Inibição da atividade da citrato sintase cerebral em um modelo animal de sepse

Resumos

OBJECTIVE: An extensive body of evidence from experimental studies indicates that sepsis is associated with increased reactive oxygen species production, depletion of antioxidants, and accumulation of markers of oxidative stress. Moreover, mitochondrial dysfunction has been implicated in the pathogenesis of multiple organ dysfunction syndrome (MODS). Citrate synthase is an enzyme localized in the mitochondrial matrix and an important component of the Krebs cycle; consequently, citrate synthase has been used as a quantitative enzyme marker for the presence of intact mitochondria. Thus, we investigated citrate synthase activity in the brains of rats submitted to a cecal ligation puncture model of sepsis. METHODS: At several times points (3, 6, 12, 24 and 48 hours) after the cecal ligation puncture operation, six rats were killed by decapitation. Their brains were removed, and the hippocampus, striatum, cerebellum, cerebral cortex and prefrontal cortex were dissected and used to determine citrate synthase activity. RESULTS: We found that citrate synthase activity in the prefrontal cortex was inhibited 12, 24 and 48 hours after cecal ligation puncture. In the cerebral cortex, citrate synthase activity was inhibited 3, 12, 24 and 48 hours after cecal ligation puncture. Citrate synthase was not affected in the hippocampus, striatum or cerebellum up to 48 hours after cecal ligation puncture. CONCLUSION: Considering that energy impairment due to mitochondrial dysfunction in sepsis has been well described and that oxidative stress plays a crucial role in sepsis development, we believe that energy impairment may also be involved in these processes. If citrate synthase inhibition also occurs in a sepsis model, it is tempting to speculate that a reduction in brain metabolism may be related to the pathophysiology of this disease.

Citrate (si)-synthase/metabolism; Sepsis; Mitochondria; Brain; Rats, Wistar; Models, animal

ARTIGO ORIGINAL

Inibição da atividade da citrato sintase cerebral em um modelo animal de sepse

Giselli Scaini^I,III; Natália Rochi^I,III; Joana Benedet^I,III; Gabriela Kozuchovski Ferreira^I,III; Brena Pereira Teodorak^I,III; Clarissa Martinelli Comim^II,III; Larissa de Souza Constantino^I,III; Francieli Vuolo^I,III, Leandra Celso Constantino^II,III; João Quevedo^II,III; Emilio Luiz Streck^I,III; Felipe Dal-Pizzol^I,III

^ILaboratório de Fisiopatologia Experimental, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, Universidade do Extremo Sul Catarinense – Criciúma (SC), Brasil

^IILaboratório de Neurociências, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, Universidade do Extremo Sul Catarinense – Criciúma (SC), Brasil

^IIIInstituto Nacional de Ciência e Tecnologia Translacional em Medicina – Porto Alegre (RS), Brasil

^{Autor para correspondência}

RESUMO

OBJETIVO: Um amplo corpo de evidência oriundo de estudos experimentais indica que a sepse se associa com um aumento da produção de espécies de oxigênio reativo, depleção de antioxidantes, e acúmulo de marcadores de estresse oxidativo. Além disto, a disfunção mitocondrial foi implicada na patogênese da síndrome de disfunção de múltiplos órgãos. A citrato sintase é uma enzima que se localiza no interior das células, na matriz mitocondrial, sendo uma etapa importante do ciclo de Krebs; esta enzima foi utilizada como um marcador enzimático quantitativo da presença de mitocôndrias intactas. Assim, investigamos a atividade da citrato sintase no cérebro de ratos submetidos ao modelo sepse com de ligadura e punção do ceco.

MÉTODOS: Em diferentes horários (3, 6, 12, 24 e 48 horas) após cirurgia de ligadura e punção do ceco, seis ratos foram sacrificados por decapitação, sendo seus cérebros removidos e dissecados o hipocampo, estriato, cerebelo, córtex cerebral e córtex pré-frontal, e utilizados para determinação da atividade de citrato sintase.

RESULTADOS: Verificamos que a atividade de citrato sintase no córtex pré-frontal estava inibida após 12, 24 e 48 horas da ligadura e punção do ceco. No córtex cerebral, esta atividade estava inibida após 3, 12, 24 e 48 horas da ligadura e punção do ceco. Por outro lado a citrato sintase não foi afetada no hipocampo, estriato e cerebelo até 48 horas após a ligadura e punção do ceco.

CONCLUSÃO: Considerando-se que é bem descrito o comprometimento da energia decorrente da disfunção mitocondrial na sepse, e que o estresse oxidativo desempenha um papel essencial no desenvolvimento da sepse, acreditamos que o comprometimento da energia pode também estar evolvido nestes processos. Se a inibição da citrato sintase também ocorre em um modelo de sepse, é tentador especular que a redução do metabolismo cerebral pode provavelmente estar relacionada com a fisiopatologia desta doença.

Descritores: Citrato (si)-sintase/metabolismo; Sepse; Mitocôndrias; Ratos Wistar; Modelos animais

INTRODUÇÃO

A sepse e as síndromes a ela relacionadas, como a síndrome da disfunção de múltiplos órgãos (SDMO), são as causas mais freqüentes de morbidade e mortalidade em unidades de terapia intensiva, contribuindo apenas nos Estados Unidos para 750.000 casos por ano, com uma mortalidade média de 29%.⁽¹⁾ A sepse é definida como uma reação do hospedeiro à infecção caracterizada por inflamação sistêmica,⁽²⁾ sendo uma síndrome complexa caracterizada por um desequilíbrio entre as respostas pró e antiinflamatória ao patógeno.⁽³⁾

Evidências da literatura demonstram que espécies reativas de oxigênio (EROs) desempenham um importante papel no desenvolvimento da insuficiência de múltiplos órgãos e do choque séptico.^(4-8) O tratamento para reduzir a geração ou prevenir ou reverter os efeitos das EROs exerce um efeito benéfico em uma série de modelos de choque endotóxico e séptico.^(9-15)

Foi bem descrito que a disfunção mitocondrial está implicada na patogênese da síndrome da disfunção de múltiplos órgãos (SDMO) e em uma ampla variedade de condições de doença.^(3,16-18) A hipótese da hipóxia citopática postula que o comprometimento da fosforilação oxidativa mitocondrial reduz a produção aeróbica de andenosina trifosfato (ATP) e potencialmente induz a SDMO.⁽¹⁹⁾ Neste contexto, alguns trabalhos relatam a presença na sepse de deficiências na cadeia de transporte de elétrons.^(19-22)

A citrato sintase (EC 4.1.3.7) se localiza no interior das células, na matriz mitocondrial, e cataliza a condensação do oxaloacetato e do grupo acetil da acetil coenzima-A (acetil CoA), a primeira fase do ciclo de Krebs. Nesta fase, o oxaloacetato reage com acetil CoA e H₂O, produzindo citrato e CoA. Quando o suprimento de energia celular é alto, esta enzima é inibida por quantidades elevadas de ATP, acetil CoA e NADH. Esta regulação assegura que o ciclo de Krebs não oxide um excesso de piruvato e acetil CoA quando as concentrações intracelulares de ATP são elevadas.⁽²³⁾ Além disto, a citrato sintase foi utilizada como marcador enzimático quantitativo da presença de mitocôndrias intactas.⁽²⁴⁾

Assim, considerando que a citrato sintase desempenha um papel importante no metabolismo energético cerebral e que a disfunção mitocondrial tem sido implicada na patogênese da síndrome de disfunção de múltiplos órgãos, neste estudo investigamos se a sepse induzida por ligadura e punção do ceco (LPC) modifica a atividade da citrato sintase no cérebro.

MÉTODOS

Animais

Foram obtidos ratos Wistar adultos (60 dias de idade) junto ao biotério da Universidade do Extremo Sul Catarinense (UNESC). Os animais foram acomodados em grupos de cinco animais por gaiola, com alimentos e água fornecidos ad libitum e com ciclos de luz/sombra de 12 horas (luzes acesas às 7:00 horas da manhã. Todos os procedimentos experimentais envolvendo animais foram realizados em conformidade com as diretrizes do Instituto Nacional de Saúde para cuidados e uso de animais de laboratório e as recomendações da Sociedade Brasileira de Neurociência e Comportamento (SBNeC).

Cirurgia de ligadura e perfuração do ceco

Os animais foram submetidos a LPC conforme descrição prévia de Ritter et al.⁽²⁵⁾ Em resumo, os ratos foram anestesiados com uma mescla de ketamina (80 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg), administrada por via intraperitoneal. Sob condições assépticas, foi realizada uma laparotomia mediana de 3 cm para permitir a exposição do ceco e áreas adjacentes. O ceco foi submetido a ligadura com fio de seda 3.0 em sua base, abaixo da válvula ileocecal, e perfurado uma vez com uma agulha calibre 14. O ceco foi então delicadamente espremido para provocar a saída de uma pequena quantidade de fezes pelo local perfurado, e devolvido à cavidade peritoneal; a laparotomia foi fechada por meio de sutura com fio de seda 4.0. Todos os animais receberam solução salina isotônica (50 ml/kg, s.c.) imediatamente após o procedimento. Todos os animais foram devolvidos às suas gaiolas com acesso livre a alimentos e água. No grupo com cirurgia falsa, os ratos foram submetidos a todos os procedimentos cirúrgicos e receberam solução salina isotônica (50 m/kg s.c.) imediatamente após o procedimento.

Os grupos cirurgia falsa ou LPC foram randomizados durante o procedimento. Em momentos diferentes (3, 6, 12, 24 e 48 horas) após a cirurgia de LPC ou falsa, seis ratos foram sacrificados por decapitação, e as estruturas cerebrais (córtex pré-frontal, hipocampo, estriato, cerebelo e córtex cerebral) foram imediatamente isolados e armazenados a -80ºC. Todos os animais apresentaram sinais de encefalopatia após 6 horas de sepse (letargia, leve ataxia, ausência de movimentação espontânea, perda do reflexo de endireitamento), e gradualmente retornaram à sua condição normal de vigília 24-36 horas após a LPC.⁽²⁶⁾

Para minimizar a possibilidade de que os animais não desenvolvessem sepse após o procedimento de LPC, o procedimento foi sempre realizado pelos mesmos investigadores. Além disto, todos os animais foram observados após a LPC para determinar sinais de infecção (piloereção, letargia, taquipnéia e perda de peso), e o número de animais que sobreviveram correspondeu a nossos relatos prévios.⁽²⁵⁾

Preparação do tecido e homogenado

Doze horas após a última injeção, os ratos foram sacrificados por decapitação, o cérebro foi removido, e os tecidos do córtex pré-frontal, hipocampo, estriato, cerebelo e córtex cerebral foram homogenizados (1:10, w/v) em tampão SETH, pH 7,4 (25 nM sacarose, 2 mM EDTA, 10 mM de base Trizma, 50 UI/ml de heparina). Os homogenados foram centrifugados a 800 × g por 10 minutos e o sobrenadante mantido a -70ºC até sua utilização para determinar a atividade enzimática. O período máximo entre a preparação do homogenado e a análise enzimática foi sempre inferior a 5 dias. O conteúdo de proteínas foi determinado pelo método descrito por Lowry et al.⁽²⁷⁾, utilizando como padrão albumina sérica bovina.

Atividade de citrato sintase

O método de ensaio da atividade de citrato sintase foi o descrito por Srere et al.⁽²⁸⁾ A mistura para a reação continha 100 mM Tris, pH 8,0, 0,1 mM acetil-CoA, 0,1 mM 5,5'-ditiobis-(2 ácido nitrobenzóico), 0,1% triton X-100, e 2-4 μg de proteína sobrenadante, e foi iniciado com oxaloacetato 0,2 mM e monitorado com 412 nm por 3 minutos a 25ºC.

Análise estatística

Os dados foram analisados por meio de análise de variância (ANOVA) seguida pelo teste de Tukey quando o F era significante. Todas as análises foram realizadas por meio do software Statistical Package for the Social Sciences (SPSS). As diferenças foram consideradas significantes quando obtidos valores de p<0,05.

RESULTADOS

Nossos resultados demonstraram que a atividade da citrato sintase no córtex pré-frontal não foi afetada após 3 e 6 horas da LPC. Entretanto, a enzima foi significantemente inibida após 12, 24 e 48 horas da LPC (Figura 1). Conforme a Figura 2 demonstra, a atividade de citrato sintase no córtex cerebral foi significantemente inibida após 3, 12, 24 e 48 horas da LPC. Além do mais, a enzima não foi afetada na avaliação após 6 horas da LPC. Finalmente, a citrato sintase não foi afetada no hipocampo, estriato e cerebelo até 48 horas após a LPC (Figuras 3, 4 e 5, respectivamente).

DISCUSSÃO

Foi descrita a ocorrência de morte celular no sistema nervoso central (SNC) durante a sepse em modelos de roedores e em seres humanos.^(29,30) Um extenso corpo de evidência oriundo de estudos experimentais e clínicos indica que a sepse se associa com aumento da produção de EROs, depleção de antioxidantes, e acúmulo de marcadores de estresse oxidativo.

A evidência direta da produção de radicais livre na sepse vem de estudos utilizando 'spin traps' para detectar produção de radicais hidroxil e NO por meio de espectroscopia de ressonância paramagnética em ratos, e detecção da produção de radicais ascorbato em pacientes sépticos.^(31,32) O aumento da atividade da xantina oxidase (XO), um dos importantes fatores contribuintes para a produção de EROs, foi relatado em pacientes com sepse.⁽³³⁾ Além disto, para demonstrar produção de EROs, alguns estudos demonstraram diminuição das defesas antioxidantes que levam a desequilíbrio redox na sepse. Foi demonstrado que a reposição de glutationa por meio de N-acetilcisteína e glutationa diminui o estresse oxidativo em pacientes com sepse.⁽³⁴⁾ Demonstrou-se também que o aumento da produção de EROs e a diminuição dos antioxidantes são acompanhados de peroxidação lipídica em pacientes com sepse, comparativamente aos pacientes controle.⁽³⁵⁾

Mais ainda, a cadeia respiratória é também um importante pilar da fisiopatologia da sepse, já que a mitocôndria desempenha um papel crítico na produção de energia celular por meio da síntese de ATP dependente da cadeia de transporte de elétrons e é o principal local de produção de EROs. Como resultado do insulto inflamatório, as mitocôndrias sofrem danos funcionais e estruturais. Realizamos previamente uma curva de tempo após a LPC avaliando as atividades dos complexos da cadeia respiratória mitocondrial I, II, III e IV e creatinoquinase; demonstramos que o metabolismo energético cerebral é alterado seis e doze horas após a LPC.⁽³⁶⁾ Mais especificamente, foi observado que animais submetidos a LPC apresentaram diminuição da atividade da cadeia respiratória mitocondrial nos complexos I e II, porém não nos complexos III e IV, após 24, 48 e 96 horas. A atividade da succinato desidrogenase (uma importante enzima do ciclo de Krebs) estava diminuída após 48 e 96 horas em todas as estruturas analisadas.⁽³⁷⁾ Além disto, alguns trabalhos indicam que a geração mitocondrial de radicais livres está aumentada na sepse.^(38,39)

Assim, a produção de EROs perpetua e propaga a lesão mitocondrial, levando a edema mitocondrial e diminuição do conteúdo de citocromo c na mitocôndria.⁽⁴⁰⁾ Desta forma, os desarranjos na função mitocondrial afetam principalmente as células que têm alta demanda energética, como os neurônios,⁽⁴¹⁾ e o comprometimento da energia cerebral foi ligado à morte neuronal e neuro-degeneração.⁽⁴²⁾ Neste contexto, durante a sepse o cérebro pode ser um dos primeiros órgãos afetados, e a encefalopatia associada é freqüente, porém pouco reconhecida.^(43,44) Em modelos de sepse polimicrobiana em animais ocorre encefalopatia, e os sobreviventes apresentam comprometimento cognitivo que pode ser secundário a dano do SNC. ⁽²⁶⁾ Adicionalmente, sobreviventes de unidades de terapia intensiva, inclusive pacientes sépticos, podem ter morbidade persistente relacionada ao cérebro, inclusive déficits neuro-cognitivos e desenvolvimento de transtornos psiquiátricos.^(45-49)

No presente estudo demonstramos que a atividade da citrato sintase está inibida no córtex pré-frontal e córtex cerebral de ratos adultos após sepse induzida por LPC. Desta forma, considerando que o comprometimento energético conseqüente à disfunção mitocondrial na sepse é bem descrito e que a citrato sintase tem sido utilizada como marcador enzimático quantitativo da presença de mitocôndrias intactas, cremos que o comprometimento energético pode também estar envolvido nestes processos. Se a inibição da citrato sintase também ocorre em um modelo de sepse, é tentador especular que a redução do metabolismo cerebral pode provavelmente estar relacionada com a fisiopatologia desta doença.

Está bem descrito que as lesões do córtex pré-frontal se associam com desinibição social, descontrole dos impulsos, disfunções organizacionais, de planejamento e atenção, quebra da fluência e retardamento de comportamentos espontâneos.⁽⁵⁰⁾ Konarska et al.⁽⁵¹⁾ relataram que déficits regionais do lobo frontal, particularmente do cingulado anterior e córtex frontal, parecem diferenciar de forma consistente os pacientes com transtornos do sistema nervoso central dos pacientes da população geral. Formulamos, portanto, a hipótese de que a disfunção mitocondrial na sepse pode estar relacionada com dano do SNC.

CONCLUSÃO

Em conclusão, demonstramos que a citrato sintase é diminuída pela LPC no córtex pré-frontal e no córtex cerebral. Estes dados corroboram os de outros estudos, sugerindo que a disfunção mitocondrial está implicada na patogênese da LPC.

AGRADECIMENTOS

Este estudo recebeu apoio financeiro do Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde – Universidade do Extremo Sul Catarinense (UNESC) e do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).

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Submetido em 4 de março de 2011

Aceito em 28 de março de 2011

Conflitos de interesse: Nenhum.

Estudo realizado no Laboratório de Fisiopatologia Experimental – Universidade do Extremo Sul Catarinense – Criciúma (SC), Brasil.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  01 Ago 2011
• Data do Fascículo
  Jun 2011

Histórico

• Recebido
  04 Mar 2011
• Revisado
  28 Mar 2011