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Fisioterapia em Movimento

Print version ISSN 0103-5150

Fisioter. mov. vol.25 no.1 Curitiba Jan./Mar. 2012

http://dx.doi.org/10.1590/S0103-51502012000100003 

ARTIGOS ORIGINAIS

 

Análise comparativa dos efeitos do ultrassom terapêutico e laser de baixa potência sobre a proliferação de células musculares durante a diferenciação celular

 

Comparative analysis between the effects of therapeutic ultrasound and low power laser on the proliferation of C2C12 myogenic precursor cells during cell differentiation

 

 

Paola Pelegrineli ArtilheiroI; Jean Lucas Parpinelli BarbosaII; Kristianne Porta Santos FernandesIII; Tábata Santos de OliveiraI, Sandra Kalil BussadoriIII; Raquel Agnelli Mesquita-Ferrari III

IMestranda em Ciências da Reabilitação, Universidade Nove de Julho (UNINOVE), São Paulo, SP - Brasil.
IIAluno do curso de biomedicina da Universidade Nove de Julho (UNINOVE), bolsista CNPq/PIBIC, São Paulo, SP - Brasil
IIIDocente do Mestrado em Ciências da Reabilitação, Universidade Nove de Julho (UNINOVE), São Paulo, SP - Brasil, e-mail: raquel.mesquita@gmail.com

 

 


RESUMO

INTRODUÇÃO: Existe um grande interesse no estabelecimento de recursos e terapias a serem utilizados na tentativa de proporcionar um processo de reparo muscular de melhor qualidade e menor duração. O ultrassom terapêutico (US) e o laser de baixa potência (LBP) são recursos muito usados na prática clínica, porém são escassas, e por vezes contraditórias, as evidências científicas que determinam com segurança os parâmetros dosimétricos e metodológicos adequados.
OBJETIVOS: O objetivo do estudo foi analisar o efeito do US e do LBP sobre a proliferação celular durante a diferenciação de mioblastos C2C12.
MATERIAIS E MÉTODOS: Os mioblastos foram cultivados em meio de cultura de Eagle modificado por Dulbecco, contendo 10% de soro fetal bovino (SFB), sendo induzida a diferenciação pela adição de 2% de soro de cavalo durante 96 horas. Posteriormente, as células foram irradiadas com US pulsado a 20%, 3 MHz de frequência (intensidades de 0,2 e 0,5 W/cm2, durante cinco minutos) ou submetidas ao tratamento com LBP (potência de saída de 10 mW, densidade de energia de 3 e 5 J/cm2, por 20 segundos). A proliferação celular foi avaliada após 24h e 72h utilizando o método de MTT. Foram realizados três experimentos independentes, em cada condição citada e células não irradiadas serviram como controle.
RESULTADOS: Os resultados obtidos foram submetidos à análise estatística utilizando a Análise de Variância (ANOVA), teste Dunnet, para verificar diferenças entre o grupo controle (não tratado) e os grupos tratados com US e LBP, adotando significância de p < 0,05. Os resultados evidenciaram que não houve diferença significativa na proliferação celular entre as células musculares submetidas a tratamento com ambos os recursos terapêuticos e as células controle, nos períodos de 24h e 72h após tratamento. Além disso, foi possível verificar que não houve aumento significativo no número de células após o período de 72h quando comparado a 24h, confirmando o processo de diferenciação celular, conforme esperado.
CONCLUSÕES: Conclui-se que o US e o LBP, nos parâmetros avaliados, não alteraram a proliferação de mioblastos em processo de diferenciação.

Palavras-chave: Ultrassom terapêutico. Laser. Mioblastos. Diferenciação. Proliferação.


ABSTRACT

INTRODUCTION: There is great interest in establishing resources and therapies to be used in an attempt to provide a process of muscle repair better and shorter. Two features commonly used to facilitate the healing process are the therapeutic ultrasound and laser power, however, are still scarce and sometimes contradictory scientific evidence to determine with certainty the parameters and methodology necessary to acquire these goals.
OBJECTIVES: Thus, the objective of present study was to evaluate the effect of therapeutic ultrasound (US) and low level laser GaAlAs 660 nm on the proliferation of C2C12 myoblasts.
MATERIALS AND METHODS: The myoblasts were cultivated in culture medium of Eagle modified by Dulbecco, containing 10% fetal bovine serum (FBS) and induced to differentiate by addition of 2% horse serum for 96h. Subsequently, cells were irradiated with US (20%, 3 MHz, and intensities of 0.2 and 0.5 W/cm2 for five minutes) or with LLL (output power of 10 mW, density of 3 and 5 J/cm2 for 20 seconds). The non-irradiated cells serve as controls. Three independent experiments were performed for each condition cited. Cell proliferation was evaluated after 24h and 72h using the MTT method.
RESULTS: The results were statistically analyzed using analysis of variance (ANOVA/Dunnet) to verify differences between control cells (untreated) and US/LLL treated groups. The results showed no significant differences in viability and cell proliferation between LLL or US treated cells and control cells after 24h and 72h. Furthermore, it was observed no increase in the number of cells within the evaluation period after treatment, confirming the process of cell differentiation, as expected.
RESULTS:
In conclusion, US and the LLL, employed under the parameters described does not alter C2C12 proliferation.

Keywords: Ultrasound therapy. Laser. Myoblasts. Differentiation. Proliferatio.


 

 

Introdução

A miogênese, ou a formação do músculo esquelético, é um processo altamente complexo que envolve a expansão de células musculares mononucleadas progenitoras ao longo da via miogênica até se tornarem mioblastos que se fundem para formar miotubos e que, finalmente, desenvolvem-se para se tornar miofibrilas do músculo esquelético maduro (1, 2).

A fusão de mioblastos de mamíferos ocorre em duas fases (3). Inicialmente, mioblastos se fundem a outros para formar pequenos miotubos. Adi­cio­nalmente, outros mioblastos se fundem a esses miotubos para formar miotubos maiores e maduros (4, 5). Durante a miogênese, a fusão de mioblastos em miotubos multinucleados é o passo terminal de diferenciação. Após isso, divisões mitóticas dentro dos miotubos ou fibras musculares não ocorrem mais. Núcleos extras, requeridos para crescimento muscular, são garantidos pelas células satélites, que são células musculares quiescentes localizadas abaixo da membrana basal da fibra muscular. Essas células representam a maior parte do potencial regenerativo diante da lesão e adaptação muscular ao exercício (2).

Nos diferentes estágios da miogênese, as células expressam distintos fatores regulatórios miogênicos envolvidos nesse processo de diferenciação. Desmina, Myf5 e MyoD são expressos em estágios iniciais, enquanto miogenina, fator regulatório de miogenina (MRF4) e miosina são expressos nos estágios mais tardios. A expressão desses fatores também é regulada por moléculas de sinalização extracelular da MEC e, também, por outros fatores envolvidos no contato célula-célula (6-8).

A miogenina tem papel importante durante a miogênese, pois sua expressão marca o início da diferenciação e, consequentemente, quando se expressa a miogenina, as fibras musculares desenvolvem-se a partir dos mioblastos previamente formados (9). Por outro lado, a miostatina inibe a proliferação e diferenciação celular e se expressa predominantemente no desenvolvimento muscular (10). Estudos prévios relataram uma influência negativa da miostatina sobre a proliferação celular. Parâmetros testados levaram à confirmação de que a expressão de miostatina está fortemente inibida na fase terminal da diferenciação (10-12).

Quando um músculo sofre uma lesão, este tem a habilidade de iniciar um processo de reparo altamente organizado, de forma a prevenir a perda de massa muscular sendo capaz de restaurar a citoarquitetura dentro de um período de aproximadamente duas semanas. Esse processo é semelhante à miogênese, porém as células que participam são as células satélites (13, 14). Uma vez ativadas as células satélites proliferam, sendo então denominadas mioblastos, e também expressam os fatores reguladores miogênicos que controlam a proliferação e a diferenciação celular. Essas células se fundem a fibras musculares já existentes ou fundem-se a células satélites vizinhas para gerar novas fibras musculares (15, 16).

Há evidências de que o reparo tecidual possa ser estimulado por recursos terapêuticos como o ultrassom e laser de baixa potência, sendo esses recursos amplamente utilizados na prática clínica, porém, muitos dos estudos são contraditórios no que diz respeito aos parâmetros dosimétricos adequados para promover a regeneração muscular de forma mais rápida e de melhor qualidade diante dos diferentes tipos de lesão (17, 18).

Uma das modalidades terapêuticas mais utilizadas no tratamento de lesões de tecidos moles é o ultrassom, com o objetivo de proporcionar um processo de reparo muscular de melhor qualidade e menor duração. As ondas ultrassônicas causam vibrações e colisões moleculares, aumentando a atividade molecular e, por consequência, o aumento da temperatura (19).

A energia do US que penetra no organismo pode afetar as células e tecidos por meio de mecanismos térmicos e não térmicos, e as estruturas aquecidas, preferencialmente, pelo US incluem músculos, tendões, cicatrizes e a maioria das raízes nervosas. Evidências mostram que mecanismos não térmicos estariam envolvidos na produção dos efeitos terapêuticos primários do US, isto é, a estimulação da regeneração tecidual por meio do aumento da permeabilidade e difusão em nível de membrana celular, influxo de cálcio intracelular e alterações na atividade elétrica do tecido nervoso (20, 21) .

Estudos in vitro demonstraram que os efeitos do US parecem ser dependentes do tipo celular, sendo que promovem a síntese de DNA em osteoblastos humanos, fibroblastos de gengiva e pele, células de periósteo, mas não em condrócitos (22). Com relação ao efeito do US sobre a proliferação celular, foi verificado inicialmente por Jonhs et al. (20) que o US contínuo e pulsado em intensidades de 0,1 a 0,7 W/cm2 era capaz de diminuir a taxa de crescimento celular, porém, em estudos posteriores, foi evidenciado que o US utilizado nas frequências de 1 e 3 MHz em intensidades variadas promovia aumento da proliferação de fibroblastos e osteoblastos (23-28).

Os estudos mais recentes que avaliaram o potencial terapêutico do US foram realizados em osteoblastos (29-31), condrócitos (32-34), fibroblastos (35), células epiteliais (36) e células endoteliais (37).

O enorme potencial terapêutico do US está longe de ser estabelecido em virtude de novas aplicações serem adicionadas regularmente ao seu repertório (38). Assim, o melhor entendimento sobre os efeitos do US sobre as células musculares poderá contribuir de forma positiva para o estabelecimento de protocolos adequados para a melhoria do processo de reparo muscular e da recuperação clínica dos pacientes.

Outro recurso muito utilizado na prática clínica após lesões musculares é o laser de baixa potência, ou seja, aquele que possui baixa energia e ausência de potencial fototérmico. Existem diversos tipos, sendo os mais usados os que se encontram na porção óptica do espectro vermelho e do infravermelho (400 a 780 nm e 780 a 1 mm). Seus fótons de energia são inferiores a 2,0 elétron-volt (eV), portanto, inferiores à energia da ligação das moléculas biológicas e do DNA, não podendo quebrar ligações químicas e não sendo capazes de induzir mutação e carcinogênese (39, 40).

Estudos têm mostrado que o laser é capaz de influenciar a proliferação de fibroblastos (41, 42), osteoblastos (43) e células epiteliais (44). Além disso, essa terapia também possui efeitos sobre o colágeno e a síntese de colágeno (45, 42). Mais recentemente, um estudo analisou os efeitos do laser de AsGaAL nos parâmetros de 830 nm (0,3 J/cm2), 685 nm (0,6 J/cm2) e 670 nm (1,2 J/cm2) sobre células precursoras miogênicas e concluiu que a taxa de proliferação celular induzida por essas irradiações foi de 84,3%, 70,6% e 56,8%, respectivamente (46).

Os efeitos miogênicos da irradiação com laser de baixa potência nas células se baseiam na capacidade de modulação de diversos processos metabólicos, mediante a conversão da energia luminosa aportada pelo laser por meio de processos bioquímicos e fotofísicos, os quais transformam a luz laser em energia útil para as células (39, 40, 42, 43, 46, 47).

O efeito de bioestimulação depende da combinação de parâmetros como comprimento de onda, potência, intensidade e também do tipo celular a ser avaliado (39, 40, 42, 43, 46, 47).

Dificuldades na medição de variáveis relacionadas à dor e reparação tecidual em modelos animais ou em ambientes clínicos enfatizam a necessidade de estudos in vitro relacionados ao uso do laser (48).

Nosso grupo de pesquisa iniciou em 2007 os primeiros estudos avaliando o efeito de ambas as modalidades terapêuticas descritas em células precursoras miogênicas da linhagem C2C12, porém, detectou-se que esses recursos, nos parâmetros utilizados, não foram capazes de alterar a proliferação de mioblastos. Desse modo, nossa proposta foi avaliar, de forma comparativa, os possíveis efeitos do laser e ultrassom terapêutico sobre a proliferação das células musculares após 96h de diferenciação com soro de cavalo.

É importante ressaltar que os mioblastos C2C12 derivam de músculoesquelético de camundongos, exibem a maioria das características dos mioblastos normais e diferenciam-se em cultura, propiciando um bom modelo para estudar a regeneração muscular. Além disso, o uso de linhagens celulares em modelos para análise de proliferação celular elimina a possibilidade da influência da irradiação laser sobre a produção de fatores de crescimento por células não miogênicas contidas em culturas primárias, como fibroblastos e macrófagos (1, 46, 49).

 

Materiais e métodos

Cultura celular

A linhagem celular C2C12, utilizada no presente trabalho, é um subclone da linhagem celular de mioblastos C2, células derivadas de células satélites de ratos adultos (35, 36). Essas células foram cultivadas no meio de cultura de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Cultilab, Campinas, SP, Brasil) contendo 10% de soro fetal bovino (SFB) (Cultilab, Campinas, SP, Brasil) e 1% de antibiótico solução antimicótica (CULTILAB) e mantidas em estufa 37 ºC, numa atmosfera úmida contendo 5% de CO2. O monitoramento do crescimento celular foi feito a cada 24h e, quando a monocamada celular se tornava subconfluente para a perpetuação da linhagem celular, foi realizado o subcultivo com lavagem tampão PBS1X (NaCl 140 mM; KCl 2,5 mM; Na2HPO4 8 mM; KH2PO 1,4 mM; pH 7,4) e solução de tripsina. As células foram centrifugadas a 1200 rpm e posteriormente ressuspensas em 1 mL de meio DMEM. A viabilidade das células foi avaliada por contagem com corante vital azul de Trypan (0,4%) e foram utilizadas nos experimentos as células com viabilidade maior que 95%.

Para indução da diferenciação, as células foram mantidas em meio DMEM contendo 2% de soro de cavalo por um período de 96h.

Ensaio de proliferação celular (MTT)

A metodologia utilizada para avaliação da viabilidade e proliferação celular se baseia na habilidade da enzima mitocondrial desidrogenase, encontrada somente em células viáveis, em clivar os anéis de tetrazólio do MTT (3-[4,5-Dimethylthiazol-2yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide; Thiazolyl blue), formando cristais azuis escuros de formazana, os quais são impermeáveis às membranas celulares, ficando então retidos no interior das células viáveis (50). A posterior lise celular faz com que esses sais de formazana sejam liberados. O número de células viáveis é diretamente proporcional ao nível de cristais de azul de formazana formados.

Após o período de 96h em que ficaram na presença de meio de diferenciação (DMEM com 2% de soro de cavalo) as células musculares foram irradiadas com US pulsado a 20%, 3 MHz de frequência (intensidades de 0,2 e 0,5 W/cm2, durante cinco mi­nutos) ou submetidas ao tratamento com LBP (potência de saída de 10 mW, densidade de energia de 3 e 5 J/cm2, por 20 segundos). Foram adicionadas 1x103 células/poço a placas de cultura de fundo chato de 96 poços, estéreis (20) e incubadas a 37 oC e 5% CO2 por 24h e 72h.

Ao término do período de incubação, foi feita a lavagem dos poços com PBS1X (NaCl 140 mM; KCl 2,5 mM; Na2HPO4 8 mM; KH2PO 1,4 mM; pH 7,4) para remoção das células mortas e adicionado o MTT (0,5 µg/ml) (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5,-diphenyltetrazolium bromide) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), e realizada a incubação das células por quatro horas a 37oC e 5% CO2. Em seguida, foi adicionado isopropanol para solubilizar os cristais formados. Por fim, foi realizada a leitura da absorbância a 620 nm com auxílio de um leitor de placas (Anthos 2020, Anthos Labtec Instruments, Wals, Áustria) (Mosmann, 1983, Woerdenbag, 1994). Todos os experimentos foram repetidos três vezes, de forma independente, e cada amostra foi analisada em quadruplicata.

Para avaliar a morfologia das células musculares diante do tratamento com o US e LBP foram feitos registros fotográficos com auxílio do microscópio invertido (Nikon) antes da realização da avaliação da proliferação pelo método de MTT, ou seja, também após 24h e 72h.

 

Análise estatística

As comparações entre os grupos foram feitas utilizando análise de variância (ANOVA). O teste de Dunnett foi utilizado para determinar diferenças significativas entre os grupos experimentais e o grupo controle. Valores de p 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. Os dados foram analisados por meio do programa GraphPad Prism 4.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, EUA).

 

Resultados

Efeitos do US e LBP sobre a proliferação celular

Os resultados permitiram verificar que não houve diferença significativa na proliferação celular, avaliada pelo método MTT, entre as células musculares submetidas a tratamento com ambos os recursos terapêuticos e as células controle, tanto no período de 24h (Gráfico 1) quanto no período de 72h (Gráfico 1).

 

 

Além disso, foi possível verificar que não houve modificação significativa no número de células quando comparados os períodos de 24h e 72h de incubação após o tratamento com os recursos, confirmando o processo de diferenciação celular, conforme esperado (Gráfico 1).

Com relação à morfologia das células musculares também foi possível observar que os recursos terapêuticos utilizados não provocaram alterações evidentes, quando avaliados de maneira qualitativa por dois examinadores experientes de forma independente e cega. Como não existiram diferenças, apenas uma figura representativa de cada grupo experimental foi adicionada (Figura 1).

 

Discussão

Segundo Johns (20), a cultura celular é, por definição, um artefato; no entanto, permite que o investigador tenha um controle rigoroso sobre diversas variáveis do processo e possa fazer questionamentos de maneira mais sistemática. Portanto, estudos in vitro avaliando o potencial do US e laser de baixa potência são importantes complementos dos estudos in vivo, e podem trazer maiores conhecimentos de forma a permitir a utilização desse recurso de forma mais eficaz e segura.

A linhagem celular C2C12 foi utilizada neste estudo, pois essas células são um subclone da linhagem de mioblastos C2, isoladas de células satélites de ratos adultos (51), que apresentam a maioria das características dos mioblastos normais e são comumente usadas como modelo para estudar a proliferação e a diferenciação de células musculares. O uso de linhagens celulares como modelo para a análise da proliferação celular elimina a possibilidade de o US e o laser de baixa potência interferirem na produção de fatores de crescimento de células não miogênicas contidas em culturas primárias, como fibroblastos e macrófagos (49, 52).

O presente estudo avaliou os efeitos do US e LBP em células musculares após o processo de diferenciação celular com o intuito de acumular maior conhecimento acerca da utilização desses recursos para o reparo tecidual após lesões, distrofias e outras condições nas quais a proliferação de células musculares é requerida. Contudo, os resultados evidenciam que o US e o LBP não alteraram a proliferação das células musculares que permaneceram em meio de diferenciação por 96h. A comparação da proliferação celular nos períodos de 24h e 72h permitiu verificar que não houve aumento no número de células, o que comprova a eficiência do protocolo de diferenciação utilizado.

Contudo, estudos in vivo demonstram efeitos do US sobre o tecido muscular como verificado por Maddi et al. (30), que utilizaram o US pulsado em modelo experimental de lesão contusa em músculo gastrocnêmio de rato e encontraram um aumento na proliferação de células satélites. Além disso, em outros estudos verificaram que o tratamento com US melhora a extensibilidade muscular (42), a produção de força após lesão por contração (33) e pode aumentar a diferenciação das células musculares em modelo animal (37). Como o US acelera o processo de reparo em diversos estudos in vivo, é possível que esse efeito dependa da ação coordenada de diferentes tipos celulares presentes em tecidos adjacentes ao tecido muscular, como, por exemplo, o conjuntivo. Há a possibilidade de que o efeito do US e LBP no processo de reparo seja dependente da estimulação de outras células, que passariam a secretar fatores de crescimento envolvidos na proliferação e diferenciação das células musculares, em resposta aos recursos (53).

No entanto, outros autores que também utilizaram o modelo experimental animal foram igualmente incapazes de demonstrar aumento estatisticamente significativo na massa muscular ou na regeneração tecidual em lesões musculares tratadas com o US (40, 34). Essa controvérsia apoia a falta de evidência científica sobre a eficácia do US na reparação muscular (25, 32, 37).

Estudos in vitro demonstraram que os efeitos do US foram dependentes dos parâmetros utilizados e do tipo celular, sendo capazes de promover a proliferação de osteoblastos, fibroblastos (22, 26, 35, 36), células endoteliais (33) e condrócitos (37). No entanto, outros autores não demonstraram de forma significativa os efeitos aditivos do US sobre a proliferação de fibroblastos (54), de células provenientes de discos intervertebrais de bovinos (33), de células uroepiteliais (36) ou até mesmo relataram diminuição no número de fibroblastos (34) após o tratamento com US.

Da mesma forma, o efeito de bioestimulação do LBP depende da combinação de parâmetros como comprimento de onda, potência, intensidade e também do tipo celular a ser avaliado (39, 40, 42, 43, 46, 47).

Segundo Almeida-Lopes e Marques, (41, 42) o laser é capaz de influenciar a proliferação de fibroblastos, osteoblastos (43) e células epiteliais (44). Além disso, essa terapia também possui efeitos sobre o colágeno e a síntese de colágeno (45, 42). Mais recentemente, um estudo analisou os efeitos do laser de AsGaAL nos parâmetros de 830 nm (0,3 J/cm2), 685 nm (0,6 J/cm2) e 670 nm (1,2 J/cm2) sobre células precursoras miogênicas e concluiu que a taxa de proliferação celular induzida por essas irradiações foi de 84,3%, 70,6% e 56,8%, respectivamente (46).

O presente estudo permitiu concluir que o US e o LBP, nos parâmetros utilizados, não foram capazes de alterar a proliferação das células musculares, em processo de diferenciação, porém há necessidade da realização de estudos posteriores para o melhor entendimento de outros possíveis efeitos desses recursos sobre essas células como, por exemplo, a utilização desses recursos como meio de prevenção à lesão e posterior diferenciação, para o estabelecimento de protocolos adequados a serem utilizados para o reparo muscular e recuperação clínica em atletas e pacientes.

 

Agradecimento

Agradecemos à Fapesp (2010/09191-5), ao CNPq e à UNINOVE pelo apoio financeiro.

 

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Recebido: 23/11/2010
Aprovado: 16/06/2011