INTRODUÇÃO

Pacientes com debilidade respiratória e metabólica utilizam a ventilação mecânica (VM), que é um método de ventilação artificial que garante a manutenção das trocas gasosas essenciais para o organismo, considerado um suporte terapêutico comumente utilizado nas unidades de terapia intensiva (UTI), mas que expõe os pacientes ao risco de adquirir pneumonia associada à ventilação mecânica (PAVM).⁽¹⁾ Sugere-se que o tubo traqueal atua como desencadeador da PAVM pela formação do biofilme na sua superfície, favorecendo a patogênese da infecção.⁽²⁾ Ainda, a interação microbiana dentro do biofilme pode contribuir para a patogênese da PAVM e exercer impacto na terapia antimicrobiana, aumentando as taxas de morbimortalidade associadas a esta infecção.⁽³⁾ Visando auxiliar na redução da formação do biofilme no tubo endotraqueal durante a VM e, consequentemente, reduzir a frequência da PAVM, têm se empregado a descontaminação da microbiota oral e a redução das placas dentais, pois ambas são fontes potenciais para o desencadeamento da PAVM.^(4,5)

O diagnóstico de pneumonia é complexo. Os três principais componentes para a detecção da PAVM pelos critérios atuais são radiografia de tórax (obrigatório), sinais e sintomas (obrigatório) e exames laboratoriais (opcional). Ainda não há um padrão-ouro para o diagnóstico desta infecção, e a maioria das definições utilizadas não possui sensibilidade e nem especificidade suficientes para o estabelecimento deste diagnóstico.⁽⁶⁾ Os dados microbiológicos são empregados como uma tentativa de refinar a acurácia diagnóstica, por conta da baixa especificidade dos critérios clínicos isoladamente.⁽⁷⁾

Frequentemente, os patógenos causadores das PAVM de início precoce (diagnosticada até o quarto dia após o início do uso da VM) são de origem comunitária. Entre eles, podemos citar: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis, Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA), ou enterobactérias suscetíveis aos antimicrobianos.^(8,9) As PAVM de início tardio (diagnosticada a partir do quinto dia após o início do uso da VM) são ocasionadas por patógenos oportunistas, como Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter spp. e outras bactérias Gram-negativas oportunistas resistentes, além de MRSA.⁽⁹⁾

P. aeruginosa é considerada atualmente o principal agente de PAVM em UTI, com média de aproximadamente 50% dos casos.^(10,11) As infecções ocasionadas por este microrganismo predominam em pacientes críticos e imunocomprometidos, estando associadas com a elevação da morbimortalidade dos pacientes nessas unidades, além do aumento dos casos de P. aeruginosa resistentes aos antimicrobianos.^(12,13) Ainda que a PAVM seja a principal infecção relacionada à assistência à saúde ocasionada por este microrganismo, sua importância na etiologia de outras infecções, como infecções do trato urinário, sítio cirúrgico e, principalmente, sepse, também é valorizada.^(14,15)

A produção de biofilme pelos microrganismos causadores das PAVM torna a terapêutica antimicrobiana desta infecção ainda mais difícil, uma vez que o biofilme funciona como uma barreira, reduzindo a penetração destes fármacos e, consequentemente, impedindo que eles exerçam sua ação, além de impedirem o reconhecimento dos microrganismos pelo sistema imune do hospedeiro.⁽²⁾ Diante do exposto, o objetivo deste trabalho foi avaliar fenotipicamente a produção de biofilme por isolados clínicos de P. aeruginosa de pacientes com PAVM.

MÉTODOS

Foram analisados 20 isolados clínicos de P. aeruginosa que estavam armazenados na bacterioteca do Laboratório de Bacteriologia e Biologia Molecular da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), sendo 19 provenientes de amostras clínicas de aspirado traqueal e 1 de amostra de lavado broncoalveolar. Estes isolados foram coletados durante o período de novembro de 2012 a novembro de 2013 e estavam armazenados em estoque congelado a -20ºC. A confirmação do diagnóstico da PAVM nos pacientes se deu por critérios clínicos e microbiológicos do hospital, obtidos da análise dos prontuários médicos dos pacientes, tendo sido o trabalho aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UFPE, com registro CEP/CCS/UFPE número 009/11.

Os isolados foram previamente identificados e também tiveram a análise da suscetibilidade realizada pelo sistema automatizado (Phoenix - BD^®), sendo considerados multidroga resistentes (MDR) os isolados com resistência a pelo menos três classes de fármacos a partir de uma variedade de classes de antimicrobianos (principalmente aminoglicosídeos, penicilinas, cefalosporinas, carbapenêmicos e fluoroquinolonas), e foram considerados multidroga sensíveis (MDS) os isolados que apresentaram resistência a duas ou menos classes de antimicrobianos.⁽¹⁶⁾ Posteriormente, foram encaminhados para o Laboratório de Bacteriologia e Biologia Molecular, onde foram mantidos congelados em glicerol a -20ºC na bacterioteca. Estas bactérias foram reativadas em tubos de ensaio contendo caldo Brain Heart Infusion (BHI), incubadas por 48 horas em estufa a 37ºC e semeadas em ágar cetrimida, sendo posteriormente colocadas na estufa a 37ºC por 24 horas para análises.

RESULTADOS

DISCUSSÃO

É escasso o número de trabalhos que avaliam a eficácia do teste do ágar vermelho Congo para P. aeruginosa. Estudo⁽¹⁹⁾ analisou a formação de biofilme por meio da técnica do ágar vermelho Congo em cepas de S. aureus (ATCC 29213), Staphylococcus epidermidis (amostra clínica) e P. aeruginosa (ATCC 27853), enquanto outro⁽²⁰⁾ verificou a capacidade de cepas de S. aureus (ATCC 25923) e P. aeruginosa (ATCC 27853) produzirem biofilme por esta técnica; em ambos, todas as cepas analisadas foram consideradas produtoras de biofilme. Estudo⁽²¹⁾ que avaliou a formação de biofilme em 30 isolados clínicos de P. aeruginosa utilizando este método identificou 27 como produtores de biofilme.

Ainda que o teste do ágar vermelho Congo seja vastamente utilizado em estudos com biofilme, principalmente com Staphylococcus spp., não se sabe ao certo qual o mecanismo específico da resposta envolvida neste método. Apesar disto, alguns dados indicam que a reação positiva, evidenciada pelo escurecimento da colônia produtora de biofilme, decorreria da constituição polissacarídica da matriz extracelular do biofilme, cuja produção é intensificada pelo suplemento nutricional do meio.⁽¹⁷⁾

Em estudos realizados com este método, foi detectada uma associação entre a produção de polissacarídeo com a reação positiva no teste de ágar vermelho Congo em espécie de S. epidermidis produtora de biofilme e que possuía genes do Operon ica, sendo esta associação também observada em outras espécies do gênero Staphylococcus produtoras de biofilme que possuem genes homólogos aos do Operon ica de S. epidermidis (S. aureus; Staphylococcus caprae, Staphylococcus lugdunensis, Staphylococcus haemolyticus).^(22,23) Ainda, foram observadas positividade neste teste para outros gêneros/espécies bacterianos produtores de biofilme que possuíam genes ortólogos aos do Operon ica, como Actinobacillus pleuropneumoniae,⁽²⁴⁾ Aggregatibacter actinomycetemcomitans,⁽²⁵⁾ Bordetella,⁽²⁶⁾ Escherichia coli⁽²⁷⁾ e Yersinia pestis.⁽²⁸⁾

Neste estudo, não foi possível observar a relação entre a produção da matriz extracelular do biofilme de P. aeruginosa, de constituição predominantemente polissacarídica (alginato), com a positividade do teste do ágar vermelho Congo, uma vez que mesmo a cepa de P. aeruginosa PA01, que é um controle positivo para testes de produção de biofilme, não apresentou positividade neste teste, o que demonstra que este teste não é eficaz para detecção presuntiva da formação de biofilme para esta espécie bacteriana. A ausência de positividade no teste vermelho Congo pode estar relacionada com a deficiência do gene pel, responsável pela produção da matriz extracelular rica em glicose, capaz de se ligar ao vermelho Congo e gerar a reação que modifica a coloração das colônias produtoras de biofilme, uma vez que foi visto que nenhuma matriz extracelular foi produzida pelos isolados de P. aeruginosa mutantes, que não apresentavam o gene pel, provocando, desta forma, a ausência de positividade no teste do ágar vermelho Congo.⁽²⁹⁾

O teste de quantificação do biofilme mostrou-se eficaz na detecção da produção do biofilme pelos isolados clínicos provenientes de pacientes com PAVM e também foi apto para constatar a produção de biofilme pela cepa de P. aeruginosa PA01, utilizada como controle positivo do teste. Dados similares foram registrados na literatura,⁽³⁰⁾ que verificou uma produção de biofilme de 68% (50/74) em isolados clínicos de P. aeruginosa, sendo distribuídos nas seguintes categorias: 96% fracamente aderentes e 4% moderadamente aderentes.

Neste estudo, os isolados classificados como produtores de biofilme apresentaram o seguinte perfil de suscetibilidade: 53,3% eram MDR e 46,7% eram MDS. Devido ao pequeno número amostral, não foi realizada a análise estatística para avaliar a diferença entre os resultados dos isolados MDR e MDS, embora tenha ocorrido uma maior produção de biofilme em isolados MDR, corroborando dados já encontrados,⁽³⁰⁾ no qual os isolados de P. aeruginosa produtores de metalo-β-lactamases (MβL) produziram biofilme. Estes resultados também são semelhantes a outros da literatura,⁽³¹⁾ que realtaram a produção de biofilme de 93,4% (85/91), sendo 60% fracamente aderentes, 25,9% moderadamente aderentes e 14,1% fortemente aderentes.

Os dados obtidos neste estudo mostraram que, para a população bacteriana estudada, a produção de biofilme independe do perfil de suscetibilidade das bactérias. Pode-se sugerir que a produção de biofilme pode estar relacionada com a falha da terapia empírica, por dificultar a penetração dos antimicrobianos nesta estrutura, impedindo que eles consigam eliminar as bactérias presentes no biofilme, acarretando complicações da PAVM nos pacientes, incluindo infecções extrapulmonares, e dificultando o tratamento da infecção. Este aspecto é bastante importante, pois, dentro do mesmo hospital, os esquemas empíricos para tratamento da PAVM podem diferir de acordo com os agentes etiológicos circulantes e os respectivos perfis de suscetibilidade. Sugerimos, ainda, que os protocolos terapêuticos da PAVM sejam revisados de modo sistemático, para o sucesso do tratamento e para minimizar a pressão seletiva de microrganismos resistentes.⁽³²⁾

A formação do biofilme no tubo endotraqueal de pacientes com PAVM ocasiona o prolongamento deste quadro, além de provocar a disseminação da infecção para outras regiões do trato respiratório proximal, resultando no aumento do uso de antimicrobianos para tentar controlar a infecção, embora, na maioria dos casos, esta terapia não apresente sucesso, pela redução da penetração dos antimicrobianos provocada pela formação do biofilme. Quanto maior o grau de aderência do biofilme, menor será a penetração do antimicrobiano em sua estrutura, levando a uma pressão seletiva nas células ali presentes, que resultará no aumento da resistência desta bactéria, por esse e/ou outros mecanismos de resistência.⁽³³⁾

Neste estudo a técnica qualitativa mostrou que apenas 15% dos isolados foram considerados produtores de biofilme, enquanto que a técnica quantitativa do biofilme demonstrou que 75% dos isolados foram produtores de biofilme, indicando ser uma técnica mais eficaz para detecção da produção de biofilme em comparação com a técnica qualitativa. Houve ainda elevada produção de biofilme pelos isolados clínicos de P. aeruginosa avaliados.

CONCLUSÃO

Nosso estudo demonstrou a maior detecção da produção de biofilme por isolados clínicos de P. aeruginosa provenientes de pacientes com pneumonia associada à ventilação mecânica por meio da técnica quantitativa, que foi mais eficaz em comparação à técnica qualitativa. Além disto, para o microrganismo avaliado neste estudo, a produção de biofilme independeu do perfil de suscetibilidade das bactérias. Estudos sobre a produção de biofilme por P. aeruginosa ainda são escassos no Brasil, não havendo relatos sobre a produção de biofilme por esta bactéria relacionada à pneumonia associada à ventilação mecânica no país. São necessários novos estudos, com um maior número de isolados clínicos de P. aeruginosa provenientes de pacientes com pneumonia associada à ventilação mecânica, para elucidar a dinâmica desta infecção e a formação de biofilme por este microrganismo, visando melhorar a qualidade de vida dos pacientes.