Determinação do modo de reprodução em capim-gordura (Melinis minutiflora Beauv.) por padrões enzimáticos

Detection of the mode of reproduction in molasses grass (Melinis minutiflora Beauv.) by enzyme patterns

DETERMINAÇÃO DO MODO DE REPRODUÇÃO EM CAPIM-GORDURA (Melinis minutiflora Beauv.) POR PADRÕES ENZIMÁTICOS¹

DETECTION OF THE MODE OF REPRODUCTION IN MOLASSES GRASS (Melinis minutiflora Beauv.) BY ENZYME PATTERNS

Lia Rejane Machado Silveira² Carlos Floriano de Moraes³

RESUMO

Com o objetivo de determinar o modo de reprodução do capim-gordura (Melinis minutiflora Beauv.), 24 ecótipos da coleção da Universidade Federal de Viçosa foram utilizados em cruzamentos, após emasculação massal por imersão da inflorescência em água quente, testando-se quatro faixas de temperatura. Analisaram-se, comparativamente, os padrões de isozimas dos progenitores e da descendência proveniente de panículas de polinização aberta e de panículas submetidas aos tratamentos de proteção; polinização e proteção; emasculação e proteção; e emasculação, polinização e proteção. A hipótese da apomixia ser o mecanismo reprodutivo operante no capim-gordura foi bastante favorecida pela extensiva uniformidade da progênie e semelhança isozimática com o progenitor feminino. Contribuiu para isso o fato de toda a população amostrada apresentar um padrão de bandas característico de heterozigotos para os sistemas enzimáticos leucina aminopeptidase e malato desidrogenase, uma vez que a apomixia, ao contrário da autofecundação, facilita a manutenção da heterozigosidade. Segregação isozimática entre plantas dos ecótipos CG4 e CG5, relativamente ao sistema fosfatase ácida, sugere, no entanto, a ocorrência de alguma porcentagem de fecundação cruzada, que foi confirmada pela detecção de hibridação entre os ecótipos CG2 e CG13 nas isoesterases. Esses resultados conduzem à conclusão de que um mecanismo facultativo (parcialmente sexual) de apomixia atua na reprodução do capim-gordura.

Palavras-chave: Capim-gordura, reprodução, padrões isozimáticos.

SUMMARY

Panicles of 24 molasses grass ecotypes were used in an experiment involving: bagging before anthesis; cross-pollination and bagging; emasculation and bagging; and emasculation, cross-pollination and bagging. Emasculation was accomplished by immersing the inflorescences into warm water, four temperature levels, for 12 minutes. The breeding system was accessed by comparing the isozyme patterns of the estereases, acid phosphatases, leucine aminopeptidases and malato dehydrogenases of the parental generations with their offsprings. The high uniformity of patterns obtained in the offsprings, the identical patterns found for both the female parents and their respectives progenies and also the presence of banding patterns, characteristically shown by heterozygotes of the leucine aminopeptidase and malato dehydrogenase systems, are strong evidences for the hypothesis of apomictic reproduction in this species. In addiction, the isozymatic segregation for acid phosphatase observed in plants of CG4 and CG5 ecotypes and the detection of hybrids from CG2 x CG3 crosses, are indicating that the apomixis in molasses grass is facultative.

Key words: molasses grass, reproduction, isozyme patterns.

INTRODUÇÃO

O capim-gordura (Melinis minutiflora Beauv.) é uma gramínea forrageira de relevante participação na pecuária dos estados do Brasil Central, como espécie naturalizada. A despeito disso, seu potencial genético ainda não foi explorado e o levantamento de informações básicas acerca da espécie pode ser considerado incipiente. Em particular, em relação ao comportamento reprodutivo, há considerável controvérsia na literatura pertinente. Alguns autores consideram o capim-gordura apomítico (BOGDAN, 1960; CROWDER & CHEDDA, 1982), caracterizando tal apomixia como obrigatória (BURTON, 1970) ou facultativa (BUMPUS, 1961). KENYA (1958) sustenta ser a espécie autógama e MARTINS & OLIVEIRA (1972), observando a baixa porcentagem de formação de sementes em plantas protegidas e em plantas isoladas, consideram-na alógama.

A determinação do modo de reprodução da maioria das espécies de gramíneas tem-se baseado nos resultados comparativos de formação de sementes em inflorescências protegidas, isoladas e de polinização aberta (BOGDAN, 1959). Um procedimento alternativo para detectar e estimar a apomixia/sexualidade em populações vegetais baseia-se nos padrões de segregação de locos marcadores em testes de progênies, mais especificamente de marcadores isozimáticos (MARSHALL & BROWN, 1974). Isso foi efetuado com a descendência de plantas típicas e variantes de Panicum maximum Jacq. (SMITH, 1972), na progênie S₁ de plantas de uma linha de sorgo sob suspeita de ser apomítica (MARSHALL & DOWNES, 1977) e para descrever e quantificar a variabilidade resultante de reprodução sexual ou mistura clonal em quatro cultivares de capim chorão - Eragrostis curvula. (Schrad.) Nees (DI RENZO et al., 1990). Como prova final de sexualidade, nas introduções de Panicum maximum Jacq., SMITH (1972) considerou a transferência dos marcadores genéticos isozimáticos à progênie por fecundação cruzada.

Também há referências da utilização de padrões isozimáticos na confirmação de hibridações dirigidas em várias espécies, como, por exemplo, em Brassicoraphanus (KATO & TOKUMASU, 1979), em triticale (CHEN & BUSHUK, 1970), em Festucalolium (EMOTO, 1988). As bandas isozimáticas dos híbridos são referidas como um resumo das bandas derivadas dos progenitores, algumas das quais estão ausentes, em adição ao aparecimento de outras bandas novas.

Em hibridações dirigidas é conveniente proceder-se à emasculação de flores hermafroditas. Para contornar as dificuldades de emascular flores de reduzido tamanho, STEPHENS & QUINBY (1933) propuseram uma técnica massal que utiliza imersão em água quente. Essa técnica, desenvolvida para panículas de sorgo, foi, subsequentemente, adaptada para várias outras gramíneas. As partes masculina e feminina da flor apresentam sensibilidade diferencial, o androceu sendo ligeiramente mais sensível ao calor. Em sorgo, essa diferença parece ser de l °C, ou menos, e água, a 48 °C, por l0min, destrói a viabilidade do pólen (QUINBY & MARTIN, 1954). JODON (1938) testou temperaturas de 0-50°C em flores de arroz, em períodos que variaram de 2-25min, observando que tratamentos de 10 min, a 40-44°C, destruíram a viabilidade do pólen sem injuriar outros órgãos florais.

O sucesso da emasculação pode ser determinado, de acordo com STEPHENS & QUINBY (1933), pela polinização das flores tratadas com pólen que possua algum tipo de marcador e analisando a progênie.

Em capim-gordura, os padrões de segregação de esterase, fosfatase ácida e peroxidase permitiram a separação de 24 ecótipos e a estimação de índices de similaridade entre pares de ecótipos (PEREIRA, 1986). No presente trabalho, cujo objetivo foi determinar o modo de reprodução do capim-gordura, foram selecionados os ecótipos mais dessemelhantes, sendo efetuada a análise isozimática comparativa dos progenitores e da sua descendência.

MATERIAIS E MÉTODOS

Vinte e quatro ecótipos de capim-gordura foram utilizados, nas florações de 1987, 1988 e 1989, em Viçosa-MG, em estudos envolvendo emasculação, cruzamentos e análises isozimáticas. Foram selecionados ecótipos com padrões de esterase, fosfatase ácida e peroxidase mais contrastantes, isto é, aqueles pares com índices de similaridade (IS) igual ou inferior a 60 estimados por PEREIRA (1986).

As panículas dos progenitores femininos foram submetidas aos seguintes tratamentos: a) polinização aberta; b) proteção com saco plástico incolor em panículas no campo e com saco de papel em plantas mantidas em casa de vegetação, da pré-antese até a colheita; c) polinização recíproca e proteção; d) emasculação com água quente, em quatro faixas de temperatura (40-42°C, 42-44°C, 44-46°C e 46-48 °C), por 12 min, e proteção; e e) emasculação, nas quatro faixas de temperatura citadas, por 12min, polinização recíproca e proteção.

Foram utilizadas três a seis plantas por ecótipo, sendo que, no mínimo, uma panícula de cada ecótipo foi submetida a cada tratamento. Foram utilizadas panículas que já tinham exposto cerca de 2/3 de suas flores, eliminando-se aquelas em antese, na extremidade apical da inflorescência. Na emasculação, as inflorescências permaneciam, por 12min, em recipientes contendo água, mantida dentro da faixa de temperatura considerada. A polinização foi realizada tão logo a maior parte das flores se abriam, naturalmente, ou naquelas tratadas, após o estímulo proporcionado pela temperatura.

Após a colheita, as panículas foram deixadas secar à sombra e armazenadas em sacos de papel em condições ambientais. As sementes obtidas germinaram em areia esterilizada ou em germinador de umidade constante (100% UR) e temperaturas alternadas de 20/30°C por 16 e 8h, respectivamente, na presença de luz, pelo período de duas semanas, sendo as plântulas de dois-três dias de idade transferidas para a areia.

Plantas com cerca de um mês de idade foram colocadas em copos plásticos de 300cc, contendo areia e material orgânico na proporção de 2:1, permanecendo em casa de vegetação. Com aproximadamente 60 dias, todas as plantas obtidas tiveram amostras de raiz e de folha submetidas à eletroforese horizontal em gel de amido. Os tecidos macerados forneceram um extrato bruto que foi absorvido em papel filtro Whatman (0,4 x 0,1 cm).

Os géis de amido foram preparados a 12%, com 42g de amido de milho (maizena) adicionados a 350ml da solução tampão. O tempo de cozimento requerido foi de 4min. As migrações eletroforéticas foram conduzidas em câmara fria, com temperatura aproximada de 4°C. A diferença de potencial foi mantida ao redor de 10V/cm e a migração, interrompida quando a frente formada pelos tampões e pelo corante anilina atingiu a distância de 8cm a partir da origem.

Para os sistemas isozimáticos fosfatase ácida e malato desidrogenase utilizou-se o sistema-tampão contínuo tris - ácido cítrico, proposto por SHAW & PRASAD (1970). O tampão borato (SHAW & PRASAD, 1970), foi utilizado no preparo do gel e nas cubas dos eletrodos para a análise dos sistemas isozimáticos esterase e leucina aminopeptidase.

A eletroforese foi conduzida por 30min a 150V, após o que os papelotes embebidos com as amostras foram removidos e a voltagem, ajustada para 300V, assim permanecendo até que a migração atingisse 8cm.

Os sistemas isozimáticos fosfatase ácida e malato desidrogenase foram estudados, simultaneamente, na mesma corrida. O gel foi cortado, horizontalmente, três vezes, obtendo-se quatro fatias. A primeira fatia, que em geral não apresenta boa resolução, foi descartada; a segunda foi corada para revelar a atividade das bandas de fosfatase ácida e a quarta, as de malato desidrogenase.

Em outro gel, foi analisada, conjuntamente, a atividade dos sistemas isozimáticos esterase e leucina aminopeptidase. Da mesma forma, terminada a corrida, a segunda fatia foi destinada à revelação das bandas de leucina aminopeptidase, e a terceira, às esterases.

As bandas de esterase e de leucina aminopeptidase foram reveladas utilizando-se o sistema de coloração proposto por SOLTIS et al. (1983); as bandas de fosfatase ácida, com o uso de solução corante recomendada por BREWBAKER et al. (1960) e modificada por HILDEBRAND et al. (1980). As isozimas de malato desidrogenase foram reveladas utilizando-se o método de coloração indicado por SHAW & PRASAD (1970). Após a adição da solução corante efetuou-se a incubação em estufa, a aproximadamente 37°C, por 1h.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Em geral, a descendência de panículas protegidas apresentou um padrão de bandas idêntico ao da progênie de panículas de polinização aberta, indicando que o capim-gordura reproduz-se por auto-fecundação ou por apomixia. A predominante uniformidade isozimática da descendência de panículas submetidas a ambos os tratamentos reforça, entretanto, a hipótese de apomixia. PEREIRA (1986), analisando os mesmos ecótipos, também não encontrou variação isozimática entre plantas do mesmo ecótipo, apenas entre ecótipos diferentes, enquadrando cada um em somente um padrão de isozimas. Em Panicum maximum Jacq., SMITH (1972) investigou a variabilidade de progênies segregantes e apomíticas por meio de esterases e de peroxidases, registrando uniformidade qualitativa em todas as linhas apomíticas e amplas diferenças isozimáticas nas progênies segregantes, como se espera encontrar na descendência de plantas sexuais.

Quando a emasculação é bem sucedida, espera-se, em espécies sexuadas, que flores emasculadas e protegidas de outras fontes de pólen não formem sementes ou o façam em taxas reduzidas. No experimento conduzido, observou-se um grande decréscimo na formação de sementes em panículas submetidas à tratamento térmico relativamente à formação em panículas de polinização aberta, 31,61% versus 5,18% considerando a média dos ecótipos (dados não apresentados). A possibilidade de ocorrência de apomixia na espécie não permite que se afirme, contudo, que a emasculação térmica foi eficiente em destruir a viabilidade do pólen de capim-gordura, uma vez que, nessa condição, a formação de sementes pode prescindir do gameta masculino. A redução observada pode ser creditada, alternativamente, ao uso de sacos de proteção, que criam um ambiente desfavorável ao florescimento e à formação de sementes (BOGDAN, 1959), ou a injúrias provocadas pela temperatura em toda a estrutura floral.

Da mesma forma que a descendência de panículas protegidas, a de panículas emasculadas e protegidas repetiu o padrão de isozimas da progênie oriunda de panículas de polinização aberta do mesmo ecótipo, apresentando-se igualmente uniforme e ratificando a hipótese de um mecanismo apomítico de reprodução para a espécie.

A maioria das polinizações efetuadas sem anterior emasculação também resultou em progênie uniforme entre si e idêntica isozimaticamente ao progenitor feminino. Esse fato pode ser observado na Figura 1, relativa a isoesterases ativas nas raízes dos ecótipos CG9, CG 21 e CG22. Acredita-se que a hibridação, provavelmente, implicaria na transferência da banda anódica de migração mais rápida (região A) do progenitor masculino para a progênie. Em centeio (Secale cereale L.), híbridos entre linhas de grupos isozimáticos diferentes apresentaram bandas duplas representativas de ambos os progenitores (SADOWSKY et al., 1988). WU & QI (1980) identificaram híbridos entre Saccharum arundinaceum e S. qfficinarum, por apresentarem padrões eletroforéticos intermediários entre os dos progenitores, e clones, pela semelhança com o progenitor feminino.

Essa transferência de marcador isozimático do progenitor masculino para um descendente pode ser visualizada na Figura 2. Da polinização do ecótipo CG2 pelo CG13 resultaram dois indivíduos, um deles de fenótipo isozimátíco idêntico ao do progenitor feminino e o outro com o somatório do padrão de bandas da geração parental (região C). Das centenas de polinizações efetuadas, essa foi a única hibridação detectada, o que leva a supor, dada a uniformidade das progênies e a semelhança com o progenitor feminino no padrão de isozimas, a existência de reprodução apomítica na espécie. A ocorrência de uma planta segregante, no entanto, sugere uma apomixia tipo facultativa (parcialmente sexual), com taxa reduzida de fecundações cruzadas.

A descendência do cruzamento CG4 x CG13 apresentou dois genótipos de fosfatase ácida em amostras de raiz, um deles idêntico ao do progenitor feminino e o outro diferente de ambos os pais, conforme pode-se observar na Figura 3. Em outro ecótipo, o CG5, registrou-se a atividade da banda 1 e a ausência da banda 3, situação inversa à verificada por PEREIRA (1986). A variabilidade encontrada dentro desses ecótipos permite, portanto, seu enquadramento em mais de um grupo de padrões isozimáticos.

Essas diferenças nos padrões isozimáticos entre plantas do mesmo ecótipo podem ser resultantes de fecundação cruzada, constituindo, assim, evidências a serem acrescentadas à hipótese de um mecanismo facultativo de apomixia em capim-gordura, ou de modificações na estrutura primária, secundária ou terciária da proteína. Mutações ou mudanças conformacionais da proteína não implicam, porém, necessariamente, em efeitos fenotípicos detectáveis e plantas isozimaticamente diferentes podem apresentar-se morfologicamente semelhantes.

Progênies provenientes de inflorescências emasculadas e, subsequentemente, polinizadas e protegidas também repetiram o padrão de bandas do progenitor feminino e apresentaram-se isozimaticamente uniformes.

Em relação às isozimas de leucina aminopeptidase, não se verificou variação, qualitativa ou quantitativa, entre os ecótipos analisados, a exemplo do descrito por PEREIRA (1986.). Atividade mais frequente e visível foi obtida em raiz, com duas bandas anódicas de mobilidades relativas de l,0 e 0,7, respectivamente, presentes em todos os ecótipos.

Um padrão de duas bandas é típico de organismos heterozigotos para genes que codificam enzimas formadas por uma cadeia polipeptídica, como é o caso da leucina aminopeptidase (PASTEUR et al., 1988). Se a população amostrada for, de fato, constituída por heterozigotos, essa é mais uma evidência a ser adicionada à hipótese de existência de reprodução apomítica na espécie, uma vez que, em contraste à auto-fecundação, a apomixia facilita a manutenção da heterozigosidade e do vigor híbrido resultante (DOBZHANSKY, 1970).

À semelhança do sistema anterior, não se observou variação nas isozimas de malato desidrogenase entre os ecótipos de capim-gordura. Em raiz, observam-se, na maioria dos casos, três bandas com mobilidades relativas de 1,0; 0,93; e 0,87 respectivamente. Em folha, verifica-se a atividade de quatro bandas com mobilidades relativas de 1,0; 0,93; 0,9; e 0,86 respectivamente.

Para esse sistema enzimático, o tipo heterozigoto, constituído por alelos que codificam duas cadeias polipeptídicas, que se associam ao acaso, formando três tipos de moléculas (dois homodímeros e um heterodímero, a molécula híbrida) é muito comum. Se a enzima funcional é um dímero, após a eletroforese são reveladas três bandas regularmente distanciadas (PASTEUR et al., 1988), como as que se observam em amostras de raiz.

A análise genética dos zimogramas de malato desidrogenase conduz, portanto, às mesmas inferências de propagação por apomixia do capim-gordura, tecidas em relação ao sistema anterior.

CONCLUSÃO

Os resultados obtidos permitem concluir que o capim-gordura se reproduz por apomixia facultativa (parcialmente sexual), com taxa reduzida de fecundação cruzada.

²Engenheiro Agrônomo, M.Sc, Professora do Departamento de Fitotecnia, Universidade Federal de Santa Maria, 97119-900, Santa Maria, RS. Autor para correspondência.

³Engenheiro Agrônomo, Ph.D, Professor do Departamento de Fitotecnia, Universidade Federal de Viçosa, 36570-000 - Viçosa, MG.

Recebido para publicação em 10.05.95. Aprovado em 04.10.95

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¹

Parte da tese apresentada pelo primeiro autor à Universidade Federal de Viçosa para obtenção do titulo de mestre em genética e melhoramento.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  29 Set 2008
• Data do Fascículo
  Abr 1996

Histórico

• Aceito
  04 Out 1995
• Recebido
  10 Maio 1995