Efeito da concentração e temperatura de adição de trealose em diluentes para a congelação de sêmen ovino em palhetas

Effect of the concentration and addition temperature of trehalose in extenders on freezing ram semen in straws

EFEITO DA CONCENTRAÇÃO E TEMPERATURA DE ADIÇÃO DE TREALOSE EM DILUENTES PARA A CONGELAÇÃO DE SÊMEN OVINO EM PALHETAS¹

EFFECT OF THE CONCENTRATION AND ADDITION TEMPERATURE OF TREHALOSE IN EXTENDERS ON FREEZING RAM SEMEN IN STRAWS

Adilson Moura² João Carlos Deschamps³ José Carlos Ferrugem Moraes⁴

RESUMO

A trealose é um dissacarídio com potencial emprego como crioprotetor quando adicionada aos meios para congelamento de sêmen ovino. Este experimento foi realizado para verificar os efeitos da temperatura de adição (30°C e 4°C) e da concentração de trealose (2%, 4% e 6%) sobre o sêmen ovino congelado em palhetas, utilizando como base as formulações INRA e TRIS/FRUTOSE. Os efeitos estudados em ambos experimentos foram medidos através da avaliação da motilidade espermática (MOT) e da integridade de acrossomas (INTA) em diferentes momentos após o descongelamento (0h, 2h e 5h). Os presentes resultados não recomendam a inclusão da trealose visando incrementar a qualidade in vitro do sêmen ovino congelado em palhetas nas concentrações e diluentes testados, porém, sugerem maiores estudos quanto a sua toxidade e possíveis interações com outros constituintes dos diluentes já formulados para o congelamento de sêmen ovino.

Palavras-chave: congelação de sêmen, diluentes, trealose, ovinos

SUMMARY

This study was aimed to evaluate the possible effects of the addition of trehalose to extenders developed for freezing ram semen in straws. The effects of addition temperature (30°C and 4°C) and concentration of trehalose (2, 4 and 6%) on INRA and TRIS/FRUTOSE diluents was evaluated. Their effects were studied through motility rate and by acrosome integrity at different incubation times after thawing (0, 2 and 5h). The results do not recommend the inclusion of trehalose in these diluents. However, it would be interesting to learn more about toxicity and interactions between the components of the extenders and trehalose in ram sperm frozen in straws.

Key words: frozen semen, semen extenders, trehalose, sheep

INTRODUÇÃO

Nos últimos 50 anos houve a geração de um apreciável volume de conhecimento científico e desenvolvimento tecnológico sobre a congelação de sêmen ovino. Considerando aspectos relativos a embalagem, concentração, metodologia de uso e/ou via de inseminação e composição dos diluentes (EVANS & MAXWELL, 1987). A despeito do conhecimento acumulado há necessidade de maiores estudos nos aspectos mencionados anteriormente em função de taxas de prenhez obtidas pela inseminação com sêmen congelado via cervical não satisfatórias nem repetitivas e de que as taxas de prenhez pela inseminação intrauterina apresentam alta variabilidade (EVANS, 1991).

No que concerne a possibilidade de aprimorar os diluentes, a função e o metabolismo dos crioprotetores nos diluidores para congelação de sêmen ovino, ainda não estão adequadamente investigados (SANCHEZ-PARTIDA et al., 1992). A trealose é um dissacarídio encontrado nas espécies animais e vegetais capazes de manterem íntegras suas membranas em condições extremas de temperatura, envolvendo a perda de água (CROWE et al., 1987). Estes mesmos pesquisadores apresentaram evidências que a trealose pode contribuir na estabilização das membranas durante o processo de congelamento (CROWE et al., 1990).

A trealose foi utilizada como crioprotetor adicional no processo de congelação de embriões de camundongos (HONADEL & KILLIAN, 1988), refrigeração e congelação de sêmen suíno (REVELL & GLOSSOP, 1989; BORDIGNON, 1993) e de sêmen ovino em pelotes (OLIVEIRA & MORAES, 1991/ 1993).

O objetivo deste estudo é de investigar os efeitos da adição da trealose em diluidores desenvolvidos para a congelação de sêmen ovino em palhetas sobre a motilidade espermática e integridade acrossomática, após os procedimentos de congelação e descongelação.

MATERIAL E MÉTODOS

As amostras de sêmen foram obtidas com vagina artificial de três carneiros das raças Texel (2) e Corriedale (1). O sêmen até os procedimentos de diluição foi incubado a 30°C. Foram utilizadas amostras com motilidade progressiva superior a 70% na formação de "pools" para congelação, sempre contendo três ejaculados de pelo menos dois carneiros. A concentração espermática de cada "pool" foi estimada em câmara hematimétrica, sendo ajustada a uma concentração final de 100 milhões de espermatozóides por ml em todos os tratamentos.

Os diferentes "pools" sequencialmente foram diluídos e processados seguindo os protocolos descritos por COLAS (1975) e FISER et al. (1982), respectivamente, diluidores INRA e TRIS/FRUTOSE, sendo acondicionados em palhetas de 0,5ml.

A descongelação das palhetas foi em banho-maria a 37°C por 20 segundos. As avaliações procedidas foram: a motilidade espermática (MOT) em microscopia de contraste de fase logo após a descongelação, duas e cinco horas após; a integridade acrossomática (INTA) logo após a descongelação e após cinco horas de incubação a 37°C em microscopia de contraste de fase em amostras fixadas em formol salino tamponado (HANCOCK, 1957). Foram avaliadas três palhetas em cada tratamento e os valores de MOT e INTA em cada tempo de incubação após a descongelação submetidos a análise de variância (SNEDECOR & COCHRAN, 1967).

No delineamento experimental foram ajustados dois modelos estatísticos. No modelo 1 foram considerados além do tempo de incubação os efeitos principais da adição da trealose (g/100ml) em diferentes concentrações (0; 2; 4; 6%), a formulação original do diluente (INRA; TRIS/FRUTOSE), a repetição/bloco (1; 2; 3) em função do dia da congelação e as interações de primeira ordem significativas (P < 0,05) sobre a motilidade espermática e a integridade dos acrossomas. No modelo 2 foram incluídos os efeitos do tempo de incubação (0; 2; 5h), da quantidade de trealose (2; 4; 6%), da temperatura de sua adição ao diluente (4°C; 30°C), da fórmula do diluente (INRA; TRIS/FRUTOSE), da repetição/bloco (1; 2; 3) e das interações de primeira ordem significativas sobre ambas as variáveis medidas.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Na Tabela 1 são apresentados os quadrados médios e níveis de significância para os efeitos principais e interações, considerando o modelo 1. O alvo desta análise foi de verificar como se comportavam os dois diluidores testados com a adição de trealose. De um modo geral a adição de trealose não resultou em benefício para a motilidade espermática. Embora tenha sido verificada diferença (P<0,05), houve redução progressiva na motilidade a medida que aumentava a concentração de trealose. No que diz respeito a integridade acrossomática também não houve benefício com a adição de trealose nos dois diluentes. Os efeitos óbvios como o tempo de incubação e bloco foram significativos tanto para MOT quanto para INTA. Pode ser constatada diferença (P < 0,01) para MOT entre os diluidores, facilmente explicável pelos seus constituintes, com uma superioridade em tomo de 25% para o TRIS/FRUTOSE, que apresenta composição mais completa, incluindo tampões e diversos açucares (FISER et al., 1982).

As respostas diferenciais na motilidade espermática entre diluidores podem ser visualizadas mais adequadamente através das interações "diluente x adição/concentração" e "diluente x tempo de incubação" (Figuras 1 e 2). Estes resultados indicam que efetivamente a composição dos diluentes é um tema muito complexo, requerendo inúmeros experimentos fatoriais para sua formulação e não a simples adição de uma nova substâncias com propriedades crioprotetoras.

A despeito dos resultados negativos da adição da trealose nos diluentes testados, o objetivo do modelo 2 foi de verificar se a temperatura em que a trealose foi adicionada nas formulações com 2%, 4% e 6% afetaria a MOT e a INTA. Os resultados da análise da variância (Tabela 2) indicam que a temperatura de adição afeta significativamente a MOT, com uma superioridade em torno de 8% quando o dissacarídio foi adicionado na temperatura de 30°C. O efeito diferencial sobre a MOT em função do diluente é também importante apenas no diluidor INRA, também culminando com maior % de células móveis quando adicionada a 30°C. Um aspecto interessante é que tanto a MOT quanto a INTA são afetadas diferentemente pela temperatura de adição e concentração da trealose adicionada (Figura 3).

Os padrões de variação observados sugerem que a trealose em concentrações crescentes a partir de 2g/100ml pode ser detrimental tanto à motilidade espermática quanto a integridade acrossomática, porem depende do diluente a que foi adicionada. De um modo geral estes resultados são similares aos obtidos pela adição de trealose ate 0,3% ao diluidor BTS desenvolvido para o congelamento de sêmen suíno em macrotubos (BORDIGNON, 1993), porem contrastam com os de OLIVEIRA & MORAES (1991; 1993), que evidenciaram incremento na MOT com uma concentração de 0,2% de trealose adicionada ao sêmen ovino congelado em pelotes com o diluidor desenvolvido por SALAMON (1970).

Os presentes resultados não recomendam a inclusão da trealose visando incrementar a qualidade in vitro do sêmen ovino congelado em palhetas nas concentrações e diluentes testados, no entanto, sugerem maiores estudos quanto a um possível efeito tóxico da trealose e possíveis interações com outros constituintes dos diluentes já formulados para o congelamento de sêmen ovino.

²Médico Veterinário, MSc, Merck Sharp & Dohme, Rua Cristóvão Colombo, 3870. apto. 304, 90560-005, Porto Alegre, RS.

³Médico Veterinário. PhD, Professor Adjunto, Centro de Biotecnologia. Faculdade de Veterinária. UFPel. 96100-900. Pelotas. RS. Autor para correspondência.

⁴Médico Veterinário, Doutor, Pesquisador, Centro de Pesquisa de Pecuária dos Campos Sulbrasileiros. Embrapa, Caixa Postal 242, 96400-970, Bagé, RS.

Recebido para publicação em 23.08.94. Aprovado em 29.11.94

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• SNEDECOR, G.W., COCHRAN, W.G. Statistical Methods 6. ed., Ames: Iowa State Univ. Press, 1967, 593 p.

¹

Parte da Dissertação de Mestrado do primeiro autor, apresentada ao Curso de Pós-graduação em Sanidade Animal. Faculdade de Veterinária da Universidade Federal de Pelotas (UFPel).

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  19 Out 2009
• Data do Fascículo
  1995

Histórico

• Aceito
  29 Nov 1994
• Recebido
  23 Ago 1994