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INTRODUÇÃO
A insuficiência renal aguda (IRA) é uma condição clínica que se caracteriza por deterioração aguda da função renal.(1) A IRA tem elevada incidência e mortalidade, principalmente em pessoas mais idosas com doenças crônicas e em pacientes graves.(2) Uma das principais causas da IRA é a hipoperfusão renal, que tem como via final comum a morte das células tubulares.(1)
Durante a isquemia, ocorre uma resposta inflamatória. Neutrófilos infiltram o tecido renal e liberam diversas citocinas, e também está presente uma vasoconstrição renal.(3) Além disso, ocorrem dano às células tubulares e perda da polarização celular,(4) que, por sua vez, comprometem o transporte ativo de sódio e água, e são seguidos pela obstrução do lume tubular.(4) Além do mais, ocorre acúmulo de hipoxantina e, após a reperfusão, seu metabolismo gera a produção de espécies reativas de oxigênio (ERO).(3) Nesse contexto, diversos estudos tentaram demonstrar o papel protetor exercido por substâncias anti-inflamatórias na isquemia/reperfusão (I/R).(5-10)
O canabidiol (CBD) é um composto não psicotrópico da planta Cannabis sativa. Diversos dos efeitos farmacológicos do CBD são mediados por sua interação com receptores canabinoides (CB1 e CB2). A expressão de CB1 ocorre predominantemente no sistema nervoso central (SNC), enquanto o CB2 é expresso principalmente nas células imunes. Foi demonstrado que o CBD é um potente agente anti-inflamatório e exerce seus efeitos por meio da indução de apoptose das células T, inibição da proliferação celular, supressão da produção de citocinas, e indução de células T reguladoras.(11-16) Além disto, demonstrou-se que a inibição dos receptores CB1 pode diminuir a liberação de mediadores inflamatórios e ERO, levando à diminuição da morte de células epiteliais renais.(15)
Considerando-se o grande número de estudos em animais que demonstraram a importância da inflamação no desenvolvimento da IRA isquêmica, e a falta de opções terapêuticas na clínica, há uma boa justificativa para se crer que novos agentes anti-inflamatórios podem ser um importante tratamento adjuvante para a IRA. Assim, formulamos a hipótese de que o receptor CB2 está suprarregulado durante um modelo de IRA em animais, e que a administração de CBD é capaz de diminuir a inflamação renal.
MÉTODOS
Foram obtidos ratos Wistar adultos pertencentes à colônia do biotério da Universidade do Extremo Sul Catarinense (UNESC), em Criciúma (SC). Os animais foram instalados em gaiolas apropriadas, ficando cinco animais por gaiola, com alimentos e água disponíveis à vontade. Os animais foram mantidos com ciclos de 12 horas de luz/escuridão (iluminação ligada às 7h). Todos os procedimentos experimentais que envolveram animais foram realizados em conformidade com as diretrizes do National Institutes of Health (NIH) para cuidados e uso de animais laboratoriais e em conformidade com a aprovação do Comitê de Ética da UNESC, 112/2012.
O fármaco CBD (pureza 99,9%) foi gentilmente fornecido pela THC-Pharm (Frankfurt, Alemanha) e STI-Pharm (Brentwood, Reino Unido). O CBD foi preparado como suspensão em monooleato de polioxietileno sorbitano (Tween 80) 2%. A solução foi preparada imediatamente antes do uso e protegida da luz.
Trinta ratos machos Wistar, com pesos entre 350 e 400g, foram divididos em três grupos iguais: grupo controle/cirurgia falsa (Grupo 1), I/R renal (Grupo 2) e isquemia/reperfusão renal mais CBD (5mg/kg) (Grupo 3).
Os animais foram anestesiados com quetamina (80mg/kg) e xilazina (20mg/kg) por meio de injeção intraperitoneal. Após, foi realizada uma incisão na parede abdominal, e o pedículo renal foi dissecado bilateralmente. Os Grupos 2 e 3 tiveram seu pedículo pinçado bilateralmente por 45 minutos. No Grupo 1, o pedículo foi manipulado, mas não pinçado. Imediatamente antes da liberação do pinçamento, administrou-se uma dose de CBD (5mg/kg)(12) ou o mesmo volume de solução salina, por punção da aorta. Após 24 horas, os animais foram sacrificados por decapitação, e os rins foram extraídos para exames.
As amostras de tecido renal (50mg/mL) foram homogeneizadas em brometo de hexadecil trimetil amônio a 0,5% e centrifugadas. A suspensão foi sonicada, e uma alíquota de sobrenadante foi misturada a uma solução 1,6mM de TMB e 1mM de peróxido de hidrogênio (H2O2). A atividade de mieloperoxidase (MPO) foi medida por espectrofotometria a 650nm, a 37°C. Os resultados foram expressos como mU/mg de proteína. A atividade de MPO foi avaliada como um indicador de infiltração neutrofílica.
Níveis de espécies reativas de ácido tiobarbitúrico
As amostras foram homogeneizadas e incubadas em 60 mM Tris-HCl, pH 7,4 (0,1 mM DTPA) e ácido tiobarbitúrico 0,73% por 60 minutos a 100°C. Após, as amostras foram resfriadas por 15 minutos a 5°C e centrifugadas, e a absorbância foi medida a 535nm. Os níveis de espécies reativas de ácido tiobarbitúrico (TBARS) foram expressos como nmol de malondialdeído (MDA) por miligrama de proteína (nmol.g-1).(17)
As amostras homogenizadas foram precipitadas pela adição de ácido clorídrico e as proteínas foram dissolvidas por guanidina (6M). Acrescentou-se 2,4-dinitrofenilhidrazina, e a base de Schiff formada foi mensurada a 370nm. Os resultados foram expressos como nmol de carbonil por miligrama de carbonilação de proteínas.(18)
As amostras foram misturadas com uma solução de cloreto de vanadil e reagente Griess. Após 30 a 40 minutos, determinou-se a absorbância a 540nm.(19) Uma solução padrão de nitrato de sódio foi diluída de forma seriada (1,6mM a 200mM) e os níveis de nitrito e nitrato (óxidos de nitrogênio - NOx) foram expressos como mM/mg de proteína.
Expressão dos receptores CB1 e CB2
O nível proteico de CB1 e CB2 foi mensurado com uma técnica Western blotting, com uso de anticorpos específicos. As amostras foram homogeinizadas em tampão Laemmli (62,5mM Tris- HCl, pH 6,8, 1% (w/v) sulfato dodecil de sódio - SDS, 10% (v/v) glicerol), e quantidades iguais de proteína (30mg) foram fracionadas por eletroforese em gel de poliacrilamida - dodecil sódico (SDS-PAGE) e eletrotransferidos para membranas de nitrocelulose. A eficiência da eletroforese foi verificada por coloração de Ponceau S, e as membranas foram bloqueadas em solução salina com tamponamento Tris (TTBS: 100mM Tris- HCl, pH 7,5, contendo NaCl 0,9% e Tween 20 0,1%) com albumina 5%. As membranas foram incubadas por uma noite a 4°C com anticorpos policlonais de coelho anti-CB1 e anti-CB2 (1:1000). IgG secundária anti-IgG de coelho foi incubada a 1:10.000 por 2 horas e, subsequentemente, as membranas foram lavadas em TTBS e a imunorreatividade foi detectada por quimiluminescência, com uso de quimiluminescência amplificada por geração elétrica. A análise densitométrica foi realizada com uso do programa de computador ImageJ versão 1.34®. Todos os resultados são expressos como proporção relativa entre o blot e o conteúdo imune de beta-actina.
Níveis de citocinas
As concentrações de fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e interleucina 1beta (IL-1β) foram determinadas utilizando um método ELISA (acrônimo de Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) em um leitor de microplaca utilizando um kit comercial (Peprotech, Ribeirão Preto, SP, Brasil).
Análises estatísticas
Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão. As diferenças entre os grupos foram determinadas por uma análise de variância de uma via, seguida, quando apropriado, pelo teste de Tukey. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o programa de computador Statistical Package for Social Science (SPSS), versão 21.0 (SPSS, Chicago, IL, EUA). As diferenças foram consideradas significantes quando níveis de p < 0,05.
RESULTADOS
A inflamação renal foi investigada inicialmente pela mensuração da atividade de MPO. Após a I/R, ocorreu um aumento não significante da atividade de MPO no rim, e os animais tratados com CBD apresentaram um nível mais baixo de atividade de MPO em comparação aos animais com I/R (F = 4,15; p = 0,03) (Figura 1). Em suporte a este efeito, os níveis de IL-1β e TNF-α foram mais baixos nos animais tratados com CBD quando comparados aos animais tratados com solução salina (IL-1β: F = 548; p = 0,004; TNF-α: F = 8; p = 0,001) (Figuras 2A e 2B).
Figura 1 Efeitos do tratamento com canabidiol na atividade de mieloperoxidase após lesão renal por isquemia e reperfusão. Os animais sofreram cirurgia falsa ou tiveram o pedículo renal pinçado bilateralmente por 45 minutos. Imediatamente antes de liberar o pinçamento, foi administrada uma dose única de canabidiol (5mg/kg) ou solução salina. Após 24 horas, mediu-se nos rins a atividade de mieloperoxidase.MPO - mieloperoxidase; CBD - canabidiol. Dados expressos como µm/mg de proteínas. # Diferente de isquemia/solução salina. p < 0,05.
Figura 2 Efeito do tratamento com canabidiol nos níveis de citocinas após lesão renal por isquemia e reperfusão. Os animais passaram por cirurgia falsa, ou tiveram seus pedículos renais pinçados bilateralmente por 45 minutos. Imediatamente antes de liberar o pinçamento, foi administrada uma dose única de canabidiol (5mg/kg) ou solução salina. Após 24 horas, foram medidos os níveis de interleucina 1 (A) e fator de necrose tumoral alfa (B) nos rins.IL-1 - interleucina 1; TNF-α - fator de necrose tumoral alfa; CBD - canabidiol. Os dados são expressos como pg/mg de proteína. * Diferente do controle; # diferente de isquemia/solução salina. p < 0,05.
Como inflamação e dano oxidativo são eventos concomitantes, avaliou-se o dano oxidativo aos lipídios e às proteínas. Ambas as mensurações demonstraram aumento após I/R (Figuras 3A e 3B). Mais ainda, observou-se diminuição destes parâmetros oxidativos nos animais tratados com CBD (MDA: F = 6,56; p = 0,005; carbonil: F = 20,57; p = 0,0001). Outro importante mediador do estresse oxidativo e inflamação foi o óxido nítrico (NO). A produção de NO foi determinada de forma indireta pela quantificação de NOx. Conforme demonstrado para os parâmetros de dano oxidativo, houve aumento significante dos níveis de NOx após a I/R. Em contraste, os animais tratados com CBD apresentaram níveis de NOx similares aos animais controle (F = 4,01; p = 0,03) (Figura 4).
Figura 3 Efeitos do tratamento com canabidiol nos níveis dos parâmetros de dano oxidativo após lesão renal por isquemia e reperfusão. Os animais passaram por cirurgia falsa ou tiveram seu pedículo renal pinçado bilateralmente por 45 minutos. Imediatamente antes da liberação do pinçamento, foi administrada uma dose única de canabidiol (5mg/kg) ou solução salina. Após 24 horas, foram mensurados nos rins os níveis de espécies reativas de ácido tiobarbitúrico (A) e carbonilas de proteína (B).MDA - malondialdeído; CBD - canabidiol. Os dados são expressos como nmol/mg de proteína. * Diferente do controle; # diferente de isquemia/solução salina. p < 0,05.
Figura 4 Efeitos do tratamento com canabidiol nos níveis de nitrito/nitrato após lesão renal por isquemia e reperfusão. Os animais passaram por cirurgia falsa ou tiveram seu pedículo renal pinçado bilateralmente por 45 minutos. Imediatamente antes da liberação do pinçamento, foi administrada uma dose única de canabidiol (5mg/kg) ou solução salina. Após 24 horas, foram mensurados nos rins os níveis de nitrito/nitrato. CBD - canabidiol. Os dados são expressos como pg/mg de proteína. * Diferente do controle. p < 0,05.
Como o CBD apresentou efeitos protetores contra a IRA neste modelo em animais, realizamos uma caracterização adicional da expressão de receptores canabinoides. A indução de I/R não modificou o padrão de expressão de CB1 e CB2 (Figuras 5A e 5B). Ocorreu apenas uma tendência à maior expressão de CB1, que não foi revertida pelo tratamento com CBD (CB1: F = 2,09; p = 0,174; CB2: F = 3,93; p = 0,94).
Figura 5 Efeitos do canabidiol nos níveis de CB1 e CB2 após lesão renal por isquemia e reperfusão. Os animais passaram por cirurgia falsa ou tiveram seu pedículo renal pinçado bilateralmente por 45 minutos. Imediatamente antes da liberação do pinçamento, foi administrada uma dose única de canabidiol (5mg/kg) ou solução salina. Após 24 horas, foram mensurados nos rins os níveis de CB1 (A) e CB2 (B).CBD - canabidiol. Os resultados são expressos como proporção relativa entre o blot e o imunoconteúdo de beta-actina. Ordem das bandas: duas bandas, controle; três bandas, isquemia + solução salina; três bandas isquemia + CBD.
DISCUSSÃO
No presente estudo, demonstramos que o tratamento com CBD após a lesão foi capaz de diminuir o dano oxidativo e a inflamação dos rins em um modelo I/R em animais. Não ocorreu variação significante na expressão de CB1 e CB2 após a reperfusão, sugerindo que não há uma suprarregulação da sinalização de CBD no desenvolvimento da lesão renal após I/R, embora o benefício terapêutico tenha permanecido.
A atividade de MPO é proporcional ao dano renal após I/R.(20) Além disso, uma vez ocorrido o dano, há um aumento de diversos mediadores inflamatórios. Isso amplifica a resposta inflamatória inicial, induzindo a expressão de óxido nítrico-sintase induzida (iNOS), que desempenha um relevante papel na propagação da inflamação e do dano oxidativo.(21-23) Como o sistema CBD foi inicialmente demonstrado no sistema nervoso central, existem numerosas descrições de um efeito anti-inflamatório do CBD neste contexto.(24) Os efeitos sobre o SNC parecem ser parcialmente dependentes de receptores de adenosina(25) e CB2.(26) Apesar disso, alguns dos efeitos anti-inflamatórios do CBD parecem ser dependentes de seu efeito antioxidante.(27) O CBD afeta os genes classicamente associados com a regulação da resposta ao estresse, como Nrf2, o que concorda com nossos resultados.
Há pouca informação disponível a respeito dos efeitos protetores do CBD fora do sistema nervoso central. Mais ainda, mesmo os efeitos protetores periféricos do CBD poderiam ser mediados pelo controle do eixo neuroimune.(26) No entanto, observou-se recentemente que o CBD poderia, na verdade, piorar a lesão pulmonar induzida por lipopolissacarideo LPS.(28) O pré-tratamento com CBD parece ser capaz de melhorar a função renal em um modelo de I/R em animais.(29) Aqui, demonstramos, administrando o fármaco após a lesão, que o CBD diminui o dano oxidativo renal e a inflamação, em um modelo em animais, ou seja, com o uso de um modelo mais relevante, do ponto de vista clínico.
Diferentemente de outros canabinoides, o CBD tem pouca afinidade com os receptores CB1 e CB2. Os efeitos anti-inflamatório e antioxidante deste composto podem ser secundários por uma ação direta, ou por eventuais novos receptores diferentes de CB1/CB2.(27) Por outro lado, há evidências que sugerem que, apesar da baixa afinidade pelos receptores CB1 e CB2, o CBD antagoniza os agonistas dos receptores CB1/CB2, mesmo em baixas concentrações.(30) Demonstramos que os receptores CB1 e CB2 não são suprarregulados após I/R renal, sugerindo que os mecanismos de lesão renal não são relacionados com essa via. Estes achados concordam com a ideia de que o CBD não age por via dos receptores CB1/CB2, pelo menos no contexto da lesão renal.
Demonstramos previamente que o CBD exerce efeitos protetores contra a lesão pulmonar induzida por LPS, o que foi parcialmente regulado por receptores de adenosina.(14) Mais ainda, as ações anti-inflamatórias de análogos de canabinoides, como o NAgly24 e o ácido ajulêmico, foram atribuídas à sua capacidade de promover a liberação de ácido araquidônico livre. Nestes exemplos, um resultado desta ação foi a formação de lipídios inflamatórios como lipoxina A4 e 15d-PGJ2.(31,32) Um mecanismo similar poderia explicar algumas das ações anti-inflamatórias do CBD. Foi também identificado que o envolvimento de receptores A2A poderia infrarregular as células imunes hiper-reativas, resultando em proteção dos tecidos de danos inflamatórios colaterais. Foi também relatado que o CBD tem a capacidade de acentuar a sinalização de adenosina por meio da inibição da captação e fornecer um mecanismo de receptor não canabinoide por meio do qual o CBD pode diminuir a inflamação.(33,34) O tratamento com CBD atenuou a expressão de NOX4 e NOX1 induzida por cisplatina, e do consequente estresse oxidativo renal. Além disso, o CBD também diminuiu a resposta inflamatória induzida por cisplatina, a superexpressão de iNOS, e a formação de nitrotirosina.(35) Os efeitos benéficos do tratamento com CBD em um modelo de lesão hepática por I/R em camundongos foram mantidos em camundongos knockout CB2, e não foram reduzidos in vitro por antagonistas de CB1 ou CB2, sugerindo um efeito independente da ativação de receptor.(15)
Nossos resultados devem ser interpretados à luz de algumas limitações. Primeiramente, não medimos marcadores da função renal, de forma que não podemos afirmar se os efeitos anti-inflamatórios terão um impacto direto na função renal. Apesar disso, como a inflamação renal se relaciona de forma próxima com a disfunção, e os efeitos protetores aqui demonstrados são robustos, cremos que esta limitação seja menos importante. Em segundo lugar, não apresentamos uma curva de resposta à dose e ao tempo, uma vez que alguns autores demonstraram um efeito deletério do CBD(27) de forma que não é possível excluir um efeito do CBD em uma curva com forma de "U" em nosso modelo.
CONCLUSÃO
O tratamento com canabidiol aparentemente teve efeito protetor contra a inflamação e o dano oxidativo em um modelo de isquemia/reperfusão do rim. Estes efeitos não parecem ocorrerem por via de ativação dos receptores CB1/CB2. Novos estudos, que tratem dos novos canabinoides e outros receptores, podem ajudar a elucidar o mecanismo exato de ação do canabidiol em condições inflamatórias, fora do sistema nervoso central.
