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Revista Brasileira de Terapia Intensiva

Print version ISSN 0103-507X

Rev. bras. ter. intensiva vol.22 no.3 São Paulo July/Sept. 2010

http://dx.doi.org/10.1590/S0103-507X2010000300005 

ARTIGO ORIGINAL

 

Efeito renoprotetor da estatina: modelo animal de isquemia-reperfusão

 

 

Claudia Akemi Shibuya TeshimaI; Mirian WatanabeI; Sandra Hideko NakamuraI; Maria de Fátima Fernandes VattimoII

IPesquisadora do Laboratório Experimental de Modelos Animais (LEMA) da Escola de Enfermagem da Universidade de São Paulo - USP - São Paulo, Brasil
IILivre docente, Professora da Escola de Enfermagem e Laboratório Experimental de Modelos Animais (LEMA) da Escola de Enfermagem da Universidade de São Paulo - USP - São Paulo, Brasil

Autor para correspondência

 

 


RESUMO

OBJETIVO: A lesão renal aguda isquêmica, de causa multifatorial, apresenta morbidade e mortalidade alarmantes. A estatina, inibidor de HMG-CoA redutase, tem demonstrado papel renoprotetor, com componente antioxidante, antiinflamatório e vascular. A atividade de heme oxigenase-1 pode ser mediadora desses efeitos pleitrópicos da estatina sobre o rim, ou seja, independente da ação de redução de lipídio. Esse estudo visou avaliar se o efeito renoprotetor da estatina pode ter mecanismo heme de proteção em ratos.
MÉTODOS: O modelo isquêmico foi obtido por meio do clampeamento dos pedículos renais bilaterais por 30 minutos, seguido de reperfusão. Foram utilizados ratos Wistar, machos, pesando entre 250-300g, distribuídos nos seguintes grupos: SHAM (controle, sem clampeamento renal); Isquemia; Iquemia+Estatina (sinvastatina 0,5 mg/kg, via oral por 3 dias); Isquemia+Hemin (indutor de HO-1, 1 mg/100g, intraperitoneal 24h antes da cirurgia); Isquemia+SnPP (inibidor de HO-1, 2
μmol/kg intraperitoneal 24h antes da cirurgia); Isquemia+Estatina+Hemin e Isquemia+Estatina+SnPP. Foram avaliados a função renal (clearance de creatinina, Jaffé), osmolalidade urinária, peróxidos urinários e a imunohistoquímica para ED-1.
RESULTADOS: Os resultados mostraram que a estatina melhorou a função renal, a osmolalidade urinária, reduziu a excreção de peróxidos urinários e a infiltração de macrófagos em rins de animais submetidos à isquemia renal. O indutor da heme oxigenase-1 e a sua associação com sinvastatina reproduziram o padrão de melhora determinado pela sinvastatina.
CONCLUSÃO: O estudo confirmou o efeito renoprotetor da estatina, com ação antioxidante e antiinflamatória, e sugere que esse efeito tenha interface com o sistema heme de proteção renal.

Descritores: Rim/lesões; Sinvastatina; Inibidores de hidroximetilglutaril-CoA redutases; Heme oxigenase-1; Ratos Wistar


 

 

INTRODUÇÃO

A isquemia por hipotensão ou sepsis é uma das causas mais frequentes de lesão renal aguda isquêmica (LRAi) em pacientes críticos. No período pós transplante pode representar a perda do enxerto. A LRAi envolve uma cascata de eventos com alterações da hemodinâmica glomerular, lesão tubular, ativação da resposta inflamatória e liberação de espécies reativas de oxigênio (EROs).(1) Modelos in vivo de isquemia/reperfusão (I/R) renal são utilizados para elucidar mecanismos fisiopatológicos ou implementar terapias farmacológicas de proteção renal. Nesse contexto, a sinvastatina tem sido considerada por suas ações pleitrópicas renais caracterizadas como antiinflamatória, antioxidante e de proteção vascular. Ressalte-se que pleitrópicas se caracterizam por ações independentes da ação lipolítica primária. Evidências recentes confirmam a prevenção de reações vasculares inflamatórias em estudos clínicos e em modelos animais após a administração de estatinas.(2)

Mecanismos de proteção e adaptação celular, como a enzima heme oxigenase-1 (HO-1), são induzidos frente ao insulto isquêmico. A heme oxigenase é uma enzima limitadora que degrada a heme, facilitando a sua conversão para biliverdina. Essa conversão, que necessita de fosfato dinucleotídeo adenina nicotinamida (NADPH), libera metal ferroso e produz monóxido de carbono que, pela ação da biliverdina redutase a biliverdina, é convertido em bilirrubina. Todas as moléculas resultantes desta reação são liberadas em quantidades equimolares e possuem funções antioxidante, antiinflamatória, anti-apoptótica e possivelmente modulatória do sistema imune. Estudos com modelos animais de nefrotoxicidade e de isquemia renal confirmaram que o efeito protetor desta enzima pode ser resultante da liberação de subprodutos.(3)

A ausência de possibilidades clínicas de resgate ou prevenção da lesão renal aguda (LRA) em pacientes graves gera desconforto e indignação diante das estatísticas desfavoráveis. Esse cenário estimula o desenvolvimento de estudos que visem elucidar os mecanismos precisos envolvidos na lesão, em que interferências farmacológicas, como podem ser a estatina e o sistema heme oxigenase, venham a representar alternativa no tratamento. De fato, a ocorrência de lesão súbita, como é o caso da LRA, pode engessar procedimentos de prevenção. Contudo, a estatina tem demonstrado resultados significativos também após dose única administrada 30 minutos antes da lesão, reforçando seu desempenho promissor mesmo em situações agudas.(4) Este estudo teve como objetivo verificar a ação protetora renal da sinvastatina no modelo animal de I/R e avaliar se a mediação pela enzima heme-oxigenase 1 pode estar presente.

 

MÉTODOS

Todos os procedimentos realizados neste estudo estão de acordo com os Princípios Éticos de Experimentação Animal adotado pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA) e foram aprovados pela Comissão de Ética em Experimentação Animal do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade de São Paulo. Todos os animais tiveram acesso livre à água e alimentos permanecendo em condições térmicas com ciclos de dia e noite durante todo o experimento.

Foram utilizados ratos Wistar, machos e adultos, pesando entre 250 - 300 gramas divididos nos seguintes grupos: SHAM - simulação do ato cirúrgico, Isquemia - clampeamento bilateral dos pedículos renais durante 30 minutos, Isquemia + estatina - isquemia renal em animais pré condicionados durante 3 dias com Sivascor®-Baldacci 0,5 mg/kg por gavagem (v.o.), Isquemia + Hemin - isquemia renal e pré condicionamento com Hemin-Sigma, indutor de HO-1 , 1 mg/100g , intraperitoneal (i.p.), 24 horas antes da cirurgia, Isquemia + protoporfirina de estanho (SnPP) - isquemia renal e pré condicionamento com SnPP-Sigma, inibidor seletivo de HO-1 , 2 μmol/kg , intraperitoneal (i.p.), 24 horas antes da cirurgia, Isquemia + estatina + Hemin - isquemia renal e pré condicionamento com sinvastatina e Hemin, Isquemia + estatina + SnPP - isquemia renal e pré condicionamento com sinvastatina e SnPP.

Os animais foram anestesiados com tiopental de sódio 40 - 50 mg/kg, i.p. e submetidos à laparotomia para clampeamento bilateral dos pedículos renais durante 30 minutos e restabelecimento da perfusão renal. Os animais foram colocados em gaiolas metabólicas para coleta de urina de 24 horas para estudo de função renal (FR) e estresse oxidativo. Após este período, os animais foram anestesiados novamente com tiopental de sódio 60 mg/kg para nova laparotomia e coleta de sangue por meio da punção da aorta abdominal para estudos de função renal. O rim esquerdo de cada animal foi retirado para estudos de imunohistoquímica.

Função renal

Avaliada pelo clearance de creatinina por meio da mensuração de creatinina plasmática e urinária realizada pelo método de Jaffé.(5)

Função tubular

Mensuração da osmolalidade urinária por meiodo osmômetro - Advanced Osmometer® - model 3D3.

Estresse oxidativo

Mensuração dos níveis de peróxidos urinários (PU) por meio do método FOX-2. A mensuração dos níveis de PU é considerada biomarcador da geração de peróxidos de hidrogênio e preditor da extensão de estresse oxidativo em modelos experimentais in vivo.(6,7)

Imunohistoquímica

Lâminas de coloração imunohistoquímica com uso de anticorpo monoclonal anti ED-1 (macrófago e monócitos) - Serotec.

Análise estatística

Utilizou-se o método GLM (Anova univariada) e teste de comparações múltiplas ajustados para Bonferrone. Os valores p<0,05 foram considerados significantes.

 

RESULTADOS

A tabela 1 mostra a redução significativa da filtração glomerular (Isquemia 0,20±0,02 versus SHAM 0,60±0,07; p<0,05) e função tubular (Isquemia 766±188 versus SHAM 1793±191; p<0,05) nos animais submetidos à isquemia renal de 30 minutos quando comparados com o grupo controle SHAM, confirmando o modelo de LRAi, com manutenção do fluxo urinário. O pré condicionamento com sinvastatina, o indutor de HO-1 e associação sinvastatina e indutor demonstraram melhora da FR com elevação dos valores de clearance de creatinina e (Isquemia+ Estatina 0,49±0,04; Isquemia + Hemin 0,46±0,03; Isquemia + Estatina + Hemin 0,54±0,07 versus Isquemia 0,20±0,02; p<0,05) e função tubular (Isquemia+ Estatina 1153±404; Isquemia + Hemin 1013±211; Isquemia + Estatina + Hemin 1314±394 versus Isquemia 766±188; p<0,05). A administração do inibidor HO-1 e a associação sinvastatina e inibidor de HO-1 induziram elevação dos valores de clearance de creatinina, porém na comparação entre os tratamentos associados prevaleceu a diferença estatística em favor ao Hemin, indutor de HO-1 (Isquemia + Estatina + Hemin 0,54±0,07 versus Isquemia + Estatina + SnPP 0,36±0,07; p<0,05).

A tabela 2 apresenta valores de PU. Observou-se que o grupo de animais submetidos à isquemia renal apresentou valores de PU superiores ao grupo controle, confirmando o envolvimento do mecanismo oxidativo nesse modelo de lesão (Isquemia 13,5±0,8 versus SHAM 5,6±0,9; p<0,05). Os animais submetidos à isquemia e pré condicionados com sinvastatina ou com o indutor de HO-1 responderam com redução dos valores de PU em relação ao grupo Isquemia (Isquemia+ Estatina 7,9±1,0; Isquemia+Hemin 7,6±1,0 versus Isquemia 13,5±0,8; p<0,05). Os grupos que receberam SnPP ou a associação farmacológica de indutor ou inibidor com sinvastatina demonstraram níveis de PU superiores ao SHAM (p<0.05), porém inferiores ao grupo isquemia, (Isq+SnPP 11,9±1,1, Isq+Est+Hemin 11,3±1,1, Isq+Est+SnPP 11,3±1,1 versus SHAM 5,6±0,9 versus Isq 13,5±0,8)

 

 

A tabela 3 mostra os valores quantitativos do infiltrado de macrófagos nos rins dos animais dos grupos em que foram empregadas intervenções farmacológicas. Observou-se redução dos valores de infiltrado nos grupos em que administrou sinvastatina, hemin, SnPP e estatina + hemin, porém , sem significância estatística.

 

 

DISCUSSÃO

Apesar de inúmeros avanços na pesquisa e na clínica, a LRA isquêmica continua sendo um dos principais indicadores de mau prognóstico funcional, tanto em rins nativos quanto em rins transplantados. Sabe-se que o mecanismo isquêmico de lesão renal determina a deposição do complexo antígeno-anticorpo no glomérulo e induz ativação e infiltração de neutrófilos que determinam a resposta inflamatória. As células mesangiais respondem a esse mecanismo irritativo secretando eicosanóides, proteases e EROs.(8) Vários estudos demonstram efeito benéfico de protetores vasculares, vasodilatadores e antioxidantes, destacando-se as estatinas pelos efeitos pleirotrópicos antiinflamatório e antioxidante.(9)

Esse estudo confirmou o efeito benéfico de proteção renal do pré condicionamento com sinvastatina na LRAi em modelo animal, constatado por meio do aumento na filtração glomerular, redução da lesão tubular e redução dos níveis de PU de animais que foram subsequentemente submetidos à isquemia renal de 30 minutos . Estudos em modelos de I/R em animais demonstram o efeito renoprotetor da sinvastatina com melhora da necrose tubular aguda verificada por meio de análise histológica e redução dos valores de fração de excreção de sódio.(2) O uso de pravastatina em modelos de I/R em ratos também confirmou redução da resposta inflamatória pela mensuração dos níveis de IL-6.(10) Na prática clínica, estudos evidenciaram menor incidência de LRA após realização de cirurgias cardíacas com uso de estatinas no período pré operatório e nos dois dias consecutivos a cirurgia.(11)

Diferentes mecanismos de proteção celular são induzidos durante a I/R renal, incluindo a heat shock protein 32, conhecida também como isoforma induzível de HO-1. A enzima HO-1 exerce importante papel na manutenção da homeostase renal.(12) O pré condicionamento com Hemin, indutor de HO-1, confirmou proteção renal antioxidante nesse modelo de I/R caracterizado por melhora da FR e redução dos níveis de PU. O efeito benéfico do indutor de HO-1 parece estar principalmente associado à formação de subprodutos como a bilirrubina, ferritina e monóxido de carbono. A geração de bilirrubina em quantidades equimolares confere proteção antioxidante, bem como a formação de ferritina, que inativa o ferro na cascata de lesão oxidativa. O monóxido de carbono atua com um potente vasodilatador.(13)

A associação dos tratamentos sinvastatina e indutor de HO-1 não apresentou resultados superiores quando comparada com o tratamento isolado. A estratégia de associação farmacológica visou verificar se os resultados vistos na função renal, tubular e peroxidação seriam superiores, inferiores ou permaneceriam similares aos tratamentos isolados. A ausência de diferenças entre isolados e associados faz crer que haja uma provável similaridade catalítica entre a sinvastatina e HO-1 e que, uma vez saturados pelos efetores, os receptores em comum não desencadeiam resposta adicional ou diversa. Estudos realizados anteriormente confirmaram que a estatina está envolvida com a indução de HO-1 em vários órgãos aos níveis de trancrição, translação e catalização, o que ressalta os resultados de interação vistos no estudo ora apresentado.(14)

Há que se considerar ainda que a super expressão da eNOS e dos níveis de NO tem sido relacionados a renoproteção desempenhada pela sinvastatina. Sendo de enfática relevância, vale ressaltar que evidências demonstram que os efeitos protetores da HO-1 ou dos produtos de degradação do heme intensificam a função endotelial por meio da interferência na biodisponibilidade do NO. Foram descritos três mecanismos celulares que ilustram esse movimento: HO e os produtos heme modulam a expressão e a atividade do NO, previnem a inativação do NO vascular e compensam a perda do NO vascular. Dessa forma, esse estudo reforça que o efeito HO-1 como mediadora da ação renoprotetora da sinvastatina sobre a função renal na lesão I/R deve ser considerado e infere que a ação do NO pode estar envolvida nesse contexto. Outros estudos avaliando a atividade dessas enzimas, associadas, trarão mais dados a respeito dessa interface celular.

Os resultados dos estudos com imunohistoquímica sugeriram que a ação antiinflamatória de ambos, estatina e HO-1, esteve presente no modelo de I/R . Contudo, o pequeno infiltrado inflamatório encontrado, mesmo no grupo isquemia, pressupõe que o período de isquemia possa não ter sido suficientemente agressivo para a obtenção de achados mais exuberantes que pudessem sublinhar o dano histológico e destacar o efeito antiinflamatório desses agentes no estudo.

Sumariamente, os resultados aqui apresentados reforçaram o efeito protetor da sinvastatina em modelo de I/R renal de 30 minutos com melhora da FR, redução dos mediadores de lesão oxidativa e da resposta inflamatória. Esse efeito pleiotrópico da sinvastatina demonstrou ter possível interface com a enzima heme oxigenase 1, supondo que esse seja um modelo heme de renoproteção. Estudos sobre a ação do NO e sua interferência no sistema HO na presença da sinvastatina serão providentes para a elucidação desses vias ainda incompreendidas.

 

REFERÊNCIAS

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Autor para correspondência:
Maria de Fátima Fernandes Vattimo
Av. Dr. Enéas de Carvalho Aguiar, 419 - Cerqueira César
CEP: 05403-000 - São Paulo (SP), Brasil
Fone: (11) 3061-8837 / Fax: (11) 3061-7546
E-mail: nephron@usp.br

Submetido em 26 de Julho de 2010
Aceito em 8 de Setembro de 2010

 

 

Trabalho realizado no Laboratório Experimental de Modelos Animais (LEMA) da Escola de Enfermagem da Universidade de São Paulo.

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