N-acetilcisteína e deferoxamina protegem contra insuficiência renal aguda induzida por isquemia/reperfusão em ratos

Resumos

OBJECTIVE: Antioxidants are widely used in animal models to prevent renal injury after ischemia/reperfusion, but it is unknown if the benefits of antioxidants are additive. In this study, we aimed to investigate the protective effects of N-acetylcysteine plus deferoxamine in an animal model of kidney ischemia/reperfusion injury. METHODS: Bilateral kidney ischemia was mastintained for 45 minutes. N-acetylcysteine, deferoxamine or both were administered into the aorta above the renal arteries immediately prior to induction of ischemia. Five rats from each group were sacrificed 1, 6 or 12 hours after reperfusion for the determination of blood creatinine, kidney oxidative damage parameters and myeloperoxidase activity. RESULTS: The combination of N-acetylcysteine and deferoxamine, but not their isolated use, prevented the increase in creatinine after ischemia/reperfusion. This prevention was followed by a consistent decrease in myeloperoxidase activity and oxidative damage parameters both in the kidney cortex and medulla. CONCLUSION: Treatment with N-acetylcysteine and deferoxamine was superior to the isolated use of either compound in an animal model of kidney ischemia/reperfusion.

Deferoxamine; Reperfusion injury; Renal insufficiency; Acetylcysteine; Reactive oxygen species; Rats

ARTIGO ORIGINAL - PESQUISA BÁSICA

N-acetilcisteína e deferoxamina protegem contra insuficiência renal aguda induzida por isquemia/reperfusão em ratos

Roberto Meister Bernardi; Larissa Constantino; Roberta Albino Machado; Francieli Vuolo; Patricia Budni; Cristiane Ritter, Felipe Dal-Pizzol

Laboratório de Fisiopatologia Experimental, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, Unidade Acadêmica de Ciências da Saúde, Universidade do Extremo Sul Catarinense - UNESC - Criciúma (SC), Brasil

^{Autor correspondente}

RESUMO

OBJETIVO: Os antioxidantes são largamente utilizados em modelos animal para prevenir lesão renal após isquemia/reperfusão. Uma questão importante é se os benefícios dos antioxidantes são aditivos ou não. O objetivo deste estudo foi investigar os efeitos protetores da N-acetilcisteína com deferoxamina, em modelo animal, de isquemia renal/traumatismo por reperfusão.

MÉTODOS: A isquemia renal bilateral foi mantida por 45 minutos. N-acetilcisteína, deferoxamina ou ambas foram administradas na aorta, acima das artérias renais, antes da isquemia. Cinco ratos de cada grupo foram sacrificados, entre 1, 6 ou 12 horas após reperfusão, para determinar a creatinina no sangue, os parâmetros de danos oxidativos no rim e a atividade da mieloperoxidase.

RESULTADOS: A associação de N-acetilcisteína e deferoxamina, mas não o uso isolado de cada uma, evitou o aumento da creatinina após isquemia/reperfusão. Tal evento foi seguido de diminuição consistente da atividade da mieloperoxidase e dos parâmetros de danos oxidativos, tanto no córtex como na medula renais.

CONCLUSÃO: O tratamento com N-acetilcisteína e deferoxamina mostrou-se superior ao uso de cada substância isoladamente em modelo animal de isquemia/reperfusão renal.

Descritores: Desferroxamina; Traumatismo por reperfusão; Insuficiência renal; Acetilcisteína; Espécies de oxigênio reativas; Ratos

INTRODUÇÃO

A isquemia renal é observada em uma variedade de situações clínicas, como a recuperação de parada cardíaca, transplante de rim e de fígado e nefrectomia parcial. A insuficiência renal aguda (IRA) observada após isquemia é caracterizada pela diminuição glomerular da taxa de filtragem, necrose tubular e aumento da resistência vascular renal.^(1,2)

O processo de isquemia/reperfusão (I/R) envolve múltiplos mecanismos patofisiológicos, como o distúrbio na homeostase cálcica,⁽³⁾ a produção de espécies reativas de oxigênio (ERO),⁽⁴⁾ a disfunção mitocondrial ⁽⁵⁾ e a infiltração neutrofílica.⁽⁶⁾ A ERO tem sido demonstrada como principal componente patofisiológico da IRA durante a I/R renal,^(4,7) e um componente que contribui para sua produção é o ferro. O ferro livre pode catalisar a conversão de H₂O₂ para OH^• ou formar espécie de ferril reativo ou perferril.⁽⁸⁾ Além disso, após a I/R, observam-se ativação do endotélio e recrutamento de células neutrofílicas.⁽⁹⁾ A migração de neutrófilos para o rim lesionado, seguida da reperfusão, leva ao aumento da atividade da mieloperoxidase (MPO) renal, sugerindo que substâncias cloradas desempenham um papel durante a lesão renal.⁽¹⁰⁾

Num esforço para minimizar esses eventos, alguns estudos usaram antioxidantes, como a N-acetilcisteína (NAC)⁽¹¹⁾ e a deferoxamina (DFX).⁽¹²⁾ A NAC é um antioxidante que atua aumentando o nível intracelular de glutationa, melhorando a atividade da glutationa S-transferase e eliminando ERO.^(13-15) Além disso, a sobrecarga prévia de animais com ferro⁽¹⁶⁾ poderia acelerar o dano oxidativo, o que é evitado pelo uso de DFX,^(17-21) sugerindo que esta poderia ter aplicação clínica na prevenção de dano oxidativo em IRA. Pelo fato de NAC e DFX conferirem proteção por meio de diferentes mecanismos, seus efeitos benéficos podem ser aditivos ou sinergéticos.^(22,23)

Neste estudo, tomou-se como hipótese o fato de que NAC e DFX podem ter efeitos sinergéticos, quando administradas em modelo animal de lesão renal por I/R.

MÉTODOS

Todos os experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes do National Institutes of Health (NIH) e aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade do Extremo Sul Catarinense.

Procedimentos gerais

Ratos Wistar machos, com idades de 2 a 3 meses, pesando 300 a 350 g foram divididos em 5 grupos de tratamento, com 15 ratos cada: (1) animal submetido à cirurgia sham; (2) I/R mais solução salina; (3) I/R mais NAC (20 mg/kg); (4) I/R mais DFX (20 mg/kg); e (5) I/R mais NAC e DFX (mesmas doses dos grupos 3 e 4). Os medicamentos foram administrados em dose única antes da indução da isquemia. As doses de NAC e DFX foram baseadas em estudos anteriores do grupo do presente estudo.⁽²⁴⁾ Para o procedimento de I/R, os ratos foram anestesiados com quetamina (75 mg/kg). Realizou-se incisão mediana, sendo identificadas a aorta e as artérias renais. Os medicamentos foram administrados na aorta acima das artérias renais e, então, ambos os pedículos foram pinçados com pinças microvasculares não traumáticas. A isquemia foi mantida por 45 minutos. Após este período, a perda de fluido foi recompensada por meio da administração de 5 mL de solução salina isotônica morna, e foram removidas as pinças. Cinco ratos de cada grupo foram sacrificados entre 1, 6 e 12 horas após a reperfusão, sendo o sangue e o rim removidos e acondicionados a -80ºC.

Creatinina plasmática

A creatinina foi determinada utilizando-se um ensaio enzimático. O soro foi exposto a 2% de naftol e 0,05% de diacetil em volume final de 1 mL e calculado por espectrofotometria a 540 nm após 20 minutos. Os resultados foram expressos em miligramas por decilitros.

Atividade da mieloperoxidase

A atividade da MPO, um índice de infiltração de leucócitos, foi calculada entre 1, 6 e 12 horas após a reperfusão, como descrito anteriormente.⁽²⁵⁾ Os rins foram homogeneizados em 0,5% de brometo de hexadeciltrimetilamônio e centrifugados em 15.000 g por 40 minutos. Uma alíquota de sobrenadante foi misturada a solução de 1,6 mM de tetrametilbenzidina e 1 mM de H₂O₂. A atividade foi medida por espectrofotometria, com a variação na absorbância em 650 nm a 37ºC.

Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico

Os níveis teciduais de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) foram determinados por um método baseado na reação com ácido tiobarbitúrico (ATB) a 90 a 100ºC.⁽²⁶⁾ No teste, o malondialdeído (MDA) ou substâncias MDA-like reagiram com ATB, produzindo um pigmento rosa com absorção máxima de 532 nm.

Dano proteico oxidativo

O dano oxidativo às proteínas foi avaliado pela determinação do conteúdo do grupo carbonil, com base na reação com dinitrofenilhidrazina (DNPH), como descrito anteriormente.⁽²⁷⁾ As proteínas foram precipitadas pela adição de 20% de ATB e redissolvidas em DNPH; a absorbância foi monitorada em 370 nm.

Análises estatísticas

A diferença entre os grupos foi avaliada por análise de variância (ANOVA). Quando o valor de F foi significante, realizaram-se comparações post hoc pelo teste Student-Newman-Keuls (SNK).

RESULTADOS

Os níveis de creatinina não diferiram entre os grupos 1 hora após reperfusão, mas aumentaram das 6 para as 12 horas, quando comparados com o grupo Sham (Figura 1). A associação de NAC e DFX, mas não o uso isolado delas, evitou esse aumento (Figura 1).

Os ratos submetidos à I/R tiveram aumento substancial na atividade de MPO no rim (Figura 2), tanto no córtex como na medula. O tratamento com NAC e DFX produziu uma maior atenuação da atividade da MPO no córtex (Figura 2A) e na medula (Figura 2B) quando comparado ao uso de uma delas isoladamente. Avaliou-se também o dano oxidativo renal (Figuras 3 e 4) e os níveis de TBARS foram, em geral, mais baixos quando a NAC e a DFX foram administradas associadas em relação à administração delas isoladamente (Figura 3). Esse efeito diferencial de NAC e DFX foi menos pronunciado quando o dano oxidativo foi avaliado utilizando carbonilas proteicas (Figura 4).

DISCUSSÃO

Neste estudo, demonstrou-se que a associação de NAC e DFX diminuiu o dano oxidativo e inflamatório nos rins após lesão por I/R em modelo animal. Uma resposta diferencial era esperada no córtex e na medula renais, dada a fisiologia hipoxêmica da medula; todavia, neste estudo, não foi possível demonstrar esse achado.

O peróxido de hidrogênio está presente em altos níveis após a reperfusão renal e é associado à produção de oxidantes derivados da MPO e à reação de Fenton. Os radicais ânion superóxido e o peróxido de hidrogênio podem ser produzidos via nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato reduzida (NADPH) oxidase ou pelo complexo desidrogenase mitocondrial NADPH em fagócitos (neutrófilos) ou nas células não fagócitas.^(28-30) A formação de peróxido de hidrogênio pela atividade elevada de xantina oxidase ainda não se confirmou como relevante na lesão renal por reperfusão em humanos. Apesar disso, nos rins de roedores, a I/R induz a conversão de xantina desidrogenase, que utiliza a NAD oxidada como aceptor de elétrons, na xantina oxidase, na xantina oxidase, que, em contraste, utiliza o oxigênio como substrato.^(31-33) Devido ao ATP ser consumido durante a isquemia, a xantina e a hipoxantina podem se acumular; na presença de oxigênio, o radical ânion superóxido e o peróxido de hidrogênio poderiam ser produzidos durante a reperfusão.⁽³⁴⁾ A xantina oxidase encontrada em células endoteliais renais poderia contribuir, em parte, para lesão oxidativa microvascular que ocorre seguida da reperfusão.^(35,36) Nesse contexto, os antioxidantes foram largamente utilizados em modelos experimentais na tentativa de evitar essas variações, porém poucos estudos consideraram o papel das associações antioxidantes. Shokeir et al. demonstraram que a associação de alfa-tocoferol e L-arginina tem maior efeito protetor e efeito sinergético antioxidante em modelo animal de transplante de lesão por I/R.⁽³⁷⁾ Além disso, a associação de NAC e ebselen evita a dano renal mais do que o uso de cada droga separadamente,⁽³⁸⁾ e o mesmo padrão de proteção foi observado no uso da erdosteína e do alfa-tocoferol.⁽³⁹⁾ Previamente, os autores deste estudo demonstraram, em diferentes modelos de doenças inflamatória, que a associação de NAC e DFX é superior ao uso isolado de antioxidante.^(24,40-42) Neste estudo, é possível confirmar os resultados prévios em modelo de I/R renal. Provavelmente essas ações sinergéticas estão relacionadas à capacidade de remover mais de um tipo de radical ou por evitar a possível produção de antioxidantes de radicais livres. Na verdade, esses achados são de grande relevância para NAC, que pode produzir radicais thiyl na presença de ferro; assim, o efeito quelante de ferro DFX pode evitar o estresse oxidativo NAC-induzido.

CONCLUSÃO

O tratamento com a associação de NAC e DFX foi superior ao uso isolado das substâncias em modelo animal de I/R renal, sugerindo que a disponibilidade de ferro pode representar um papel relevante no processo da doença ou na eficácia da NAC.

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Submetido em 7 de Agosto de 2012

Aceito em 10 de Setembro de 2012

Conflito de interesse: Nenhum.

Financiamento: Esta pesquisa recebeu suporte financeiro da Universidade do Extremo Sul Catarinense (UNESC), do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e do Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia Translacional em Medicina (INCT-TM).

Estudo realizado no Laboratório de Fisiopatologia Experimental, Universidade do Extremo Sul Catarinense - UNESC - Criciuma (SC), Brasil.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  05 Nov 2012
• Data do Fascículo
  Set 2012

Histórico

• Recebido
  07 Ago 2012
• Aceito
  10 Set 2012