Renovação parcial do meio de cultura como perspectiva de aumentar a eficiência de um sistema de cocultoura de embriões sem fluxo contínuo de CO2

Partial replacement of the culture medium in order to enhance a embryos coculture system without continuous CO2 flow

RENOVAÇÃO PARCIAL DO MEIO DE CULTURA COMO PERSPECTIVA DE AUMENTAR A EFICIÊNCIA DE UM SISTEMA DE COCULTURA DE EMBRIÕES SEM FLUXO CONTÍNUO DE CO₂

PARTIAL REPLACEMENT OF THE CULTURE MEDIUM IN ORDER TO ENHANCE A EMBRYOS COCULTURE SYSTEM WITHOUT CONTINUOUS CO₂ FLOW

Marcos Antonio Lemos Oliveira¹ Maria Madalena Pessoa Guerra² Benjamin Gaylord Brackett³

RESUMO

Substituindo-se parcialmente (30%) os meios de cultura TC M 199/NaHCO₃ (199/NaHCO₃) e TC M 199/25mM HEPES (199/HEPES) a intervalos de 24, 48 ou 72 horas, testou-se a possibilidade de incrementar a obtenção de blastocistos expandidos (BLE) a partir de embriões Mus musculus no estádio de duas células incubados sem fluxo contínuo de CO₂. Após distribuição aleatória dos embriões em tubos de ensaio contendo 2ml de meio de cultura e monocamada celular de oviduto bovino, os referidos tubos foram hermeticamente fechados e colocados em estufa bacteriológica a 37°C durante 96 horas. A renovação do meio de cultura em qualquer período não incrementou a porcentagem de embriões que alcançou o estádio de BLE, todavia, o número total de BLE obtido com o 199/HEPES (79,0%) foi superior (P £ 0,01) ao verificado com o 199/NaHCO₃ (65,0%).

Palavras-chave: cocultura, meio de cultura, embrião.

SUMMARY

It has been evaluated, in a coculture system without continuous CO₂ flow, the possibility to enhance the percentage of blastocists obtained from two cells mouse embryos by partial (30%) replacement (each 24, 48 and 72 hours of intervals) of two culture media (TCM 199/NaHCO₃ and TCM 199/25 mM HEPES). The embryos, randomiy allocated in closed cultures tubes with 2 ml of medium and bovine oviduct monolayer, were maintained at 37°C during 96 hours. No diferences between spreaded blastocists were verifica when the media were replaced at ali intervals, however, the medium TCM 199/25mM HEPES was significantiy more effective (P £ 0.01) then TCM 199/NaHCO₃.

Key words: coculture, culture medium, embryo.

INTRODUÇÃO

A fecundação in vitro, por ser uma técnica com potencial de fornecer um número de estruturas, tanto para estudos quanto para fins comerciais, consideravelmente maior do que simples programas de superovulação, é responsável por substânciais avanços nas pesquisas sobre produção de clones, produção de animais transgênicos e determinação prévia do sexo. Entretanto, a viabilização desse tipo de tecnologia depende fundamentalmente de um sistema de cocultura eficiente que simule um ambiente atmosférico compatível com o materno para favorecer o processo de clivagem sem prejuízo da qualidade embrionária.

Por conter a maioria das substâncias nutritivas indispensáveis ao desenvolvimento in vitro de embriões mamíferos, diversos meios de cultura vêm sendo testados para atender às exigências metabólicas do embrião em todas as etapas de seu desenvolvimento (BRACKETT et al., 1989; PEREIRA, 1991; GUERRA et al., 1992; OLIVEIRA et al., 1992c). Apesar da renovação parcial do meio ser uma prática de rotina em alguns laboratórios onde é controlado o nível de CO₂ (BRACKETT et al., 1989; OLIVEIRA et al., 1991ab; YOUNIS et al., 1991), em outros, nos quais o ambiente atmosférico da cocultura é resultante do próprio metabolismo celular (PEREIRA, 1991; RIBEIRO, 1991; GUERRA, 1992; GUERRA et al., 1992; OLIVEIRA et al., 1992a), essa metodologia, exceção feita aos trabalhos de GUERRA et al. (1992) e OLIVEIRA et al. (1992b), vem sendo empregada sem renovação do meio de cultura.

Este trabalho, por fazer parte de uma linha de pesquisa que objetiva minimizar a problemática da cocultura de embriões através de um sistema sem adição externa de CO₂ para viabilizar sua utilização a nível de campo, foi conduzido com a finalidade de incrementar a obtenção de blastocistos expandidos da espécie Mus musculus através da substituição parcial de dois meios de cultura TCM 199/NaHCO₃ (199/NaHCO₃) e TCM 199/25 mM HEPES (199/HEPES) a intervalos de 24, 48 ou 72 horas, utilizando-se as células de oviduto bovino como a monocamada celular.

MATERIAIS E MÉTODOS

Utilizaram-se 502 embriões Mus musculus no estádio de duas células, os quais após seleção e classificação, conforme caracteres morfológicos sugeridos por STRINGFELLOW et al. (1987), foram aleatoriamente distribuídos em seis grupos experimentais com seis replicações (cada período de substituição foi constituído por dois grupos representados pelos meios de cultura). Os tubos de ensaio, contendo 2ml de meio de cultura, monocamada celular e máximo de dez embriões, foram hermeticamente fechados e colocados em estufa bacteriológica^aa 37° C durante 96 horas, período em que, diariamente, eram efetuadas as avaliações de desenvolvimento e qualidade embrionária, assim como a substituição de 30% do meio de cultura a cada 24,48 ou 72 horas.

A monocamada de células de oviduto bovino foi preparada modificando-se a técnica empregada por SOTO-BELLOZO et al. (1976). Os ovidutos, assepticamente removidos em matadouro, foram transportados em um becker contendo 50ml de Tampão Fosfato Salino e, posteriormente, submetidos a sucessivas lavagens em placas de Petri contendo a referida solução. Após abertura longitudinal dos ovidutos, procedeu-se a raspagem das células epiteliais, as quais foram centrifugadas três vezes a 100rpm durante 15 minutos. Após a eliminação do sobrenadante, as células foram mais uma vez suspensas no Meio Mínimo Essencial^b modificado contendo 10% de soro fetal bovino^c (SFB) e, posteriormente, semeadas em garrafas de cultivo em estufa bacteriológica a 37°C. No terceiro dia, substituiu-se o meio e novamente foram incubadas até que a monocamada celular atingisse 100% de confluência. No 14° dia, efetuou-se a primeira passagem com suspensão destas células através da tripsinização da monocamada e diluição de 1:3 acrescido de 10% de SFB. A preparação dos tubos de cultivo, realizada a partir da quarta passagem celular, foi efetuada colocando-se 1ml da suspensão e após vedação, próxima ao bico de Bunsen, os referidos tubos foram mantidos em estufa bacteriológica a 37°C. Esta preparação foi sempre realizada com 24 horas de antecedência da cocultura embrionária para permitir 100% de confluência da camada celular.

Os meios de cultura (Tabela 1) 199/NaHCO₃^d e 199/HEPES^d, com pH ajustado para 7,4, foram preparados conforme BRACKETT et al. (1989), ressaltando-se que foi modificada, de 10 para 20%, a porcentagem de suplementação do meio 199/NaHCO³.

Empregou-se o delineamento inteiramente casualisado, arranjo fatorial de acordo com SILVA & SILVA (1982), para a análise estatística dos dados. Os valores percentuais foram transformados em

onde y é a variável resposta e as médias foram comparadas pelo teste de Tukey utilizando-se o nível de l % de probabilidade.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os resultados deste trabalho encontram-se expressos na Tabela 2, através da qual pode-se inicialmente constatar que a substituição parcial do meio de cultura não favoreceu significativamente o desenvolvimento embrionário. Esperava-se que a renovação a cada 24 horas apresentasse o melhor desempenho em função da constante reposição de nutrientes indispensáveis ao metabolismo do embrião e, por sua vez, que a substituição do meio a intervalos de 48 horas fosse superior aquela de 72 horas, todavia, o número de estruturas que alcançou o estádio de blastocisto expandido foi similar para os três períodos. É provável que a renovação parcial do meio de cultura a intervalo de 24 horas, utilizada por BRACKETT et al. (1989), YOUNIS et al. (1989), OLIVEIRA et al. (1991ab) e YOUNIS et al. (1991), seja interessante para sistemas que permitem controlar o ambiente atmosférico da cocultura embrionária. Naqueles onde o CO₂ é proveniente do próprio metabolismo celular, a queda de seu nível, quando da abertura do tubo de ensaio para renovação do meio, por não ser facilmente recuperada, pode determinar modificações muito bruscas do pH do meio de cultura e dessa forma comprometer o desenvolvimento embrinário, o qual pode ser também comprometido devido a uma contaminação adquirida no momento da abertura do já referido tubo de ensaio.

Trabalhando com um sistema de cocultura semelhante ao desta pesquisa, GUERRA et al. (1992) registraram um número sigificativamente maior de embriões degenerados quando a substituição do meio 199/NaHCO₃ foi efetuada a intervalos de 24 horas. Este resultado não foi corroborado neste experimento em consequência de não se ter verificado diferença estatística entre os intervalos de substituição tanto no 199/NaHCO₃ quanto no 199/HEPES e mesmo que houvesse sido registrada diferença significativa entre os três períodos de substituição, o de 24 horas teria apresentado o menor índice de embriões degenerados. É possível que a diferença entre os dados deste trabalho e os constatados por GUERRA et al. (1992) seja em decorrência do tipo de monocamada celular utilizada, pois, enquanto nesta pesquisa elegeu-se a monocamada celular de origem primária, GUERRA et al. (1992) lançaram mão da monocamada celular de linhagem contínua (células "Madin and Darby bovine kidney" - MDBK), tipo de monocamada que BIGGERS et al. (1957) não recomendaram sua utilização na cocultura de embriões por sofrerem alterações químicas e morfológicas em sua estrutura e por não apresentarem especificidade celular. Em se tratando de embriões no estádio de duas células, eles estariam, in vivo, no oviduto e, conseqüentemente, devem ter sofrido, mesmo in vitro, benéfica influência das secreções da monocamada celular de oviduto que impediu ocorrer degeneração em um número extremamente elevado de embriões nos três intervalos de substituição do meio. Essa teoria da especificidade celular, apesar de não respaldada por PEREIRA (1991) e RIBEIRO (1991) que trabalharam com embriões em estádios bem mais avançados de desenvolvimento, foi previamente relatada por REXROAD JR. (1986), REXROAD JR. & POWELL (1988), GANDOLFI & MOOR (1987), REXROAD JR. (1989), WIEMER et al. (1989) e respaldada por OLIVEIRA et al. (1992a) quando constataram desempenho estatisticamente significativo da monocamada celular de origem primária em relação à de linhagem contínua e concluíram que em se tratando de embriões no estádio de duas células, é aconselhável que se utilize monocamada de células de oviduto em detrimento da monocamada de células MDBK.

Comparando o total de embriões que atingiu o estádio de blastocisto expandido em função do meio de cultura, observa-se que a porcentagem obtida com o 199/HEPES (79,0%) foi estatisticamente superior àquela registrada com o 199/NaHCO₃ (65,0%), achado que pode ter sido consequência do 199/HEPES possuir maior capacidade tampão do que o 199/NaHCO₃, pois, além de conter o bicarbonato de sódio em sua constituição, possui, adicionalmente, o HEPES que é uma substância com propriedade de tamponamento e, por isso mesmo, deve ter equilibrado o pH dentro de níveis desejáveis sem necessitar da adição externa de CO₂ conforme referiu-se KANE (1987). Na cocultura de embriões bovinos e de camundongos, BRACKETT et al. (1989) e GUERRA (1992) também registraram melhor desempenho do 199/HEPES.

O processo de seleção dos embriões com base nas características morfológicas, a utilização de água tridestilada/deionizada para preparação dos meios, a adição de proteína para minimizar a problemática da presença de substâncias tóxicas existentes no meio de cultura, o uso do substrato energético adequado para embriões em estádio inicial de desenvolvimento e o pH ajustado para um valor equivalente a 7,4, respectivamente, sugeridos por STRINGFELLOW et al. (1987), WHITTINGHAM (1971), PIKE & ALIKANI (1988), KAYE (1988) e BRACKETT et al. (1989) foram determinantes para que os resultados aqui obtidos, especialmente com o meio 199/HEPES, fossem considerados como bastante satisfatórios. Esse tipo de análise foi elaborada após se ter constatado que a porcentagem de embriões que atingiu o estádio de blastocisto expandido não foi expressivamente inferior aquela verificada por PEREIRA (1991) e PEREIRA et al (1991) queutilizaram estruturas em estádio mais avançado de desenvolvimento (oito células) e mostrou-se similar aos achados de GUERRA (1992), GUERRA et al. (1992) e OLIVEIRA et al. (1992b) que trabalharam com embriões em igual fase de desenvolvimento à utilizada neste trabalho.

Com base nos resultados estatísticos, conclui-se não existir necessidade de renovar parcialmente o meio de cultura antes do prazo de 72 horas de incubação em consequência de não incrementar de forma substancial a eficiência do sistema de cocultura de embriões sem fluxo contínuo de CO₂, todavia, recomenda-se a utilização do meio de cultura 199/HEPES pela sua eficiência em incrementar a porcentagem de desenvolvimento de embriões em fase de pré-implantação.

FONTES DE AQUISIÇÃO

a - Fabbe, Primar - Br.

b - Interlab/Flow - Br.

c - Cultilab - Br.

d - Sigma Chemical Co. - USA.

² Médico Veterinário, MsC, Professora Assistente, DMV, UFRPE. Médico Veterinário, MsC, Professora Assistente, DMV, UFRPE.

³ DVM, PhD, Professor, Department of Physiology and Pharmacology. College of Veterinary Medicine of the Georgia University, Athens, Georgia, 30602-7389, USA.

Recebido para publicação em 21.02.96. Aprovado em 15.05.96.

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¹

Médico Veterinário, MsC, Dr, Professor Adjunto, Departamento de Medicina Veterinária (DMV), Universidade Federal Rural de Pemanbuco (UFRPE), Av. D. Manoel de Medeiros s/n. Dois Irmãos, 52171-900 Recife, PE. Autor para correspondência.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  24 Set 2008
• Data do Fascículo
  Dez 1996

Histórico

• Aceito
  15 Maio 1996
• Recebido
  21 Fev 1996