreamento remoto (Bausch e Duke, 1996); determinação do nível de N em culturas-testes em diferentes estádios de desenvolvimento, para melhor entendimento da dinâmica desse nutriente no sistema solo-planta-alagamento; avaliação de linhas segregantes para eficiência no uso de N; escolha de linhas eficientes no uso de N para identificação de genes responsáveis pela alta eficiência no uso desse nutriente (Balasubramanian et al., 2000) e seleção de linhas superiores adaptadas a situações de estresse (deficiência ou excesso de água).

 

CONCLUSÕES

A leitura realizada com clorofilômetro estima com boa precisão o teor de clorofila na folha de milho e apresenta as vantagens de maior rapidez, menor custo e de não implicar em destruição de folhas.

Para avaliação do nível de N na planta nos estádios iniciais de desenvolvimento do milho (seis a sete folhas), a leitura realizada com o clorofilômetro não é muito precisa.

 

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Recebido: 28.02.01 - aceito: 10.07.01
1. Extraído da Tese de Doutorado, apresentada pelo primeiro autor à UFRGS, Porto Alegre, RS. Projeto parcialmente financiado pela Empresa Pioneer Sementes LTDA.
2. Departamento de Plantas de Lavoura da Faculdade de Agronomia da UFRGS. Av. Bento Gonçalves, 7712, Caixa Postal 776. 91540-000, Porto Alegre, RS. E-mail: paulo.silva@vortex.ufrgs.br

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